CN106047795B - 一种样本密度分离液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种样本密度分离液，以质量百分比计，所述样本密度分离液包含以下组分：甘油5%~10%；乙醇3%~5%；氯化钠3%~5%；双蒸水79.8%~88.9%；茶皂素0.1%~0.2%。该样本密度分离液能使有诊断意义的细胞自然更快沉降的同时减少红细胞沉降干扰，从而使镜检片具有更加清晰的镜检视野和良好的细胞染色对比度，可广泛适用于各种妇科及非妇科等脱落细胞学标本以及手动、半自动或全自动液基细胞制片过程。

Description

一种样本密度分离液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术中细胞分离领域，具体涉及一种样本密度分离液。

背景技术

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一，是妇女健康的主要杀手，其发病率仅次于乳腺癌，据数据统计，全球每年新发的宫颈癌病例大约在50万左右，其中80％发生在发展中国家，因此对宫颈癌早期筛查就尤为重要。

目前常用的宫颈癌早期筛查方法为液基细胞学检查法，它是采用液基薄层细胞检测系统检测宫颈细胞并进行细胞学分类诊断，它是目前国际上较先进的一种宫颈癌细胞学检查技术，与传统的宫颈刮片巴氏涂片检查相比明显提高了标本的满意度及宫颈异常细胞检出率。宫颈防癌细胞学检查对宫颈癌细胞的检出率为100％，同时能发现部分癌前病变，微生物感染如霉菌、滴虫、病毒、衣原体等。

传统的液基细胞学制片技术包括有膜式过滤法薄层制片技术(TCT)、自动离心沉降法制片技术(LCT)、离心甩片法制片技术以及利普手工离心涂片技术(LPT)，其中自动离心沉降法制片技术是将收集到的样品先全部保存在保存液后，再加入密度较大的样本密度分离液，利用密度梯度分离原理，使保存液与样本密度分离液分为上下两层，这样样品中细胞沉降达到两者交界处，只有病变的细胞(其核浆比变大导致比重变大)和自身比重较大的细胞如肿瘤细胞、上皮细胞及部分其他细胞能克服下层分离液阻力的而继续下降，再被用来收集制片。

而传统常用的样本密度分离液为Ficoll分离液，Ficoll分离液其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，简称聚蔗糖，但在向保存液中加入Ficoll分离液后，在保存液与样本密度分离液分层处的未被保存液完全裂解的红细胞会与聚蔗糖接触而凝集成串钱状而沉积于管底与下沉的具有诊断学意义的细胞(上皮细胞、肿瘤细胞)混合，影响后续制片后对样品的观察。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种样本密度分离液，使其在加入到细胞保存液后，能使有诊断意义的细胞更快自然沉降的同时减少红细胞沉降干扰。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种样本密度分离液，以质量百分比计，所述样本密度分离液包含以下组分：

甘油 5％～10％；

乙醇 3％～5％；

氯化钠 3％～5％；

双蒸水 79.8％～88.9％；

茶皂素 0.1％～0.2％。

采用上述方案，甘油是一种无色味甜澄明黏稠液体，在冻藏细胞时可作为细胞的保护剂，在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶会导致细胞内发生机械损伤引起细胞死亡，如向培养液加入甘油，可使冰点降低，低温中能减少冰晶的形成，故在低温下对细胞进行分离时，样本密度分离液混合体系中的甘油可使细胞冰点降低，维持细胞的正常形态，减少细胞死亡，同时甘油对细胞无毒，可作为细胞分离液的介质，经研究发现5％～10％的甘油在乙醇水溶液中能产生较好的密度梯度，且相比聚蔗糖，在相同密度下，粘度较小，可加快细胞沉降速度，同时不会使细胞特别是红细胞聚集成细胞团后沉淀，故能使样品中细胞根据自身密度自然沉降分层，这样就只有病变的细胞和自身比重较大的细胞才能下降至样本密度分离液底部；

同时上述分离液混合体系中含有氯化钠，氯化钠水溶液是一种电解质补充液。钠和氯是机体重要的电解质，主要存在于细胞外液，对维持正常的血液和细胞外液的容量和渗透压起着非常重要的作用。其中3％～5％的氯化钠溶液能使溶液具有较高的渗透压，可使样本中细胞失水而缩小，再结合混合体系中3％～5％的乙醇溶液中乙醇可提高细胞膜的通透性，故可增快细胞失水的速度，从而增大样本密度分离液中细胞的有效密度，确保在较短的制片时间内就能增大细胞的有效密度，加快细胞的自然下沉；茶皂素是由茶树种子中提取出来的一类醣甙化合物，是一种性能良好的天然表面活性剂，0.1％～0.2％的茶皂素与上述混合体系混合后对人的红细胞有破坏作用，使红细胞产生溶血现象，同时又不会破坏其它有核细胞，这样即使有红细胞下降至样本密度分离液中，也会因为混合体系茶皂素的存在而发生溶血反应，变成细胞碎片从而密度减轻不会下降至试管底部与有诊断意义的细胞混合；

同时混合体系中用到的双蒸水是重蒸水的一种，是将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏所得到的水，相比普通的蒸馏水具有更高的纯度，可彻底避免将杂菌及杂质引入混合体系中干扰细胞样本，从而最终通过样本密度分离液混合体系中各种组分的相互作用采集到足够多且没有红细胞杂质的具诊断意义的细胞。

作为优选，所述样本密度分离液中甘油的质量百分比为8.5％～10％。

采用上述方案，经研究发现，采用上述含量的甘油，可保证整个混合体系保证在最好的密度梯度，从而保证诊断病理学细胞能沉入到试管底部。

作为优选，所述样本密度分离液中乙醇的质量百分比为3％～4％，氯化钠的质量百分比为3.5％～4.5％。

采用上述方案，混合体系中3％～4％的乙醇水溶液可保证细胞膜的通透性增加到一个合理值的同时由于分离液中3.5％～4.5％氯化钠水溶液产生的较高渗透压而迅速失水，在达到一定失水量的同时保持细胞正常的形态，最大程度的增大细胞的有效密度，使诊有断意义细胞迅速下沉，减少制片时间。

作为优选，所述样本密度分离液中茶皂素的质量百分比为0.16％。

采用上述方案，经过反复试验，当上述体系中茶皂素的质量百分比为0.16％时可产生最好的红细胞破坏效果，能最大程度的使下降至样本密度分离液中的红细胞产生溶血现象。

本发明的另一个目的在于提供一种上述样本密度分离液的制备方法：

一种如上所述的样本密度分离液的制备方法，包含以下步骤：

(1)将配方量的乙醇、氯化钠、茶皂素和双蒸水混合，搅拌溶解，得到澄清溶液；

(2)在18℃-22℃下，将甘油加至步骤(1)得到的澄清溶液中，搅拌均匀，即得。

采用上述方案，可保证甘油均匀分布在乙醇水溶液中，同时上述温度可保证该分离液的密度和粘度稳定，不会影响最终对细胞的分离效果。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

通过将甘油溶解在乙醇水溶液后做为分离细胞的介质，可在保证样本密度分离液有较好密度梯度的同时减轻样本密度分离液的粘度，能有效加快诊断学意义的细胞的下沉速度，从而在相同的制片时间内收集到更多的诊断学意义的细胞；同时混合体系中的甘油不会使红细胞发生聚集沉淀，溶液中的茶皂素可确保即使有红细胞下降到了样本密度分离液中也会与其发生溶血反应而使细胞破碎，红细胞破碎成细胞碎片后无法继续下降，确保最终自然下沉到试管底部的细胞不含红细胞；此外混合体系中的乙醇提高了分离液中细胞的通透性，再结合混合体系中用于调节渗透压的氯化钠溶液可加快分离液中细胞失水速度，从而增大诊断学意义细胞的有效密度，使其在样本密度分离液中快速自然下降至试管底部。

故该样本密度分离液在使样本中的细胞根据自身重力自然沉降的过程中，能有效去除杂质，特别是红细胞的干扰，且相比Ficoll样本密度分离液在相同的制片时间内收集到更多的具有诊断学意义的细胞。

附图说明

图1为经过本发明的样本密度分离液处理的宫颈正常鳞状上皮细胞镜检照片；

图2为经过市售Ficoll样本密度分离液处理的宫颈正常鳞状上皮细胞镜检照片；

图3为经过本发明的样本密度分离液处理的宫颈病变区域细胞镜检照片；

图4为经过市售Ficoll样本密度分离液处理的宫颈病变区域细胞镜检照片。

以上镜检照片放大细胞倍数均为400倍。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1-4：一种样本密度分离液，其由如下方法制备得到：

(1)将配方量的乙醇、氯化钠、茶皂素和双蒸水混合，搅拌溶解，得到澄清溶液；

(2)在18℃-22℃下，将甘油加至步骤(1)得到的澄清溶液中，搅拌均匀，即得；

实施例1-4的各成分及其用量如表1所示。

表1实施例1-4的成分及其重量份数

实施例5：

试验对象：以本申请实施例3的一种样本密度分离液为试验样，以市售Ficoll样本密度分离液为对照样。

试验内容：采用常规的妇科检查方法，提取妇女宫颈移行带区脱落细胞并使用美国赛迪公司生产的保存液对样品进行保存后，分别使用试验对象加入到上述脱落细胞保存液中，利用CellTake 4800全自动液基细胞制片染色系统进行制片和镜检拍照。

试验结果：

经过本申请实施例3的样本密度分离液处理的宫颈正常鳞状上皮细胞镜检照片如图1所示；

经过市售Ficoll样本密度分离液处理的宫颈正常鳞状上皮细胞镜检照片如图2所示；

经过本申请实施例3的样本密度分离液处理的宫颈病变区域细胞镜检照片如图3所示；

经过市售Ficoll样本密度分离液处理的宫颈病变区域细胞镜检照片如图4。

由图中可看出，图2和图4中存在相当量的红细胞(红细胞即图中的A)，红细胞对有诊断学意义的细胞进行了遮挡，从而对样本的镜检观察产生了干扰，而图1和图3中几乎不存在红细胞的干扰；此外，在相同的分离温度和相同自然沉降时间内，图1和图3收集诊断学意义的细胞更多，细胞分布均匀且细胞染色对比度高。由此可知，经本申请实施例3的一种样本密度分离液处理后的样品的抗干扰红细胞减少、细胞染色对比度高、时收集诊断学意义的细胞更多，能够为疾病的诊断提供可靠的细胞镜检图片。

实施例6：

试验对象：以本申请实施例1-4的一种样本密度分离液为对照样。

试验内容：采用常规的妇科检查方法，提取正常妇女宫颈移行带区脱落细胞并使用美国赛迪公司生产的保存液对样品进行保存后，分别使用试验对象加入到上述脱落细胞保存液中，利用CellTake 4800全自动液基细胞制片染色系统进行制片和镜检拍照，其中实验温度和自然沉降时间相同。

试验结果：表2

实施例	镜检红细胞个数
		1	2
2	1
		3	0
4	0

由表2可知相比对比例1与对比例2，对比例3与对比例4中镜检红细胞个数为0，由此说明当茶皂素在上述体系中的质量百分比浓度为0.16％时，样本密度分离液能完全排除红细胞的干扰。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (5)

1.一种样本密度分离液，其特征在于，以质量百分比计，所述样本密度分离液由以下组分组成：

甘油 5%~10%；

乙醇 3%~5%；

氯化钠 3%~5%；

双蒸水 79.8%~88.9%；

茶皂素 0.1%~0.2%。

2.根据权利要求1所述的一种样本密度分离液，其特征在于：所述样本密度分离液中甘油的质量百分比为8.5%~10%。

3.根据权利要求1所述的一种样本密度分离液，其特征在于：所述样本密度分离液中乙醇的质量百分比为3%~4%，氯化钠的质量百分比为3.5%~4.5%。

4.根据权利要求1所述的一种样本密度分离液，其特征在于：所述样本密度分离液中茶皂素的质量百分比为0.16%。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的样本密度分离液的制备方法，其特征在于：所述制备方法包含以下步骤：

（1）将配方量的乙醇、氯化钠、茶皂素和双蒸水混合，搅拌溶解，得到澄清溶液；

（2）在18℃-22℃下，将甘油加至步骤（1）得到的澄清溶液中，搅拌均匀，即得。