CN113729009A - 一种宫颈细胞保存液及其制备方法和保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种宫颈细胞保存液及其制备方法和保存方法。该细胞保存液包括乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、二硫苏糖醇、茶皂素、水；宫颈细胞保存液的pH值为6.8～7.2。本发明保存液可以有效软化和分解样本中的粘液，检测背景清晰干净，细胞形态观察清楚。对红细胞和白细胞的裂解效果好，能够有效避免其对观察结果的干扰。样本保存液保存时间长、检测效果稳定。环保无毒，对目标细胞没有损害，且无需预处理步骤，配方简单，操作简便，保存成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种宫颈细胞保存液及其制备方法和保存方法。
背景技术
宫颈癌是中国女性第二大常见的恶性肿瘤，是目前唯一病因明确，可早期发现早期预防的癌症，因此对宫颈癌的早期筛查对预防宫颈癌有着重要意义。宫颈癌的的筛查国际上通常采用TCT+HPV联合筛查的模式，TCT是对细胞进行形态学的观察做出临床诊断，HPV是对细胞中核酸病毒类型进行检测，但无论使用哪种方法，均需要用细胞保存液对样本进行保存，通过细胞保存液对标本的保存处理可以完整的保存细胞原始形态和结构，才得到正确的诊断结果。
多数的细胞保存液常用高浓度的醇类、醛类，虽然能很好的固定细胞，但会使细胞固缩，导致制片效果不佳；而醇类、醛类浓度过低，无法长时间固定细胞，使细胞发生退化。多数的醇类和醛类都具有一定的毒性，对于从事相关行业的人员有一定的危害。另外某些醇类、醛类的加入对细胞内的DNA有较强的破坏性，不利于核酸提取，从而影响HPV的检测结果。
人体宫颈脱落细胞成分复杂，往往含油粘液、血液，一种好的细胞保存液需要对标本成分进行固定，又需要对无用成分消除，以减少对实验结果的影响。市场上的某些产品对样本的保存时间短，对血液和粘液的处理效果差，不能兼顾TCT和HPV两种检测方法，达不到临床的实际使用需求。
可见，现有的普通细胞保存液保护细胞的完整性与固定性比较差，细胞会发生固缩、溶解或膨胀，红细胞不能得到有效去除，制片后背景中粘液比较多，保存液成分不能够兼容TCT和HPV两种检测。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种宫颈细胞保存液及其制备方法和保存方法。该细胞保存液成分无毒环保，在宫颈脱落细胞学检查中可以有效处理血液、粘液等干扰成分，保存核酸物质不丢失，可兼顾TCT和HPV样本取材，适合长时间保存。能够较好地保存宫颈脱落细胞，保护细胞的完整性与固定性，避免细胞固缩、溶解和膨胀，分解红细胞，分散粘液，清除干扰成分，为后续制片染色提供良好的基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种宫颈细胞保存液，包括乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、二硫苏糖醇、茶皂素、水；宫颈细胞保存液的pH值为6.8～7.2。
本发明以乙醇、异丙醇、乙二醇为固定剂，丙三醇、苯氧乙醇作为防腐剂和固定剂，多种固定剂成分可以应对宫颈细胞样本中的复杂成分，能使细胞长时间保存不发生形态改变；乙二胺四乙酸二钠具有细胞抗凝作用，不易使细胞中的血液发生凝固；磷酸二氢钾、磷酸氢二钠起到pH值缓冲作用，二者相互配合使用，可有助于提高缓冲效果；氯化钠和氯化钾用于维持细胞正常渗透压，保持细胞不膨胀、不固缩，保持适宜的离子浓度也能够有效保持细胞的形态；二硫苏糖醇、茶皂素有助于细胞粘液、血液分散裂解，从而将宫颈细胞释放出来，最终收集到具有诊断意义的细胞。
本发明的宫颈细胞保存液中各个组分配比合理，能够快速固定细胞，稳定细胞的pH值，防止标本中血液凝结，及时裂解标本中的红细胞，溶解标本中粘液的粘蛋白，同时防腐杀菌，使标本可以长期保存，兼顾TCT和HPV检测同时取材，充分保留了有诊断意义的细胞成分，其制备过程工艺简单，操作难度低，原材料无毒环保，成本低廉，易于实现规模化生产。
本发明针对现有技术的不足，通过上述各成分的添加以及含量的限定，可以有效消除样本中的粘液、血液等杂质成分，可以使细胞维持稳定的渗透压和pH值环境，并长时间维持完成细胞形态，实现了常温下样本的保存，同时能够避免核酸物资丢失，实现了一次采样分别用于TCT和HPV两种检测的目的，为患者和医护人员带量方便。
作为优选，宫颈细胞保存液中各组分的浓度为：乙醇10～25vt％，异丙醇5～15vt％，乙二醇1～5vt％，丙三醇1～5vt％，苯氧乙醇0.5～2vt％，乙二胺四乙酸二钠0.5～5wt％，磷酸氢二钠0.5～2wt％，磷酸二氢钾0.5～2wt％，氯化钾0.1～0.3wt％，氯化钠0.3～1.2wt％、二硫苏糖醇0.1～0.3wt％、茶皂素0.1～0.3wt％，余量为水。
本发明还提供了该宫颈细胞保存液的制备方法，包括如下步骤：
①将部分配方量的水与氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠混合，在35～45℃下搅拌15～25min，得到溶液A；
②将A液与二硫苏糖醇、茶皂素混合，搅拌3～7min，得到溶液B；
③将乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇混合，搅拌5min，得到溶液C；
④将溶液B与溶液C混合，加水定容；
⑤调节混合溶液的pH至6.8～7.2。
在本发明提供的具体实施例中，步骤①中，在40℃下搅拌20min。
在本发明提供的具体实施例中，步骤②中，搅拌5min。
在本发明提供的具体实施例中，步骤③中，搅拌5min。
在本发明提供的具体实施例中，调节混合溶液的pH的试剂为氢氧化钠。
进一步的，乙醇的纯度为99.99％。
进一步的，水为纯化水。
本发明还提供了一种宫颈细胞的保存方法，采用上述宫颈细胞保存液保存宫颈细胞。
作为优选，保存的温度为40℃以下。
本发明提供了一种宫颈细胞保存液及其制备方法和保存方法。该细胞保存液包括乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、二硫苏糖醇、茶皂素、水；宫颈细胞保存液的pH值为6.8～7.2。与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：
①样本保存液可以有效软化和分解样本中的粘液，检测背景清晰干净，细胞形态观察清楚。
②对红细胞和白细胞的裂解效果好，能够有效避免其对观察结果的干扰。
③样本保存液保存时间长、检测效果稳定。制备好的细胞保存液可在对样本中保存至少30天。
④环保无毒，对目标细胞没有损害，且无需预处理步骤，配方简单，操作简便，保存成本较低。
附图说明
图1为经实施例1保存液保存后的细胞染色图片；
图2为经对比例1保存液(pH＝6.5)保存后的细胞染色图片；
图3为经实施例2保存液保存后的细胞染色图片；
图4为经对比例2保存液(pH＝7.5)保存后的细胞染色图片。
具体实施方式
本发明公开了一种宫颈细胞保存液及其制备方法和保存方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
液基细胞：简称TCT，是近年来推出的一种新的细胞学制片技术，是制片领域的重大革新。相比于传统涂片，液基细胞学通过保存液保存标本，再经过一系列前期技术处理，去掉标本中的杂质成分，制成镜下观察清晰的薄层，使阅片者更容易观察，其诊断准确性，敏感性比传统涂片明显提高，可以有效地采集及保存宫颈脱落细胞是宫颈癌筛查的关键技术。
细胞保存液：细胞保存液具有保持细胞形态、分散粘液、处理红细胞等功能。
人乳头瘤状病毒：简称HPV，HPV检测是对付人乳头瘤病毒的一种手段，病毒是一种DNA病毒，人类是HPV唯一的宿主。HPV进入机体皮肤粘膜后，主要潜伏于表皮内基底细胞间，一旦时机成熟它就会致病。
本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1～6
表1为实施例1-6所包含组成及其成分比例。制备方法如下：
①按表1各实施例称量纯化水，在纯化水中加入称量好的氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠，加热40℃搅拌20min，得到溶液A。
②向A液中加称量好的二硫苏糖醇、茶皂素搅拌5min，得到溶液B。
③将称量好的乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇混合搅拌5min，得到溶液C。
④将溶液B与溶液C混合，加水定容至1000mL。
⑤加氢氧化钠，使pH在6.8-7.2之间。
⑥制备环境为常温常压下进行。
pH值在6.8-7.2范围内，配方中钠盐和钾盐的离子浓度根据前期的渗透压实验已经确定成分比例，实施例1-3首先需要确定固定剂的比例，全部符合要求后通过实施例4-6进行对粘液、血液样本的考察试剂的比例。
表1实施例1-6
注：其中固体类成分为质量占比，液体类成分为体积占比。
表1各组成成分的区别在于，
实施例1中固定剂的成分为：乙醇10％、异丙醇15％、乙二醇5％。
实施例2中固定剂的成分为：乙醇20％、异丙醇10％、乙二醇3％。
实施例3中固定剂的成分为：乙醇25％、异丙醇5％、乙二醇1％。
实施例4中粘液、血液处理试剂成分为：二硫苏糖醇0.1％、茶皂素0.3％。
实施例5中粘液、血液处理试剂成分为：二硫苏糖醇0.2％、茶皂素0.2％。
实施例6中粘液、血液处理试剂成分为：二硫苏糖醇0.3％、茶皂素0.1％。
对比例1-6
按上述制备方法配制，表2为对比例1-6分别与对应的实施例1-6的组成成分相同(对比例1对应实施例1，对比例2对应实施例2....对比例6对应实施例6)下对比不同值下的实验结果，对比例表见表2。
表2对比例1-6
| 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | 对比例6 | |
| pH | 6.5 | 6.5 | 6.5 | 6.5 | 6.5 | 6.5 |
| pH | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 | 7.5 |
试验例保存效果对比
按照表1实施例1-6和表2对比例1-6的配方配制细胞保存液l升试剂，每瓶保存液灌装10mL，将待测样本放入装有细胞保存液的瓶中，保存在室温下30天后通过手工或自动制片染色机染色后观察染色。染色后的效果评价分为三个等级，评价指标如表3，评估结果见表4、表5，以实施例1、对比例1和实施例2、对比例2分别pH值为6.5和pH为7.5时为例列举染色后的细胞图片，见图1-图4。
表3评价指标
表4评价结果(对比例pH＝6.5)
| 实验方法 | 细胞量 | 形态及种类 | 白细胞数量 | 粘液情况 | 血液情况 |
| 实施例1 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例2 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例3 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例4 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例5 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例6 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 对比例1 | 优 | 一般 | 优 | 优 | 一般 |
| 对比例2 | 优 | 一般 | 优 | 优 | 一般 |
| 对比例3 | 优 | 一般 | 优 | 优 | 一般 |
| 对比例4 | 优 | 一般 | 优 | 优 | 一般 |
| 对比例5 | 优 | 一般 | 优 | 优 | 一般 |
| 对比例6 | 优 | 一般 | 优 | 优 | 一般 |
表5评价结果(对比例pH＝7.5)
| 实验方法 | 细胞量 | 形态及种类 | 白细胞数量 | 粘液情况 | 血液情况 |
| 实施例1 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例2 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例3 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例4 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例5 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 实施例6 | 优 | 优 | 优 | 优 | 优 |
| 对比例1 | 优 | 一般 | 一般 | 优 | 一般 |
| 对比例2 | 优 | 一般 | 一般 | 优 | 一般 |
| 对比例3 | 优 | 一般 | 一般 | 优 | 一般 |
| 对比例4 | 优 | 一般 | 一般 | 优 | 一般 |
| 对比例5 | 优 | 一般 | 一般 | 优 | 一般 |
| 对比例6 | 优 | 一般 | 一般 | 优 | 一般 |
结果分析：
由表4、表5、图1-图4的实验结果所示，样本在宫颈细胞保存液中存放7天后，采用实施例1-6的细胞保存效果明显好于对比例1-6，说明实施例1-6的配方明显好于对比例1-6，pH值在6.8-7.2范围内，细胞种类齐全、形态完整、细胞量符合要求、背景干净，无血细胞、粘液细胞、白细胞数量不影响诊断要求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种宫颈细胞保存液，其特征在于，包括乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、二硫苏糖醇、茶皂素、水；所述宫颈细胞保存液的pH值为6.8～7.2。
2.根据权利要求1所述的宫颈细胞保存液，其特征在于，所述宫颈细胞保存液中各组分的浓度为：乙醇10～25vt％，异丙醇5～15vt％，乙二醇1～5vt％，丙三醇1～5vt％，苯氧乙醇0.5～2vt％，乙二胺四乙酸二钠0.5～5wt％，磷酸氢二钠0.5～2wt％，磷酸二氢钾0.5～2wt％，氯化钾0.1～0.3wt％，氯化钠0.3～1.2wt％、二硫苏糖醇0.1～0.3wt％、茶皂素0.1～0.3wt％，余量为水。
3.权利要求1或2所述宫颈细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
①将部分配方量的水与氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠混合，在35～45℃下搅拌15～25min，得到溶液A；
②将A液与二硫苏糖醇、茶皂素混合，搅拌3～7min，得到溶液B；
③将乙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、苯氧乙醇混合，搅拌5min，得到溶液C；
④将溶液B与溶液C混合，加水定容；
⑤调节混合溶液的pH至6.8～7.2。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤①中，在40℃下搅拌20min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤②中，搅拌5min。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤③中，搅拌5min。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述调节混合溶液的pH的试剂为氢氧化钠。
8.一种宫颈细胞的保存方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述宫颈细胞保存液保存宫颈细胞。
9.根据权利要求8所述的保存方法，其特征在于，所述保存的温度为40℃以下。
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