CN104147033B

CN104147033B - 一种含有米氏海参皂苷a的组合物及制备和用途

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Publication number: CN104147033B
Application number: CN201410388698.9A
Authority: CN
Inventors: 张治针; 叶雪威; 梁英; 连晓媛
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-05-19
Filing date: 2014-08-09
Publication date: 2017-02-15
Anticipated expiration: 2034-08-09
Also published as: CN104151392A; CN104147033A

Abstract

本发明提供一种含有米氏海参皂苷A组合物，由米氏海参总皂苷和大豆异黄酮总甙元组成，米氏海参总皂苷和大豆异黄酮总甙元的组成比例为1:2‑5。米氏海参总皂苷由米氏海参皂苷A、海参素甲、海参素乙和24‑脱氢棘辐肛参苷B四种化合物组成，大豆异黄酮总甙元由大豆素和染料木素组成。本发明组合物通过渗漉提取、经ODS柱层析分离、减压浓缩获得。组合物具有显著抑制多种胶质瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用。本发明组合物可以满足大量制备抗胶质瘤药物生产的需求，可在制备治疗脑胶质瘤药物方面具有应用前景。

Description

一种含有米氏海参皂苷A的组合物及制备和用途

技术领域

本发明属医药领域，涉及一种含有米氏海参皂苷A(Moebioside A)的组合物及其制备，以及该组合物在制备治疗脑胶质瘤药物方面的应用。具体来说，该组合物由含有米氏海参皂苷A的米氏海参总皂苷和含有大豆素(Daidzein)和染料木素(Genistein)的大豆异黄酮总甙元所组成,其中的米氏海参总皂苷从海洋动物绿海葵Anthopleura midori中提取分离制备，大豆异黄酮总甙元从大豆异黄酮总甙的酸水解物中分离纯化而制备。

背景技术

脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)是脑颅内最常见和最恶性的脑肿瘤，约占颅内肿瘤的46％，占所有恶性脑肿瘤的70％。世界卫生组织统计数据表明：恶性胶质瘤是34岁以下肿瘤患者的第2位死亡原因，是35～54岁患者的第3位死亡原因，严重危害人类的健康及生命。手术后结合放疗和替莫唑胺化疗是目前治疗恶性胶质瘤最普遍方法。对新诊断的患者,替莫唑胺目前是唯一可选择的单一治疗的化疗药。但是,包括替莫唑胺在内的现有治疗胶质瘤药物的疗效有限,多有严重不足,突出表现为:(1)多为化学品,毒副作用大；(2)肿瘤细胞对药物的严重耐药性；(3)血脑屏障阻碍了药物到达脑内发挥其疗效。因此，临床上需要克服以上缺陷，疗效更好、安全性更高和作用机制独特的新型抗胶质瘤药物。

研究证明，胶质瘤细胞表现出与正常细胞不同的代谢特征。胶质瘤细胞从微环境中摄取大量葡萄糖在糖酵解环节由胶质瘤细胞高表达的多个关键酶包括己糖激酶2(HK2)、磷酸果糖激酶/果糖2,6-二磷酸酶(PFKFB3)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和乳酸脱氢酶5(LDH5)等共同参与产生大量中间产物和终产物乳酸。这些中间产物是肿瘤细胞合成生物大分子的起始原料,而乳酸分泌至细胞外可抑制机体免疫细胞对肿瘤细胞的清除能力,可促进肿瘤细胞扩散,高表达的糖酵解关键酶HK2还可提高肿瘤细胞对放疗和替莫唑胺化疗的抗性。此外，谷氨酰胺酶(GLS)主导的旺盛的谷氨酰胺分解(供给氮源和碳源)、胶质瘤细胞高表达脂肪酸合成酶(FASN)和活跃的脂类合成利于大量生物分子和细胞膜的生成,抑制FASN活性具有抗肿瘤作用。不难理解，正是肿瘤细胞高度利用其代谢中间产物合成生物大分子DNA、RNA、蛋白质和生物膜的能力促使其快速无限制地增殖,调控肿瘤代谢不同环节的关键酶可有效抑制肿瘤细胞的增殖。因此，靶向胶质瘤代谢不同环节关键酶的多靶点作用的药物具有更好的抗肿瘤疗效。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有米氏海参皂苷A(Moebioside A,1)的组合物，所述的组合物由米氏海参总皂苷和大豆异黄酮总甙元所组成，米氏海参总皂苷和大豆异黄酮总甙元的组成比例为1:2-5。

所述的米氏海参皂苷A(1)的化学结构式为：

所述的米氏海参总皂苷由米氏海参皂苷A(1)、海参素甲(Holothurin A,2)、海参素乙(Holothurin B,3)和24-脱氢棘辐肛参苷B(24-dehydroechinoside B,4)四种化合物组成，所述米氏海参总皂苷中四种成分的比例为,米氏海参皂苷A(1):海参素甲(2):海参素乙(3):24-脱氢棘辐肛参苷B(4)＝2:1:4～6:1克。

化合物2-4的化学结构式为：

所述的大豆异黄酮总甙元由大豆素(Daidzein,5)和染料木素(Genistein,6)组成，大豆异黄酮总甙元中大豆素与染料木素的比例为1:1。

它们的化学结构式为：

组合物中六种成分组成的比例为米氏海参皂苷A(1):海参素甲(2):海参素乙(3):24-脱氢棘辐肛参苷B(4):大豆素(5):染料木素(6)＝2:1:4～6:1:8～20:8～20克。

本发明的另一个目的是提供所述组合物的制备方法，通过以下步骤实现：

(1)米氏海参总皂苷的提取分离纯化

将冷冻的米氏海参切成小块，用甲醇渗漉提取，甲醇渗漉液合并后经减压浓缩得到浓缩的甲醇提取液，浓缩的甲醇提取液先后用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液并经减压浓缩得到正丁醇萃取物浸膏，将正丁醇萃取物浸膏溶于水中，水溶解物经大孔树脂柱层析分离，分别用10％(v/v)甲醇水和80％(v/v)甲醇水依次洗脱，合并80％(v/v)甲醇洗脱液并经减压浓缩得到粗总皂苷组分，将粗总皂苷溶于水中经反相硅胶(ODS)柱层析分离，先用30％(v/v)甲醇水洗脱，再用70％(v/v)甲醇水洗脱，每300毫升1份，分段收集70％(v/v)甲醇水洗脱液，各收集组分中所含有的皂苷用反相硅胶薄层层析(TLC,甲醇/水,70:30,10％(v/v)硫酸105℃加热显色)检测,将显紫红色斑点(TLC检测呈阳性)含有皂苷的组分合并,减压浓缩得到米氏海参总皂苷。

所述渗漉提取所用的溶媒为甲醇、或乙醇。所述大孔树脂柱层析大孔树脂用量与样品量的比例是10-30毫升：1克；所述的反相硅胶柱层析ODS的用量与样品量的比例是30-60克：1克。

(2)米氏海参总皂苷的理化性质和成分分析

米氏海参总皂苷为无色粉末，易溶于70-90％(v/v)甲醇水、70-90％(v/v)乙醇水、吡啶，不溶于氯仿、乙酸乙酯。米氏海参总皂苷由米氏海参皂苷A(1)、海参素甲(2)、海参素乙(3)和24-脱氢棘辐肛参苷B(4)四种化合物组成，它们各自的Rf值为0.56(米氏海参皂苷A,1)、0.64(海参素甲,2)、0.49(海参素乙,3)和0.36(24-脱氢棘辐肛参苷B,4)，它们的结构是根据它们的¹H谱，¹³C谱，COSY谱，HMQC谱，HMBC谱和高分辨质谱而鉴定。

(3)大豆异黄酮总甙元的制备

将粉碎的大豆用甲醇渗漉提取，甲醇渗漉液合并后经减压浓缩得到五分之一体积的甲醇提取液，浓缩的甲醇提取液用环己烷萃取，去脂的甲醇提取液减压浓缩得到甲醇浸膏，去脂的甲醇浸膏溶于二甲基亚砜(DMSO)，DMSO溶液经大孔树脂柱层析分离，分别用10％(v/v)甲醇水和90％(v/v)甲醇水洗脱，收集90％(v/v)甲醇水洗脱液并减压浓缩得到大豆总异黄酮(甙和甙元)粗品。大豆总异黄酮粗品用1N盐酸在86℃条件下水解4小时，用1N氢氧化钠中和至pH6-8，水解液经大孔树脂柱层析分离，分别用10％(v/v)甲醇水和90％(v/v)甲醇水依次洗脱，收集90％(v/v)甲醇洗脱液，减压浓缩得到大豆异黄酮总甙元粗品。大豆异黄酮总甙元粗品经反相硅胶柱层析，先用10％(v/v)甲醇水洗脱，再用70％(v/v)甲醇水洗脱，分段收集70％(v/v)甲醇水洗脱液，用高效液相检测各组分(Cosmosil C₁₈色谱柱:250×10.0mm,5μm；流动相:乙腈/水40/60；检测波长265nm；流速为2.0ml/min),将含有大豆素(t_R11.70min)和染料木素(t_R13.71min)的各组分合并，减压浓缩得到异黄酮总甙元。

所述的大豆总异黄酮粗品可从大豆中提取，也可是从市场上购买的大豆总异黄酮粗品。所述的大豆总异黄酮粗品与1N盐酸的用量比是1克:2-5mL,水解温度为80-90℃,水解时间为3-6小时。所述大孔树脂柱层析大孔树脂用量与样品量的比例是10-30毫升：1克；所述的反相硅胶柱层析ODS的用量与样品量的比例是30-60克:1克。

(4)大豆异黄酮总甙元的理化性质和成分分析

大豆异黄酮总甙元为无色粉末，溶于甲醇、乙醇、二甲基亚砜，氯仿、乙酸乙酯，不溶于水。大豆异黄酮总甙元大豆素和染料木素两种化合物组成，它们各自在HPLC图谱上的保留时间(t_R)分别是11.70min(大豆素,5)和13.71min(染料木素,6),它们的结构是根据它们的¹H谱、质谱和与标准品的HPLC图谱的保留时间而鉴定。

(5)组合物的制备

将米氏海参总皂苷和大豆异黄酮总甙元以1:2-5的比例混合而得到含有米氏海参皂苷A的组合物。

所述的组合物含有米氏海参皂苷A(1)、海参素甲(2)、海参素乙(3)、24-脱氢棘辐肛参苷B(4)、大豆素(5)和染料木素(6)六种成分,所述组合物六种成分组成的比例为米氏海参皂苷A(1):海参素甲(2):海参素乙(3):24-脱氢棘辐肛参苷B(4):大豆素(5):染料木素(6)＝2:1:4～6:1:8～20:8～20克。

本发明的再一个目的是提供含有米氏海参皂苷A的组合物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用。该组合物及它所含的六个成分米氏海参皂苷A、海参素甲、海参素乙、24-脱氢棘辐肛参苷B、大豆素和染料木素显著抑制胶质瘤C6、U87-MG、U251和SHG-44细胞的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡。米氏海参皂苷A和大豆素这两类化合物可以降低肿瘤细胞特征代谢过程中多个关键酶的蛋白水平表达，具有独特的多靶点抗胶质瘤的作用特性。大豆素类异黄酮甙元不仅抑制胶质瘤细胞增殖，而且促使胶质瘤细胞向正常细胞分化。因此，含有米氏海参皂苷A的组合物可用于制备治疗胶质瘤药物。

本发明所述药物为含有米氏海参皂苷A的组合物单独或与其他药物或有效成分一起，与药学上可接受的赋形剂制成。

本发明所述药物的制剂包括液体制剂、固体制剂、胶囊制剂、缓释制剂。

本发明提供了含有米氏海参皂苷A的组合物的制备方法，证明了该组合物及其中的各个单独成分均有显著抑制多种胶质瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并揭示了米氏海参皂苷A和大豆素这两类化合物作用于肿瘤代谢网络中数个关键酶的独特多靶点作用机制，大豆素类异黄酮甙元还可促使胶质瘤细胞向正常星形胶质细胞分化，在临床上具有重要意义。由于该组合物中各个单独的活性成分，特别是皂苷类各个单独的活性成分分离较困难，将这六种活性物质以组合物形式作为原料药，可以满足大量制备抗胶质瘤药物生产的需求。综上所述，含有米氏海参皂苷A的组合物在制备治疗脑胶质瘤药物方面具有应用前景。

附图说明

图1.米氏海参皂苷A(1)的氢谱。

图2.米氏海参皂苷A(1)的碳谱。

图3.米氏海参皂苷A(1)的¹H-¹H COSY谱。

图4.米氏海参皂苷A(1)是的HMQC谱。

图5.米氏海参皂苷A(1)的HMBC谱。

图6.米氏海参皂苷A(1)的高分辨质谱。

图7.米氏海参皂苷A(1)的薄层层析图谱。

图8.米氏海参总皂苷的薄层层析图谱。

图9.大豆异黄酮总甙元的HPLC图谱。

图10.米氏海参皂苷A(1)和海参素甲(2)对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。

图11.海参素乙(3)和24-脱氢棘辐肛参苷B(4)对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。

图12.米氏海参皂苷A(1)诱导胶质瘤U87-MG细胞凋亡和坏死。

图13.米氏海参皂苷A(1)诱导人胶质瘤U87MG细胞凋亡和坏死的定量分析。

图14.组合物诱导胶质瘤C6细胞凋亡和坏死。

图15.组合物诱导胶质瘤U251细胞凋亡和坏死。

图16.米氏海参皂苷A(1)降低胶质瘤U87-MG细胞代谢酶的蛋白表达水平。

图17.大豆素(5)降低胶质瘤U87-MG细胞代谢酶的蛋白表达水平。

图18.大豆素(5)诱导胶质瘤C-6和U251细胞分化的正常星形胶质细胞形态。

图19.GFAP染色和western blot分析证明大豆素(5)诱导胶质瘤U251细胞向正常星形胶质细胞分化。

图20.组合物诱导胶质瘤C-6和U251细胞向正常星形胶质细胞分化，其中A：胶质瘤C6、U251细胞和正常星形胶质细胞形态；B：组合物诱导胶质瘤U251细胞分化的正常星形胶质细胞经GFAP荧光染色成绿色。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。但是，本发明不限于这些实施例。

实施例1米氏海参总皂苷的制备

(1)米氏海参总皂苷的提取分离纯化

将冷冻的米氏海参(五十只)切成小块，用甲醇渗漉提取五次(第一次用5000毫升甲醇，其它每次3000毫升甲醇)，甲醇渗漉液合并后经减压浓缩得到浓缩的甲醇提取液。浓缩的甲醇提取液先后用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液并经减压浓缩得到正丁醇萃取物浸膏(40.0克)。正丁醇萃取物浸膏溶于水中，水溶解物经大孔树脂(600毫升)柱层析分离，分别用10％(v/v)甲醇水(4000毫升)和80％(v/v)甲醇水(4000毫升)依次洗脱。合并80％(v/v)甲醇洗脱液并经减压浓缩得到粗总皂苷组分(9.5克)。将粗总皂苷溶于水中经反相硅胶(ODS，300克)柱层析分离,先用2000毫升30％(v/v)甲醇水洗脱,再用70％(v/v)甲醇水洗脱。每300毫升1份,分段收集70％(v/v)甲醇洗脱液,各收集组分中所含有的皂苷用反相硅胶薄层层析(TLC,甲醇/水,70:30,10％(v/v)硫酸105℃加热显色)检测,将显紫红色斑点(TLC检测呈阳性)含有皂苷的组分合并,减压浓缩得到米氏海参总皂苷(7.6克)。

(2)米氏海参总皂苷各单一成分的分离及鉴定

米氏海参总皂苷(3.5克)溶于水中经反相硅胶(ODS,300克)柱层析分离,先用2000毫升30％(v/v)甲醇水洗脱,再用4000毫升65％(v/v)甲醇水洗脱。每200毫升1份，分段收集65％(v/v)甲醇洗脱液,各收集组分中所含有的皂苷用反相硅胶薄层层析(TLC,甲醇/水,70:30,10％硫酸105℃加热显色)检测,将含有米氏海参皂苷A的相同组分(组分15-17)合并，减压浓缩得到米氏海参皂苷A(1，875毫克)，合并组分11-13并减压浓缩得到海参素甲(2，430毫克)，合并组分19-22并减压浓缩得到海参素乙(3，1748毫克)，合并组分26-27并减压浓缩得到24-脱氢棘辐肛参苷B(4，436毫克)。

米氏海参总皂苷由米氏海参皂苷A(1)、海参素甲(2)、海参素乙(3)和24-脱氢棘辐肛参苷B(4)四个化合物组成。米氏海参皂苷A为一个新化合物，无色粉末,分子式C₄₃H₆₅NaO₁₉S；易溶于70-90％(v/v)甲醇水、70-90％(v/v)乙醇水、吡啶，不溶于氯仿、乙酸乙酯；高分辨质谱m/z＝917.3842[M-Na]^-(计算值C₄₃H₆₅O₁₉S,917.3841)。米氏海参皂苷A(1)、海参素甲(2)、海参素乙(3)和24-脱氢棘辐肛参苷B(4)的结构是根据它们的NMR和质谱而鉴定，其NMR数据见表1-3，NMR和高分辨质谱图谱见附图1到附图6，它们的Rf值(附图7和8)为0.56(米氏海参皂苷A,1)、0.64(海参素甲，2)、0.49(海参素乙,3)和0.36(24-脱氢棘辐肛参苷B,4)。

表1.米氏海参皂苷A(1)的碳和氢谱数据(氘代吡啶)

表2.海参皂苷2-4的碳谱数据(氘代吡啶,125MHz)

No.	2	3	4	No.	2	3	4	No.	2	3	4
												1	36.6	36.5	36.7	20	86.9	86.9	87.3	2	75.3	77.2	77.4
2	27.3	27.2	27.4	21	19.1	19.0	23.3	3	95.9	77.8	78.1
												3	88.9	88.9	89.1	22	80.9	80.8	39.1	4	87.4	76.9	77.0
4	40.3	40.2	40.4	23	28.4	28.5	23.7	5	72.0	73.6	73.8
												5	52.9	52.8	53.1	24	38.7	38.6	125.0	6	18.4	18.8	19.0
6	21.5	21.4	21.5	25	81.7	81.6	132.0	Glc
												7	28.6	28.8	28.7	26	28.9	28.8	26.0	1	105.2
8	41.1	41.0	41.2	27	27.7	27.6	18.0	2	74.1
												9	154.0	154.0	154.4	28	28.3	28.2	28.4	3	88.2
10	40.0	39.9	40.0	29	17.0	17.0	17.1	4	70.0^a
												11	115.8	115.7	115.9	30	20.6	20.5	20.4	5	78.6^b
12	71.8	71.7	71.7	Xyl				6	62.3^c
												13	59.0	58.9	58.9	1	105.5	105.5	105.6	Glc′
14	46.2	46.1	46.7	2	83.5	83.4	83.6	1	105.9
												15	37.1	37.0	37.0	3	75.8	75.9	76.0	2	76.6
16	35.8	35.7	36.3	4	76.3	76.2	76.6	3	88.3
												17	90.0	89.9	89.6	5	64.6	64.5	64.6	4	70.9^a
18	174.8	174.7	175.0	Qui				5	78.1^b
												19	22.8	22.7	22.9	1	105.6	106.1	106.2	6	62.4^c

^a-c每一纵列带有相同字母的数据可能会互相变换。

表3.海参皂苷2-4的氢谱数据(氘代吡啶,500MHz,J＝Hz)

(3)大豆异黄酮总甙元的制备

将粉碎的大豆(3公斤)用甲醇渗漉提取三次(第一次3000毫升甲醇，其它每次2000毫升甲醇)，甲醇渗漉液合并后经减压浓缩得到2000mL甲醇提取液，浓缩的甲醇提取液用环己烷萃取三次(每次1000毫升)，去脂的甲醇提取液减压浓缩得到甲醇浸膏(36.8克)，甲醇浸膏用300毫升二甲基亚砜(DMSO)溶解，DMSO溶液经大孔树脂柱层析分离，分别用10％(v/v)甲醇水(3000毫升)和90％(v/v)甲醇水(3000毫升)洗脱，收集90％(v/v)甲醇水洗脱液并减压浓缩得到大豆总异黄酮(甙和甙元)粗品(28.8克)。大豆总异黄酮粗品用1N盐酸在86℃条件下水解4小时，用1N氢氧化钠中和至pH6-8，水解液经大孔树脂柱层析分离，分别用10％(v/v)甲醇水(3000毫升)和90％(v/v)甲醇水(3000毫升)依次洗脱，收集90％(v/v)甲醇洗脱液，减压浓缩得到大豆异黄酮总甙元粗品(15.6克)。大豆异黄酮总甙元粗品经反相硅胶柱层析，先用50％(v/v)甲醇水(2000毫升)洗脱，再用70％(v/v)甲醇水(4000毫升)洗脱，每200毫升分段收集70％(v/v)甲醇水洗脱液，用高效液相检测各组分(Cosmosil C₁₈色谱柱:250×10.0mm,5μm；流动相:乙腈/水40/60；检测波长265nm；流速为2.0ml/min),将含有大豆素(t_R 11.70min)和染料木素(t_R 13.71min)的各组分合并，减压浓缩得到异黄酮总甙元(11.6克)。

(4)大豆异黄酮总甙元各单一成分的分离及鉴定

取大豆异黄酮总甙元(100毫克)，用HPLC分离(Cosmosil C₁₈色谱柱:250×10.0mm,5μm；流动相:乙腈/水40/60；检测波长265nm；流速为2.0ml/min),得到大豆素(5，45mg,t_R11.70min)和染料木素(6,48mg,t_R 13.71min)。大豆素和染料木素的结构是根据它们的NMR和质谱而鉴定，其NMR和质谱数据见表4，HPLC图谱见附图9。

表4.大豆素(5)和染料木素(6)的氢谱和质谱数据

实施例2组合物及其所含成分抑制胶质瘤细胞增殖的作用

大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U87-MG、U251和HSG-44细胞用DMEM和10％FBS培养基在37℃和5％二氧化碳的孵化箱中培养，经过三代培养的细胞用于本发明的实验研究。目前临床上治疗脑胶质瘤的一线药物替莫唑胺(TMZ)用作阳性对照。

用磺酰罗丹明B(SRB)法测定肿瘤细胞存活率。细胞接种于96孔板中，贴壁24h后加入不同浓度的测试药物。药物处理72h后用SRB染色，用酶标仪测定515nm处的吸收光度值，检测肿瘤细胞的存活率，计算测试化合物的IC₅₀值。实验结果表明：组合物和大豆异黄酮总甙元及其所含各单一成分(米氏海参皂苷A、海参素甲、海参素乙、24-脱氢棘辐肛参苷B、大豆素和染料木素)均显著抑制所测试的胶质瘤C6、U87-MG、U251或HSG-44细胞的增殖，并成剂量依赖性(附图10和11)，其IC₅₀值见表5。

表5.组合物及其所含成分对胶质瘤细胞增殖的抑制作用(IC₅₀:μM,或μg/mL)

实施例3米氏海参皂苷A(1)诱导胶质瘤细胞凋亡和坏死的作用

用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化丙啶(PI)双重染色测定米氏海参皂苷A诱导人胶质瘤U87-MG细胞凋亡和坏死的作用。肿瘤细胞和不同浓度的米氏海参皂苷A在37℃的孵化箱中培养72小时后用10μg/mL的DAPI和5μg/mL的PI在室温下染色20分钟。用PBS洗涤两次后，在40倍的荧光显微镜观察肿瘤细胞凋亡和坏死情况，凋亡细胞经DAPI染色后为亮蓝色，坏死细胞经碘化丙啶(PI)染色后为红色。实验结果证明：米氏海参皂苷A(4.0μM)显著诱导人胶质瘤U87-MG细胞凋亡和坏死(附图12)。

用Annexin V-FITC/PI双染色分析方法对米氏海参皂苷A诱导人胶质瘤U87-MG细胞凋亡和坏死的作用进行了定量分析。将人胶质瘤U87-MG细胞用米氏海参皂苷A(2.0μM和4.0μM)处理72小时后，收集1×10⁶个细胞。细胞用冷的PBS缓冲液洗涤后重新分散在100μL含有5μLAnnexin V-FITC和1μL100μg/mL PI工作液的结合缓冲液中。细胞在室温下孵化15分钟后加入400μL结合缓冲液，用流式细胞仪检测其荧光(激发波长：488nm；发射波长：530nm和575nm)。实验结果表明：与对照组U87-MG细胞凋亡比较，2.0μM米氏海参皂苷A处理后72小时引起60.25％的凋亡细胞升高，而4.0μM的米氏海参皂苷A则诱导55.02％凋亡细胞和10.47％坏死细胞升高(附图13，表6)。

表6.米氏海参皂苷A诱导胶质瘤U87-MG细胞凋亡和坏死的定量分析(％)

组别	早凋细胞	晚凋细胞	坏死细胞	总凋亡细胞	总凋亡和坏死细胞
						对照组	4.48	3.94	0.77	8.42	9.19
药物组I(2.0μM)	59.94	8.73	1.00	68.67	69.67
						药物组II(4.0μM)	49.50	13.94	11.24	63.44	74.68
药物处理I-对照组	55.46	4.79	0.23	60.25	60.48
						药物组II-对照组	45.02	10.0	10.47	55.02	65.49

实施例4组合物诱导胶质瘤细胞凋亡和坏死的作用

用实施例3的同样方法测定组合物诱导胶质瘤C6和U251细胞凋亡和坏死的作用。实验结果(附图14和15)表明：组合物(15微克/毫升)诱导胶质瘤C6和U251细胞凋亡和坏死。

实施例5米氏海参皂苷A(1)对胶质瘤细胞代谢酶的作用

蛋白样品的制备：人胶质瘤U87-MG细胞用MEM和10％FBS培养基在37℃和5％二氧化碳的孵化箱中培养，经过三代培养的细胞用于本发明的实验研究。细胞(1.5×10⁷)接种于10厘米的培养皿中，贴壁24h后加入米氏海参皂苷A(2.0μM或4.0μM)共培养48小时后，先用冰冷的PBS缓冲液洗两次，后用冰冷的裂解缓冲液(200μL)裂解15分钟。裂解液经4℃低温高速(11200rpm)离心,上清液为蛋白样品。

蛋白含量的测定：使用BCA试剂盒测定各个蛋白样品的蛋白含量。将试剂盒中试剂A和B以50：1比例配成工作试剂液，用牛血清白蛋白(BSA)将标准品BCA稀释配成不同浓度的BCA标准溶液。取10μL标准溶液或蛋白样品液和200μL工作试剂液混匀后在37℃孵化30分钟.孵化液用酶标仪在562nm波长测定吸收度。以BCA量为横坐标，吸收度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程。从回归方程计算各蛋白样品液的蛋白含量。

：含等量蛋白(15μg)的各样品用10％十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,将凝胶电泳蛋白图谱转到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上,PVDF膜用还有5％去脂牛奶的0.1％TBST在室温下封闭2小时。封闭后的PVDF膜先与HK2,PFKFB3,PKM2和GLS酶的一抗在4℃孵育过夜,用TBST洗膜；后与HRP标记的二抗在室温孵育2小时。TBST洗膜三次后,用增强化学发光试剂检测免疫反应性,然后显影,水洗,定影,水洗,晾干,观察实验结果。2-去氧-D-葡萄糖(2DG)作为阳性对照,β肌动蛋白(β-actin)作为内参对照。

实验结果表明：与阴性对照组(没有药物处理的U87-MG细胞)比较，米氏海参皂苷A(4.0μM)和2DG(阳性对照)两者均显著降低肿瘤细胞代谢关键酶HK2,PFKFB3,PKM2和GLS的蛋白表达水平(附图16)。这个结果提示，米氏海参皂苷A(1)具有独特的多靶点抗肿瘤特性。

实施例6大豆素(5)对胶质瘤细胞代谢酶的作用

用实施例5的同样方法测定组合物对胶质瘤细胞代谢酶HK2,PFKFB3,PKM2和GLS的影响。如图17所示，大豆素(5)显著降低胶质瘤U87-MG细胞代谢关键酶HK2,PFKFB3,PKM2和GLS的蛋白表达水平，表现出多靶点抗肿瘤的作用特性。

实施例7大豆素(5)促使胶质瘤细胞向正常星形胶质细胞分化

肿瘤细胞和大豆素(50.0μM)在37℃的孵化箱中培养72小时后，观察其细胞形态的变化。实验结果表明：大豆素可促使胶质瘤细胞向正常星形胶质细胞分化。如附图18所示，与胶质瘤C6和U251细胞比较，星形胶质细胞成平直扩展，胞浆更多，细胞核小，更长的胞突。星形胶质细胞的存在可用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)荧光染色和western bolt分析证明。肿瘤细胞和大豆素(50.0μM)在37℃的孵化箱中培养72小时后用DAPI和GFAP在室温下染色20分钟。用PBS洗涤两次后，在40倍的荧光显微镜下观察肿瘤细胞凋亡和胶质瘤细胞分化成正常星形胶质细胞情况(凋亡细胞经DAPI染色后为亮蓝色，正常星形胶质细胞经GFAP染成为绿色)。实验结果证明：大豆素(50.0μM)诱导胶质瘤U251细胞凋亡并促使胶质瘤细胞向正常星形胶质细胞分化成(附图19)。Western blot分析表明：U251细胞对照组没有GFAP表达，而大豆素处理的U87-MG细胞药物组有GFAP表达，而且表达水平随药物浓度增加而升高(附图19)。

实施例8组合物促使胶质瘤细胞向正常星形胶质细胞分化

用实施例7的同样方法观察组合物诱导胶质瘤细胞向正常星形胶质细胞分化。实验结果表明:组合物(15微克/毫升)可促使胶质瘤C6和U251细胞向正常星形胶质细胞分化。附图20A显示胶质瘤C6、U251细胞和正常星形胶质细胞的形态特征；附图20B显示组合物诱导胶质瘤U251细胞分化的正常星形胶质细胞经GFAP荧光染色成绿色。

Claims

1.一种抗脑胶质瘤的含有米氏海参皂苷A的组合物，其特征在于，所述组合物由米氏海参总皂苷和大豆异黄酮总甙元组成，米氏海参总皂苷和大豆异黄酮总甙元的组成比例为1:2-5，所述的米氏海参总皂苷由化合物1：米氏海参皂苷A、化合物2：海参素甲、化合物3：海参素乙和化合物4：24-脱氢棘辐肛参苷B四种化合物组成，四种成分的比例为米氏海参皂苷A:海参素甲:海参素乙:24-脱氢棘辐肛参苷B＝2:1:4-6:1克，

化合物1-4的化学结构式分别为：

所述的大豆异黄酮总甙元由化合物5：大豆素和化合物6：染料木素组成，大豆素与染料木素的比例为1:1，化合物5和化合物6的化学结构式为：

2.根据权利要求1所述的一种抗脑胶质瘤的含有米氏海参皂苷A的组合物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

(1)米氏海参总皂苷的提取分离纯化：

将冷冻的米氏海参切成小块，用甲醇渗漉提取，甲醇渗漉液合并后经减压浓缩得到浓缩的甲醇提取液，浓缩的甲醇提取液先后用环己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液并经减压浓缩得到正丁醇萃取物浸膏，将正丁醇萃取物浸膏溶于水中，水溶解物经大孔树脂柱层析分离，分别用10％甲醇水和80％甲醇水依次洗脱，合并80％甲醇洗脱液并经减压浓缩得到粗总皂苷组分，将粗总皂苷溶于水中经反相ODS柱层析分离，先用30％甲醇水洗脱，再用70％甲醇水洗脱，每300毫升1份，分段收集70％甲醇水洗脱液，各收集组分中所含有的皂苷用反相硅胶薄层层析，甲醇/水，70:30，10％硫酸105℃加热显色检测,将显紫红色斑点含有皂苷的组分合并,减压浓缩得到米氏海参总皂苷；

(2)大豆异黄酮总甙元的制备：

将粉碎的大豆用甲醇渗漉提取，甲醇渗漉液合并后经减压浓缩得到五分之一体积的甲醇提取液，浓缩的甲醇提取液用环己烷萃取，去脂的甲醇提取液减压浓缩得到甲醇浸膏，去脂的甲醇浸膏溶于二甲基亚砜，二甲基亚砜溶液经大孔树脂柱层析分离，分别用10％甲醇水和90％甲醇水洗脱，收集90％甲醇水洗脱液并减压浓缩得到大豆总异黄酮粗品，大豆总异黄酮粗品用1N盐酸在80～90℃条件下水解3～6小时，用1N氢氧化钠中和至pH6-8，水解液经大孔树脂柱层析分离，分别用10％甲醇水和90％甲醇水依次洗脱，收集90％甲醇洗脱液，减压浓缩得到大豆异黄酮总甙元粗品，大豆异黄酮总甙元粗品经反相ODS柱层析分离，先用10％甲醇水洗脱，再用70％甲醇水洗脱，分段收集70％甲醇水洗脱液，用高效液相检测各组分，Cosmosil C₁₈色谱柱:250×10.0mm,5μm；流动相:乙腈/水40/60；检测波长265nm；流速为2.0mL/min，将t_R 11.70min含有大豆素和t_R 13.71min含有染料木素的各组分合并，减压浓缩得到异黄酮总甙元；

(3)含有米氏海参皂苷A的组合物的制备：

将米氏海参总皂苷和大豆异黄酮总甙元以1:2～5的比例混合而得到含有米氏海参皂苷A的组合物。

3.根据权利要求2所述的一种抗脑胶质瘤的含有米氏海参皂苷A的组合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述大孔树脂柱层析大孔树脂用量与样品量的比例是10～30毫升：1克；所述的反相ODS柱层析ODS的用量与样品量的比例是30～60克：1克。

4.根据权利要求2所述的一种抗脑胶质瘤的含有米氏海参皂苷A的组合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的大豆总异黄酮粗品与1N盐酸的用量比是1克:2～5mL；所述大孔树脂柱层析大孔树脂用量与样品量的比例是10～30毫升：1克；所述的反相ODS柱层析ODS的用量与样品量的比例是30～60克:1克。

5.一种含有米氏海参皂苷A的组合物在制备治疗脑胶质瘤药物中的应用，其中含有米氏海参皂苷A的组合物如权利要求1所述。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为含有米氏海参皂苷A的组合物单独或与其他药物或有效成分一起，与药学上可接受的赋形剂制成。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物的制剂形式为液体制剂、固体制剂。