CN103884549B

CN103884549B - 一种痰细胞处理液及其应用

Info

Publication number: CN103884549B
Application number: CN201410047744.9A
Authority: CN
Inventors: 田玉旺
Original assignee: General Hospital Of Beijing Military Command P L A
Current assignee: General Hospital Of Beijing Military Command P L A
Priority date: 2014-02-11
Filing date: 2014-02-11
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2034-02-11
Also published as: CN103884549A

Abstract

本发明公开了一种痰细胞处理液及其应用，所述痰细胞处理液包括A液和B液，所述A液主要由聚乙二醇-400和乙醇混合而成，所述A液中还浸泡有川贝和去皮黑豆颗粒，所述B液由以下重量份的组分制备而成：1，4-二巯基-2，3-丁二醇0.1-0.2份，氯化钠17-20份，磷酸氢二钠7-10份，磷酸二氢钠0.5-1.5份，麝香草酚0.5-1.5份，冰醋酸8-12份，蒸馏水1900-2000份，其中，所述A液和所述B液分开储存，使用时首先使用A液处理痰液标本，之后再使用B液处理痰液标本。使用本发明所述痰细胞处理液制片方法简单、制片质量高、检测效果好，成本低，可应用于大规模生产。

Description

一种痰细胞处理液及其应用

技术领域

本发明涉及药剂技术领域，特别涉及一种痰细胞处理液及其应用。

背景技术

肺癌是危害人类生命的常见恶性肿瘤之一，其发病率和病死率位居全球恶性肿瘤的首位。目前肺癌的诊断方法，主要依赖于X线、CT(计算机断层成像)等影像学诊断，因此只有在癌灶发展到一定体积后才能被发现。肺癌的早期发现就显得非常重要，确立并普及早期诊断的方法乃是当务之急。痰细胞学检查是目前早期发现肺癌的重要方法，该方法已问世100多年，但影响因素较多，国内外报道的阳性率差异均较大，制片方法和制片质量的不同是其主要的原因，传统的直接涂片法，细胞容易自溶变性，由于痰液中含有大量的粘液，涂片厚薄不均，使痰标本内细胞成分不易分离，细胞量减少，细胞易重叠，细胞结构欠佳，背景杂乱，阅片费时且由于大量粘液的存在，涂片背景不清晰，会影响细胞的观察，致使癌细胞检出率较低。另外，该法取材较局限，只能对少许痰液进行制片和诊断，而大部分标本被丢弃，个体差异较大，并且无法保存痰液标本。

为了提高痰细胞学的肺癌检出率和制片质量，最初国内外许多学者多采用各种蛋白分解酶如胰酶、糜蛋白酶等对痰标本进行前期处理，但酶能够切断肽键、破坏蛋白质或多肽，故现在很少使用。还有学者采用物理搅拌制片技术，该方法对细胞形态有一定影响。有人应用痰液沉渣石蜡包埋制成切片，其特点是可实现良好的组织结构，但制片时间长，并且不能消除粘液、炎细胞及红细胞的干扰。为了避免上述各种方法存在的缺点，近年来国内外兴起了一种液基细胞学制片技术，它是一种明显优于传统巴氏涂片的检查方法，现已广泛应用于妇科阴道及宫颈上皮内病变诊断与筛查和肺癌诊断中，所制涂片质量有明显改善，制出的薄片细胞结构显示清楚，涂片背景干净，对比性强，癌细胞检出率显著提高，但该法所用液基多为进口，价格较贵，制片过程繁琐，痰液溶解剂有时易使细胞变性，许多基层医院难以普及应用。

鉴于上述描述，亟待有一种痰标本的制片方法简单、制片质量高、检测效果好并且生产成本低的痰细胞处理液的出现。

发明内容

本发明目的在于提供一种痰细胞处理液及其应用。本发明所述痰细胞处理液成分都是日常实验室条件下容易获得的，并且价格比较低，配制方法简单。

为实现上述目的及一些其他目的，本发明所采取的技术方案为：

一种痰细胞处理液，其特征在于，所述痰细胞处理液包括A液和B液，

所述A液主要由体积比为1∶48-1∶50的质量百分比浓度为1-3％的聚乙二醇-400和质量百分比浓度为45-55％的乙醇混合而成，所述A液中还浸泡有川贝和去皮黑豆颗粒，其中，每L聚乙二醇和乙醇的混合液中含有川贝和去皮黑豆颗粒分别为80-90g和100-120g；

所述B液由以下重量份的组分制备而成：

其中，所述A液和所述B液分开储存，使用时首先使用A液处理痰液标本，之后再使用B液处理痰液标本。

优选的是，所述痰细胞处理液包括A液和B液，

所述A液主要由体积比为1∶49的质量百分比浓度为2％的聚乙二醇-400和质量百分比浓度为50％的乙醇混合而成，所述A液中还浸泡有川贝和去皮黑豆颗粒，其中，每L聚乙二醇和乙醇的混合液中含有川贝和去皮黑豆颗粒分别为90g和120g；

所述B液由以下重量份的组分制备而成：

一种痰液标本的制片方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、取1-3倍痰液标本体积的如权利要求1或2中所述A液与所述痰液标本在第一震荡反应器中混合，之后，在温度为20-30℃下震荡反应10-15min，获得一级处理液；

步骤二、将一级处理液倒入第二震荡反应器中，并加入1-3倍所述一级处理液体积的如权利要求1或2中的所述B液，之后，在温度为2-6℃下震荡反应10-15min，获得二级处理液；

步骤三、取出震荡反应后的所述二级处理液制作痰液标本涂片；

步骤四、将制作好的所述痰液标本涂片进行染色和封片。

优选的是，所述步骤一中取2倍痰液标本体积的所述A液与所述痰液标本混合进行震荡反应。

优选的是，所述步骤二中将一级处理液中加入2倍所述一级处理液体积的如权利要求1或2中的所述B液混合进行震荡反应。

优选的是，所述步骤二或步骤二中所述第一震荡反应器或所述第二震荡反应器为内壁密布有直径为小于1μm的孔的反应器。

优选的是，所述第一震荡反应器或所述第二震荡反应器为塑料或玻璃材质的一次性管状反应器。

优选的是，所述染色试剂为苏木素-伊红或巴氏染色。

痰粘液中水分占95％，大分子粘蛋白占2-3％，蛋白质占0.1-0.5％，粘液的化学结构式以一种蛋白质为主链，由二硫键交联结合到含糖的蛋白质侧链上，痰液中的粘多糖和细胞破碎时释放的DNA之间的交联作用是形成呼吸道粘液高粘弹性的主要原因。根据痰液标本的这种性质，本发明人经过多年的大量试验，研制了本发明所述痰细胞处理液(亦称为液基)。

痰细胞处理液主要作用原理是：痰细胞处理液中的粘液分解剂与痰液糖蛋白的S-S键发生反应，通过打破二硫键，破坏了二硫键与糖蛋白之间的连接，使痰液中的粘液成分溶解，降低了粘液的粘弹性，使痰细胞充分地游离出来，从而能明显提高痰细胞检出率。痰细胞处理液通过化学的方法对送检的痰液标本进行前期处理，而后采用先进的液基细胞学制片技术进行制片，使制片质量和痰检阳性率显著提高。本发明所述痰细胞处理液主要由细胞稳定剂乙醇、粘液分解剂1，4-二巯基-2，3-丁二醇及细胞保护剂聚乙二醇-400等一些成份构成，并且向本发明所述痰细胞处理液的A液中加入了川贝和黑豆的中药成分，使川贝和黑豆在乙醇的作用下溶出其中的祛痰成分，降低化学药品1，4-二巯基-2，3-丁二醇的使用量，从而可以温和的达到祛痰又保护细胞的作用，并且，川贝和黑豆采用颗粒状浸泡于乙醇中，不仅可以快速溶出有效成分，又不影响A液的透明度，不会影响到后期涂片的效果，提高涂片中细胞的检出率，降低肺癌细胞假阴性的诊断率。

本发明的有益效果是本发明所述痰细胞处理液经过多年临床应用，证实具有如下特点：

(1)所述痰细胞处理液的所述A液和所述B液分开保存，相比较与将所述A液和所述B液混合到一起保存时间延长，因为所述A液和所述B液如果混合为所述痰细胞处理液保存一段时间后，在所述痰细胞处理液的表面会出现霉菌等细菌，不利于保存，说明所述痰细胞处理液中乙醇成分含量比较低，又会有后期挥发的影响，导致乙醇不能长时间起到抑菌作用；

所述A液中主要是乙醇，容易挥发，与所述B液分开配制，可以缩短配制时间，尽量减少所述A液和所述B液中有效成分的减少，保证所述痰细胞处理液的品质。

(2)在使用痰细胞处理液进行痰液标本制片中首先使用所述A液对痰液标本进行处理，在温度为20-30℃下震荡反应10-15min，可以使用川贝中的贝母碱、去氢贝母碱、贝母醇和生物碱成分，以及黑豆中的祛痰成分在20-30℃的比较高的温度条件下，温和且快速的分解痰液中的糖蛋白成分，并保护细胞不被破坏，之后，再使用所述B液对一级处理液在比较低的温度下进行处理，B液中的粘液分解剂1，4-二巯基-2，3-丁二醇可以再次对残留的糖蛋白进行分解，使获得二级处理液中基本没有粘液残留，并且低温条件下处理，可以使痰液标本中的细胞保存时间更长，保存状态更好，使制片效果好，背景清晰；其中，在震荡反应过程中使用的第一震荡反应器和第二震荡反应器壁上的小孔可以允许分解的小分子糖和蛋白进入，而细胞不能进入，从而起到震荡反应过程中分离蛋白和细胞的作用，尽可能多的去除一级处理液和二级处理液中的杂质，保证涂片效果。

(3)所述痰细胞处理液制片方法有效地解决了传统直接涂片法中存在的许多弊端，如细胞丢失严重，粘液丝较多，制片质量不佳，细胞常相互重叠，或被炎细胞、血细胞覆盖而难以识别。涂片也会因固定不及时，致细胞干燥、退变，而影响诊断。而自制痰细胞处理液制片法变革了标本采集和处理方法，粘液丝溶解，涂片背景较干净，红细胞大多破坏消失，炎细胞明显减少，异常细胞清楚可见，不易漏诊。显微镜下观察具有良好的细胞学形态，细胞无扭曲、无损坏，细胞分布均匀，细胞图像清晰，层次分明，核膜、核仁及染色质等细微结构清晰可见，三维立体感好，不仅单个细胞维持着良好的形态，腺癌、小细胞癌等细胞间的粘合也保持着完整性，具有能观察到成群丛集的倾向，有利于筛选检查。由于制片质量好，从而缩短了阅片时间，明显提高了工作效率，有效提升了细胞病理学诊断价值。

(4)所述痰细胞处理液中的粘液分解剂1，4-二巯基-2，3-丁二醇具有很低的氧化-还原活性，基本不影响标本中的细胞形态，并且能够显著提高细胞涂片的质量。处理液中的聚乙二醇-400覆盖细胞表面，有助于保护细胞，保存其形态，添加乙醇主要作用是用于固定痰液中脱落细胞的形态，使细胞膜不致于破裂，防止细胞崩解，由于细胞固定及时，细胞形态保存完好，剩余标本可反复多次制作涂片，利于进行脱落细胞学诊断。同时乙醇还具有很好的杀菌、去除红细胞的作用，操作者可免除挑痰之烦，更有了安全防护保障。还可以完好的保存痰细胞中的抗原成分，便于各种肿瘤标记物的检测，本发明中所述痰细胞处理液中还添加了麝香草酚，从而起到祛痰、杀菌和防腐的作用，从而保证制作的涂片可以长时间保存和后期的观察。

(5)使用本发明所述痰细胞处理液检测痰液标本时，无需使用高速搅拌器即能简单地溶解粘液，从而大大地缩短了痰液标本的处理时间，并且使细胞形态保存完好。由于本研究通过中药和化学方法配合来溶解粘液，因此对细胞群集的破坏较小，更易于查找癌细胞，在判别组织类型时也是很有利的。

(6)采集的痰标本量大，基本全部制片，制出的涂片细胞多，不易漏诊，并不是针对几个细胞，而是对一次痰液全标本的综合诊断。

附图说明

图1为用传统直接涂片法制作的痰液标本的细胞检测涂片的显微照片。

图2为使用本发明所述痰细胞处理液制作的痰液标本的细胞检测涂片的显微照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1

所述A液主要由体积比为1∶48的质量百分比浓度为1％的聚乙二醇-400和质量百分比浓度为45％的乙醇混合而成，所述A液中还浸泡有川贝和去皮黑豆颗粒，其中，每L聚乙二醇和乙醇的混合液中含有川贝和去皮黑豆颗粒分别为80g和100g；

所述B液由以下重量份的组分制备而成：

实施例2

所述B液由以下重量份的组分制备而成：

实施例3

所述A液主要由体积比为1∶50的质量百分比浓度为3％的聚乙二醇-400和质量百分比浓度为55％的乙醇混合而成，所述A液中还浸泡有川贝和去皮黑豆颗粒，其中，每L聚乙二醇和乙醇的混合液中含有川贝和去皮黑豆颗粒分别为90g和110g；

所述B液由以下重量份的组分制备而成：

实施例4

所述A液由体积比为1∶50的质量百分比浓度为3％的聚乙二醇-400和质量百分比浓度为55％的乙醇混合而成，所述B液由以下重量份的组分制备而成：

按照上述实施例1-4所述痰细胞处理液配方配制成痰细胞处理液对相同的100例痰液标本进行痰液标本制片，观察并统计：

	肺鳞癌	肺腺癌	阳性率(％)
				实施例1	15	4	19％
实施例2	16	6	22％
				实施例3	15	5	20％
实施例4	11	3	14％

表1

从上表1中可得出实施例2中所述痰细胞处理液处理和制片效果比较好，癌细胞检出率比较高，假阴性率降低，而实施例4中所述痰细胞处理液处理和制片效果最差，明显低于实施例1-3，而实施例4中所述痰细胞处理液中没有添加川贝和黑豆成分，说明川贝和黑豆的添加不仅起到了分解粘液的效果，使涂片效果好，观察的视野清晰，提高了癌细胞的检出率，降低了假阴性出现的概率。

实施例5

使用上述实施例1-3所述痰细胞处理液配方配制成痰细胞处理液进行痰液标本制片并与传统直接涂片法比较：

传统直接涂片法：收集在塑料盒内送检的痰液，用眼科镊仔细挑取少许灰白色带血丝样病变的可疑痰标本，采用压片法制成涂片2张，每张直径1.8cm。待涂片微干后，用涂片固定液固定，行HE或巴氏染色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

本发明所述痰液标本的制片方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤三、取出震荡反应后的所述二级处理液制作涂片，具体方法为：

放入Shandon专用的制片盒中，同时在每个制片盒内各放一张载玻片，然后将制片盒放入ShandonCytospin4离心制片机内，2250r/min，离心5min，取出载玻片；

步骤四、将制作好的所述痰液标本涂片进行染色和封片，具体方法为待涂片微干后，用涂片固定液固定，行HE(苏木素-伊红)或巴氏染色，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

根据上述涂片制作步骤设置了三个实验组，实验组中制作涂片的方法除步骤一和步骤二中反应温度不一样外其他条件一致，其中步骤一分别设置为20℃、25℃和30℃，步骤二分别对应设置为2℃、4℃和6℃。检测结果发现实验组3效果比较最好，如图2所示，所述痰细胞处理液处理后制作的细胞涂片，镜下粘液丝溶解，背景较干净，细胞结构显示清晰，细胞数量明显增多，细胞分布薄层均匀分布，无重叠，容易辨认，阳性细胞不易漏诊。

传统涂片效果：

如图1所示，传统直接涂片中粘液丝较多，背景污秽，细胞结构显示不清晰，涂片厚薄不均，细胞易重叠，细胞需仔细寻找辨认。

实施例6

本发明人通过对300例痰标本经所述痰细胞处理液处理后，制作的细胞涂片中检测出癌细胞65例(包括肺鳞癌48例、肺腺癌17例)，阳性率为21.7％；而传统直接涂片法制作的涂片，仅有30例痰液中发现了癌细胞(包括肺鳞癌21例、肺腺癌9例)，其阳性率仅为10.0％。结果显示：经所述痰细胞处理液处理的痰标本采用液基细胞学制片技术，制出的痰细胞涂片肺癌检出率较传统直接涂片法显著提高。其中，传统直接涂片法的癌细胞检出率偏低，与其痰细胞学的制片质量及取材受限等因素有密切关系，所以痰细胞学制片质量的好坏至关重要，它是提高痰细胞学肺癌检出率的根本基础。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims

1.一种痰细胞处理液，其特征在于，所述痰细胞处理液包括A液和B液，

所述B液由以下重量份的组分制备而成：

1，4-二巯基-2，3-丁二醇0.1-0.2份，

氯化钠17-20份，

磷酸氢二钠7-10份，

磷酸二氢钠0.5-1.5份，

麝香草酚0.5-1.5份，

冰醋酸8-12份，

蒸馏水1900-2000份，

2.如权利要求1所述痰细胞处理液，其特征在于，所述痰细胞处理液包括A液和B液，

所述B液由以下重量份的组分制备而成：

1，4-二巯基-2，3-丁二醇0.1份，

氯化钠17份，

磷酸氢二钠7份，

磷酸二氢钠0.5份，

麝香草酚0.5份

冰醋酸10份

蒸馏水2000份，

3.一种痰液标本的制片方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤四、将制作好的所述痰液标本涂片进行染色和封片。

4.如权利要求3所述痰液标本的制片方法，其特征在于，所述步骤一中取2倍痰液标本体积的所述A液与所述痰液标本混合进行震荡反应。

5.如权利要求4所述痰液标本的制片方法，其特征在于，所述步骤二中将一级处理液中加入2倍所述一级处理液体积的如权利要求1或2中的所述B液混合进行震荡反应。

6.如权利要求5所述痰液标本的制片方法，其特征在于，所述步骤一或步骤二中所述第一震荡反应器或所述第二震荡反应器为内壁密布有直径为小于1μm的孔的反应器。

7.如权利要求6所述痰液标本的制片方法，其特征在于，所述第一震荡反应器或所述第二震荡反应器为塑料或玻璃材质的一次性管状反应器。

8.如权利要求7所述痰液标本的制片方法，其特征在于，所述染色试剂为苏木素-伊红或巴氏染色。