CN113068683B - 一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及宫颈癌早期筛查的技术领域,具体公开了一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法。一种液基细胞检查用细胞保存液包括溶质和溶剂,溶剂包括磷酸缓冲盐溶液和细胞形态固定液,溶质包括黏液分解剂、红细胞裂解剂和可抑制CDK1/CyclinB1复合体活化的细胞核形态固定剂;其制备方法为:制备磷酸缓冲盐溶液,将磷酸缓冲盐溶液调节至弱碱性后与细胞形态固定液混合,最后加入黏液分解剂、红细胞裂解剂和细胞核形态固定剂进行混合。本申请公开的细胞保存液可用于LBC技术中的标本细胞的保存和处理,其具有维持细胞核形态结构的完整性并提高细胞核内物质的染色效果的优点。
Description
技术领域
本申请涉及宫颈癌早期筛查的技术领域,更具体地说,它涉及一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法。
背景技术
宫颈癌是临床妇科较为常见和多发的恶性肿瘤之一,也是导致妇女死亡率增加的重要疾病,其发病率仅次于乳腺癌,我国每年大约近3万人死于宫颈癌,且我国宫颈癌病死患者数量呈逐年上升趋势。可喜的是,宫颈癌是目前唯一病因明确的妇科恶性肿瘤,其与高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染相关,因此宫颈癌的发生和发展均需要一个渐进的演变过程,该演变过程的持续时间可从数年到数十年,这说明早期的宫颈癌的发生与进展是可以得到控制的。对于宫颈癌患者而言,早期筛查与防治具有十分重要的意义,其能有效阻挡宫颈癌的演变,实现预防或及早治疗宫颈癌的效果。
目前宫颈癌的早期筛查方法包括巴氏宫颈涂片法和液基细胞学(LBC)技术。巴氏宫颈涂片法是传统的细胞学技术,最早由希腊医师Papanicolaou在1941年提出,巴氏宫颈涂片法是一种操作方便、成本低廉的筛查方法,在过去的几十年时间内,巴氏理论及技术的应用大大降低了宫颈癌的发病率和死亡率。LBC技术开创了现代细胞学筛查技术的先河,其通过改进细胞取样和制片质量提高了宫颈病变的诊断准确性。由于巴氏宫颈涂片技术存在明显的假阴性率,随着现代社会的不断发展,人们对诊断准确性的要求的逐步提高,LBC技术已逐渐取代巴氏宫颈涂片技术成为首选的宫颈癌早筛方法。
然而目前LBC技术仍存在诸多问题,一个普遍存在的问题是:制得的涂片上的标本细胞进行染色后的染色效果较差,从而提高了诊断难度与对诊断人员的技术要求。参照图1和图2,目前采用LBC技术制得的涂片上的标本细胞中的细胞核在染色时的染色效果较差,导致染色后的细胞核的颜色相对均匀,细胞核内的染色质无法较清晰地进行展示,使得医师难以分辨病变细胞。
针对上述相关技术,发明人经过大量研究与实验进行验证后发现,保持细胞原有形态的完整性,特别是细胞核原有形态的完整性,是提高染色效果的关键因素。
发明内容
提供以下描述以帮助本领域技术人员理解本发明。
细胞核是真核细胞中最大的细胞器,高等动物和人类细胞的细胞核主要由核膜、染色质和核仁等组成,普遍认为维持细胞核形态和结构的完整性的关键在于维持核膜的完整性。
广义的细胞核膜主要由外层核膜、内层核膜、核孔复合体和核纤层等部分组成。外层核膜与内质网相连,上面锚定着核糖体。在内外层核膜融合的区域内镶嵌着超过60种蛋白组成的孔状复合体。位于内层核膜下方的是核纤层,核纤层是一层类似网状的结构,由核纤层蛋白组成,核纤层蛋白主要包括A型核纤层蛋白(lamin A)和B型核纤层蛋白(laminB),A型核纤层蛋白和B型核纤层蛋白通过头尾聚合形成稳定的核骨架,以维持细胞核膜形态并定位核孔复合体。
在活细胞内,Aurora家族激酶和CDK1/CyclinB1复合体协同磷酸化核孔复合体Nup98,使核孔复合体Nup98解聚,之后位于细胞质内的CDK1/CyclinB1复合体和PKC家族激酶进入细胞核内并协同磷酸化lamin A和lamin B,促使核纤层解聚,从而破坏细胞核膜的形态与结构完整性。
在细胞死亡后,细胞膜失去半透性,细胞膜内外渗透压失衡,使得细胞膜发生破裂。细胞膜破裂后细胞质内的溶酶体膜将崩解并释放大量蛋白水解酶,核孔复合体蛋白在蛋白水解酶的作用下发生水解解聚。在核孔复合体蛋白解聚后,蛋白水解酶进入细胞核内,lamin A和lamin B在蛋白水解酶的作用下发生水解,使得核纤层发生解聚,由此细胞核膜的形态与结构的完整性被破坏。
薄层细胞检查(TCT)的流程包括:临床医生使用塑料毛刷对患者宫颈外口和宫颈管中的脱落细胞进行采集,然后将细胞涮洗于细胞保存液中,接着实验人员将装有细胞保存液的标本瓶放入TCT制片机中,在过滤膜的高速旋转下将细胞打散、混匀,然后将细胞吸附到过滤膜上,最后将其印在玻片上制作成为直径为2cm,细胞个数在2万左右的薄片。然后立即使用浓度为95%的酒精固定处理,采用巴氏染色法将细胞进行染色。
本文中“短链醇”和“短链醛”是指碳链长度不大于16的醇类或醛类物质,包括但不限于甲醛、甲醇、正丙醇、异丙醇、苯酚、苯甲醛、苯乙醇、间二苯酚等。
为了提高通过LBC技术制得的涂片上的标本细胞的细胞核原有形态的完整性,以提高标本细胞细胞核的染色效果,进而降低诊断难度,本申请提供一种液基细胞检查用细胞保存液及其制备方法。
第一方面,本申请提供一种液基细胞检查用细胞保存液,采用如下的技术方案:
一种液基细胞检查用细胞保存液,包括4-10重量份溶质和1750-1850重量份溶剂;其中,所述溶剂包括磷酸缓冲盐溶液和细胞形态固定液,所述磷酸缓冲盐溶液为由质量比为0.24:1.44:8:0.2:1000的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和去离子水组成的标准PBS溶液,所述细胞形态固定液为醇类或醛类,所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100:(75-85);所述溶质包括黏液分解剂、红细胞裂解剂和可抑制CDK1/CyclinB1复合体活化的细胞核形态固定剂,所述黏液分解剂、所述红细胞裂解剂、所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为(2-3):(0.1-0.2):(1.9-6.8):1799.88。
根据采样规范,从患者宫颈外口和宫颈管处采集得到的标本细胞应保持有生理活性。当具有生理活性的标本细胞保存于本申请中的细胞保存液内时,磷酸缓冲盐溶液能保持标本细胞细胞膜内外渗透压的稳定性,从而维持细胞膜形态结构的完整性。
醇类或醛类细胞形态固定液能维持标本细胞细胞膜的结构稳定性,从而实现固定标本细胞形态的效果,同时标本细胞的细胞膜完整时,细胞质内的溶酶体酶不发生崩解,溶酶体内含有的蛋白水解酶无法进行释放,由此也保护了细胞核膜的完整性。细胞形态固定液可以是芳烃醇或芳烃醛,也可以是烷烃醇或烷烃醛,当然也可以是不饱和醇或不饱和醛,只要能实现固定标本细胞形态的效果均可使用。本领域技术人员应该理解,使用不同的细胞形态固定液实现相同的固定效果时,细胞形态固定液的使用量应根据实际应用进行调整,该用量本领域技术人员可通过有限次的实验得到。
黏液分解剂可将标本细胞中黏附的宫颈黏液进行分解,降低标本细胞的聚集度,从而降低涂片上标本细胞的重叠度。黏液分解剂可以是单种化合物,如尿素,如DL-1,4-二硫代苏糖醇;当然也可以是多种化合物的组合,如尿素与DL-1,4-二硫代苏糖醇的组合物。凡具有黏液分解作用的物质,均应落入本申请要求保护的范围内。
红细胞裂解剂可将标本细胞中带有的红细胞进行裂解降解,以减少过多的红细胞对具有诊断意义的细胞的影响。红细胞裂解剂可以是具有溶血作用的单种化合物如薯蓣皂苷和卵磷脂酶等,也可以是多种化合物的组合物如皂素、十二烷基硫酸钠的组合物等。凡具有破坏红细胞结构,使红细胞裂解的物质,均应落入本申请要求保护的范围内。
细胞核形态固定剂通过抑制CDK1/CyclinB1复合体活化以抑制核孔复合体和核纤层的解聚,从而维持标本细胞细胞核膜形态结构的完整性。具有CDK1/CyclinB1复合体活化抑制效果的物质有多种,如二烯丙基二硫(DADS)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)、硫酸长春新碱和白屈菜碱等。凡具有CDK1/CyclinB1复合体活化抑制效果的物质,均应落入本申请要求保护的范围内。
优选的,所述细胞核形态固定剂为可从天然植物中提取的活性生物碱,所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为(1.9-2.7):1799.88。
通过采用上述技术方案,选用可从天然植物中提取的具有CDK1/CyclinB1复合体活化抑制效果的活性生物碱对实验人员的毒性更低,且相比于CKI等单克隆抗体而言成本更低廉,更适于大规模推广使用。
优选的,所述细胞核形态固定剂为白屈菜碱,所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为(2.2-2.4):1799.88。
白屈菜是我国境内广泛种植的一种植物,其来源广、产量高,而白屈菜碱可从白屈菜的带根全草进行提取获得,因此选用白屈菜碱能极大降低生产成本,使本申请公开的细胞保存液具有更高的实用与推广价值。
优选的,所述细胞形态固定液为短链醇或短链醛,所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100:(78-80)。
白屈菜碱是一种苯并菲啶类化合物,在以短链醇与短链醛作为溶剂时具有较高的溶解度,因此选用短链醇或短链醛作为溶剂能提高白屈菜碱的溶解度。此外,短链醇和短链醛的成本较低,选用短链醇与短链醛能降低生产成本,使本申请公开的细胞保存液具有更高的实用与推广价值。
优选的,所述细胞形态固定液为乙醇,所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100.988:79。
乙醇制取便捷且来源广泛,且乙醇能与标准PBS溶液互溶,从而增大白屈菜碱在溶剂中的溶解度。
优选的,所述红细胞裂解剂为呋喃甾烷型皂苷,所述红细胞裂解剂与所述溶剂的质量比为(0.10-0.12):1799.88。
呋喃甾烷型皂苷能与血红细胞细胞膜上的胆甾醇结合生成不溶性的分子复合物,从而破坏血红细胞的渗透性并使血红细胞发生崩解裂解。
优选的,所述红细胞裂解剂为薯蓣皂苷,所述红细胞裂解剂与所述溶剂的质量比为0.1:1799.88。
薯蓣皂苷可从薯蓣中提取获得,薯蓣是我国境内一种广泛种植的经济作物,选用薯蓣皂苷作为红细胞裂解剂可以有效降低本申请公开的细胞保存液的生产成本,提高其实用价值与推广价值。
优选的,所述黏液分解剂为DL-1,4-二硫代苏糖醇,所述黏液分解剂与所述溶剂的质量比为2.5:1799.88。
宫颈黏液是一种糖蛋白凝胶,其来自宫颈黏膜腺细胞的分泌。在酸性条件下,宫颈黏液能迅速分解,因此一般选用酸性物质或酸性调节剂将宫颈黏液进行分解。然而标本细胞在后续进行巴氏染色的时候需要在碱性条件下进行,因此细胞保存液一般调节为碱性。DL-1,4-二硫代苏糖醇具有良好的耐碱性和较低的氧化还原性,耐碱性的DL-1,4-二硫代苏糖醇能在碱性条件下对宫颈黏液进行分解,从而实现在碱性条件下将宫颈黏液进行分解的效果。同时DL-1,4-二硫代苏糖醇较低的氧化还原性则降低了其对标本细胞细胞膜的影响,提高了标本细胞细胞形态的完整性。
第二方面,本申请提供一种制备上述细胞保存液的方法,采用如下的技术方案:
一种制备上述细胞保存液的方法,包括以下步骤:
S1、按重量份数,取0.24份磷酸二氢钾、1.44份磷酸氢二钠、8份氯化钠、0.2份氯化钾和1000份去离子水进行混合,搅拌均匀后得到磷酸缓冲盐溶液;
S2、将所述磷酸缓冲盐溶液的pH值调节为8-9后,按重量分数,取100份所述磷酸缓冲盐溶液与75-85份细胞形态固定液进行混合,得到溶剂;
S3、按重量份数,向1799.88份所述溶剂中加入2-3份黏液分解剂、0.1-0.2份红细胞裂解剂、1.9-6.8份细胞核形态固定剂,搅拌均匀后得到所述细胞保存液。
优选的,在所述步骤S2中,取1009.88份所述磷酸缓冲盐溶液与790份乙醇进行混合,得到溶剂;
在所述步骤S3中,向1799.88份所述溶剂中加入2.5份DL-1,4-二硫代苏糖醇、0.1份薯蓣皂苷和2.2-2.4份白屈菜碱,搅拌均匀后得到所述细胞保存液。
综上所述,本申请具有以下有益效果:
1、采用醇类或醛类作为细胞形态固定液,并采用具有CDK1/CyclinB1复合体活化抑制效果的细胞核形态固定剂,能提高通过LBC技术制得的涂片上的标本细胞的细胞膜和细胞核膜的形态、结构的完整性,从而提高标本细胞细胞核的染色效果,便于医师诊断病变细胞并降低诊断难度,进而提高诊断效率与诊断准确度。
2、白屈菜碱可从白屈菜中大量提取,成本相对低廉;乙醇的成本也相对低廉,且乙醇可作为白屈菜碱的溶剂以提高白屈菜碱在细胞保存液中的溶解度,从而降低白屈菜碱溶解于细胞保存液中的难度,简化细胞保存液的生产步骤。
3、选用薯蓣皂苷作为红细胞裂解剂可降低细胞保存液的生产成本,从而提高了细胞保存液的实用价值以及推广价值。
4、选用DL-1,4-二硫代苏糖醇作为黏液分解剂使得细胞保存液在处于便于进行染色的碱性环境下对宫颈黏液仍有较强的分解效果,同时低氧化还原性也降低了其对标本细胞细胞膜的影响,从而提高标本细胞的细胞形态的完整性。
附图说明
图1是中国人民解放军总医院某病患于2015年11月6日进行TCT检查的宫颈标本细胞40倍显微图;
图2是中国人民解放军海军总医院某病患于2016年4月12日进行TCT检查的宫颈标本细胞40倍显微图;
图3是采用本申请实施例1中的细胞保存液处理后的某病患TCT宫颈标本细胞40倍显微图;
图4是采用本申请实施例2中的细胞保存液处理后的某病患TCT宫颈标本细胞40倍显微图;
图5是采用本申请实施例3中的细胞保存液处理后的某病患TCT宫颈标本细胞40倍显微图。
具体实施方式
以下结合附图1-5和实施例1-3对本申请作进一步详细说明。
本申请部分物质来源如下:
无水乙醇,分析纯,购自北京化工厂;
白屈菜碱,质量分数98%,购自深圳美荷生物科技有限公司;
薯蓣皂苷,质量分数45%,购自湖北源梦生物科技有限公司。
实施例
实施例1
一种液基细胞检查用细胞保存液,通过以下步骤制得:
S1、取磷酸二氢钾0.24g、磷酸氢二钠1.44g、氯化钠8g和氯化钾0.2g,完全溶解于1000g去离子水中,搅拌均匀后得到磷酸缓冲盐溶液。
S2、用质量分数为30%的氢氧化钠溶液对磷酸缓冲盐溶液进行滴定,调节磷酸缓冲盐溶液的pH值至8。
S3、称取1009.88g调节好pH值的磷酸缓冲盐溶液,并称取790g无水乙醇,两者混合均匀得到溶剂。
S4、取DL-1,4-二硫代苏糖醇2.5g、薯蓣皂苷0.1g和白屈菜碱2.2g,完全溶解于溶剂中,搅拌均匀后得到细胞保存液。
实施例2
与实施例1的不同之处在于,步骤S4中加入的白屈菜碱的质量为2.3g。
实施例3
与实施例1的不同之处在于,步骤S4中加入的白屈菜碱的质量为2.4g。
性能检测试验
本申请实施例1-3制得的细胞保存液均由北京大学第三医院相关科室进行TCT检查使用,经本申请实施例1-3制得的细胞保存液处理后的标本细胞的40倍显微图由北京大学第三医院进行返还。
其中,实施例1的标本细胞来源为于2020年7月7日进行TCT检查的某病患,检查结果如图3所示;实施例2的标本细胞来源为于2020年7月13日进行TCT检查的某病患,检查结果如图4所示;实施例3的标本细胞来源为于2020年7月21日进行TCT检查的某病患,检查结果如图5所示。
对图3-图5进行分析,实施例1-3中的标本细胞的细胞形态结果如表1所示。
表1 标本细胞形态结果
结果来源 | 细胞形态 | 细胞膜 | 细胞核 | 核膜 | 核仁 | 染色质 | 核质 |
实施例1 | 细胞量丰富,角化细胞、非角化细胞、移行区成分等形态清晰 | 完整,可见胞质与溶液的明显分界 | 结构清晰,可见核膜、核仁、染色质和核质 | 结构清晰可见,呈深蓝色 | 结构清晰可见,呈圆形深蓝色 | 结构清晰可见,呈不规则状深蓝色 | 清晰可见,呈浅蓝色 |
实施例2 | 细胞量丰富,角化细胞、非角化细胞、移行区成分等形态清晰 | 完整,可见胞质与溶液的明显分界 | 结构清晰,可见核膜、核仁、染色质和核质 | 结构清晰可见,呈深蓝色 | 结构清晰可见,呈圆形深蓝色 | 结构清晰可见,呈不规则状深蓝色 | 清晰可见,呈浅蓝色 |
实施例3 | 细胞量丰富,角化细胞、非角化细胞、移行区成分等形态清晰 | 完整,可见胞质与溶液的明显分界 | 结构清晰,可见核膜、核仁、染色质和核质 | 结构清晰可见,呈深蓝色 | 结构清晰可见,呈圆形深蓝色 | 结构清晰可见,呈不规则状深蓝色 | 清晰可见,呈浅蓝色 |
结合实施例1-3并结合图3-5和表1可以看出,经由实施例1-3制得的细胞保存液处理的标本细胞在制成涂片后,其细胞形态维持完整,细胞核及核内物质染色效果良好,染色质与核仁显示清晰,使得医师能轻易根据显微图对病变细胞进行诊断。
发明人经过大量研究与反复验证猜想后发现,染色质染色效果的关键在于维持核膜形态与结构的完整性,而核膜形态与结构的完整性与核纤层的稳定性具有直接联系。因此采用细胞形态固定液以维持细胞膜形态的完整性,从而提高标本细胞死亡后的溶酶体膜的完整性,降低溶酶体内的蛋白水解酶对核膜上的核孔蛋白复合体的解聚作用。此外,采用细胞核形态固定剂抑制CDK1/CyclinB1的活化,从而抑制细胞自行解聚核膜与核纤层,从而进一步地维持细胞核形态的完整性。
本申请公开的细胞保存液通过以上两种方法的联合使用以维持核纤层的稳定性,从而提高了细胞核及核内物质的染色效果。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (2)
1.一种液基细胞检查用细胞保存液,其特征在于,包括4-10重量份溶质和1750-1850重量份溶剂;
其中,所述溶剂包括磷酸缓冲盐溶液和细胞形态固定液,所述磷酸缓冲盐溶液为由质量比为0.24:1.44:8:0.2:1000的磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾和去离子水组成的标准PBS溶液,所述细胞形态固定液为乙醇,所述磷酸缓冲盐溶液和所述细胞形态固定液的质量比为100.988:79;
所述溶质包括黏液分解剂、红细胞裂解剂和可抑制CDK1/CyclinB1复合体活化的细胞核形态固定剂,所述黏液分解剂与所述溶剂的质量比为2.5:1799.88,所述红细胞裂解剂与所述溶剂的质量比0.1:1799.88,所述细胞核形态固定剂与所述溶剂的质量比为(2.2-2.4):1799.88;
所述细胞核形态固定剂为白屈菜碱;所述红细胞裂解剂为薯蓣皂苷;所述黏液分解剂为DL-1,4-二硫代苏糖醇。
2.一种制备如权利要求1所述的细胞保存液的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、按重量份数,取0.24份磷酸二氢钾、1.44份磷酸氢二钠、8份氯化钠、0.2份氯化钾和1000份去离子水进行混合,搅拌均匀后得到磷酸缓冲盐溶液;
S2、将所述磷酸缓冲盐溶液的pH值调节为8-9后,按重量分数,取1009.88份所述磷酸缓冲盐溶液与790份乙醇进行混合,得到溶剂;
S3、按重量份数,向1799.88份所述溶剂中加入2.5份DL-1,4-二硫代苏糖醇、0.1份薯蓣皂苷和2.2-2.4份白屈菜碱,搅拌均匀后得到所述细胞保存液。
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CN113068683A (zh) | 2021-07-06 |
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