CN110476951B - 肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 - Google Patents

肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备方法，本发明同时还提供了一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质。本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液，在精液降温、冷冻保存和解冻过程中对精子起到保护作用，减少损伤，明显提高了山羊冷冻精液的精子活力和顶体的完整率。

Description

肝素钠用于制备山羊精子冷冻保存用稀释液的应用及制备 方法
技术领域
本发明属于动物生物技术领域，涉及动物繁殖技术，尤其涉及肝素钠用于制备山羊精液保存用稀释液的应用及制备方法。
背景技术
精液冷冻保存是动物生物技术体系中的关键环节之一，主要解决精液长期稳定保存的问题。通过精液的人工采集和长期保存，实现动物生产的精液能够跨时间、跨地域、多种方式的被利用，从而极大提高了雄性动物在实际生产和科学研究领域中的使用价值。例如在动物育种领域，对于育种值估计、种质资源保护、品种改良、新品种育成、实现工厂化规模化养殖等方面，以及降低生产成本和提高经济效益具有重要意义。
研究表明，精子在降温和冷冻保存的过程中，很容易产生各种损伤，包括物理性的、化学性的和生物性的损伤。与新鲜精液相比较，经冷冻/解冻处理的精液，其精子的成活率、精子活力、顶体完整率、线粒体活性和受胎率显著下降，而山羊的精液更是如此，这对于生产实践和科学研究来说是极其不利的因素。尽管山羊精液的冷冻保存技术已经有了长足的发展，但目前仍然存在精液经冷冻-解冻处理后精子活力不高的问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷或者不足，本发明提供了一种肝素钠用于制备山羊精子保存用稀释液的应用及制备方法。
本发明同时还提供了一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所提供的山羊精子冷冻保存用稀释液用于保存山羊精子，包括肝素钠。
具体的，一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括肝素钠、营养物质以及抗菌物质。
优选的，一种山羊精子冷冻保存用稀释液，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括肝素钠、营养物质、缓冲物质、冷冻保护剂以及抗菌物质。
更优选的，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括肝素钠、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
此外，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7。
本发明所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠0.25-1.25g，柠檬酸0.75-6g，碳酸氢钠0.062-0.5g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖0.5-4g，卵磷脂0.125-1g，二甲基亚砜6-30mL，乙二醇6-30mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.07-0.56g，链霉素0.06-0.48g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取肝素钠0.002-0.008g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
更具体的，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖2.25g，卵磷脂0.53g，二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取肝素钠0.005g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。本发明的有益效果是：
本发明的山羊精液冷冻保存用稀释液，精液经冷冻-解冻处理后，精液的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到45.39±1.91％，53.68±1.87％和48.67±2.32％，与对比例不添加肝素钠的山羊精液冷冻保存用稀释液相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
肝素钠(Heparin sodium)是一种硫酸氨基葡萄糖钠盐，已有的临床研究表明，肝素钠能干扰血凝过程的许多环节，在体内外都有抗凝血作用。其作用机制比较复杂，主要通过与抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)结合而增强后者对活化的凝血因子的抑制作用，其后果涉及阻止血小板凝集和破坏、妨碍凝血激活酶的形成、阻止凝血酶原变为凝血酶，从而妨碍纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而发挥抗凝作用。
然而，经发明人的偶然发现，山羊精液冷冻保存用稀释液中偶然加入肝素钠后，在精液降温、冷冻保存和解冻过程中对精子会起到一定的保护作用，但是初期的研究没有获得较高的保护效果。分析可能是由于肝素钠的添加量或者稀释液中其他成分的相互作用导致保护效果并不好。经不断的实验研究，发现目前的配方条件下，包括配方中的组分以及组分的含量范围，能到有效减少损伤，明显提高了山羊冷冻精液的精子活力和顶体的完整率。
后期经过一系列的研究，能够证明山羊精液在冷冻过程中，肝素钠对精子起到保护作用，但是具体的保护机理目前还不明确，还处在进一步探究中。
另外，为保证效果，本发明的用于山羊精液冷冻保存的稀释液，应现用现配。本发明的山羊精液保存用稀释液，包括柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠(三者共同起到维持渗透压以及酸碱调节作用)、果糖(作为能源，主要作用是补充精子能量，也是一种简单的稀释剂)、卵磷脂(具有类似卵黄中具有抗低温打击保护能力的主要功能性成份)、二甲基亚砜、乙二醇(均作为冷冻保护剂)青霉素、链霉素(均作为抑菌物质)和肝素钠。
为了说明上述各实施例中山羊精子冷冻保存用稀释液对山羊精液的保存效果，发明人对精子的活率、顶体完整率和质膜完整率进行了观测，随机抽取10支细管冻精，37℃水浴20s解冻。取10μL精液，置于全自动精子质量分析仪的样品池中，观测精子的活率、顶体完整率和质膜完整率。同时，为了确定肝素钠以及与肝素钠配比的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释液中的最适添加浓度，实施例共设置5组，每组中肝素钠以及与肝素钠配比的其他成分在山羊精子冷冻保存用稀释液中的添加浓度均不同。同时，为进一步说明肝素钠的在山羊精子冷冻保存用稀释液所起到的有益效果，特与各对比例的效果加以对比。
实施例1：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.50g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取肝素钠0.008g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，D液即是添加肝素钠的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
山羊精液的制备：
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精:
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例1：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.50g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中保存。
实施例2：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量取二甲基亚砜30mL，乙二醇30mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取肝素钠0.002g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，即添加肝素钠的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例2：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠0.25g，柠檬酸0.75g，碳酸氢钠0.062g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量取二甲基亚砜30mL，乙二醇30mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平准确称取青霉素0.56g，链霉素0.48g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中保存。
实施例3：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳酸氢钠0.5g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取肝素钠0.002g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，即添加肝素钠的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：
将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例3：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳酸氢钠0.5g，加50mL无菌的超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平准确称取果糖4g，卵磷脂1g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。
取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中保存。
实施例4：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液5 0mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：用分析天平精确称取肝素钠0.008g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，即添加肝素钠的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例4：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠2g，柠檬酸6g，碳酸氢钠0.5g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖0.5g，卵磷脂0.125g，准确量取二甲基亚砜6mL，乙二醇6mL，加A液5 0mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.07g，链霉素0.06g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。
取(4)检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中保存。
实施例5：
本实施例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括肝素钠、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g，准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液。
(4)制备D液：精确量取肝素钠0.005g，加入C液50mL充分溶解，定容至100mL，得到所谓D液，即添加肝素钠的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。取检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入D液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中长期保存。
对比例5：
本对比例提供一种山羊精子冷冻保存用稀释液，包括果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素。
上述山羊精子冷冻保存用稀释液的制备，包括如下步骤：
(1)配制A液：用分析天平精确称取柠檬酸三钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌超纯水溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓A液。
(2)配制B液：用分析天平精确称取果糖2.25g，卵磷脂0.53g，准确量取二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓B液。
(3)配制C液：用分析天平精确称取青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，用1mol/L氢氧化钠或者1mol/L盐酸调pH至7，定容至100mL，得到所谓C液，即对比例的山羊精子冷冻保存精液稀释液。
(4)将新采集的山羊精液用4层消毒纱布过滤，除去胶状物，37℃下检测精液的精子密度、精子活率，将密度大于2×109个/mL，且活率大于0.8的精液定为合格精液。
取(4)检测合格的山羊精液5mL，加入A液20mL，充分混匀，1000转/min离心5min，弃上清液，缓慢加入C液，混匀，使精子密度为900万/mL左右，得稀释山羊精液。将所得的稀释山羊精液，用10层纱布包裹在17℃平衡1h，再转到4℃平衡1h。
制备奶山羊冷冻精液细管冻精：将稀释平衡后的精液在4℃下吸入0.25mL的细管中，用聚乙烯醇粉封口后，置于程序冷冻仪中，以1℃/min的速率从4℃缓慢降至-5℃，迅速置于距离液氮表面4cm的冷冻架上，熏蒸10min，再将细管投入到液氮中保存。
实施例与对比例的试验效果如下：
实施例1效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是43.23±1.82％，51.12±1.78％和46.35±2.21％。统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了34.59±1.31％，顶体完整率提高了11.79±1.04％，质膜完整率提高了21.14±1.16％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例2效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是38.91±1.64％，46.01±1.60％和41.72±1.99％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了36.27±1.18％，顶体完整率提高了13.18±0.94％，质膜完整率提高了22.66±1.05％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例3效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是35.02±1.47％，41.40±1.44％和37.54±1.79％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了33.79±1.06％，顶体完整率提高了11.13±0.84％，质膜完整率提高了20.43±0.94％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例4效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是39.12±1.64％，46.26±1.61％和41.95±2.00％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了34.23±1.19％，顶体完整率提高了11.49±0.94％，质膜完整率提高了20.82±1.05％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
实施例5效果：
精子的活率、顶体完整率和质膜完整率的观测结果如下：实施例组的精子的活率、顶体完整率和质膜完整率分别是45.39±1.91％，53.68±1.87％和48.67±2.32％，统计分析结果表明，实施例组与对比例组相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，其中实施例组的精子活率比对比例组提高了36.24±1.38％，顶体完整率提高了12.35±1.09％，质膜完整率提高了22.15±1.22％。由此表明，本发明所公布的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
如各实施例和不添加肝素钠的各对比例所示，实施例组与对比例组相比精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)，由此表明，本发明添加肝素钠的的稀释液对于山羊精子的冷冻保存，具有良好的效果。
如实施例1和实施例4所示，具有同样含量肝素钠的山羊精子冷冻保存用稀释液，均能显著提高精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，但是实施例1的效果优于实施例5，说明肝素钠的添加量并不是越多越好，其与山羊精子冷冻保存用稀释液中的其他成分有一个最佳的适配范围，只有配方中各组分处在适配范围，才能起到最大效果。
通过以上结果可以得出，本发明稀释粉配方中添加0.002-0.008g的肝素钠能显著延长精子有效保存时间，提高精子的活率、顶体完整率和质膜完整率，其中添加0.005g的肝素钠效果更好，精液经冷冻-解冻处理后，精液的精子活率、顶体和质膜完整率分别可以达到45.39±1.91％，53.68±1.87％和48.67±2.32％，与对比例不添加肝素钠的山羊精液冷冻保存用稀释液相比，精子的活率、顶体完整率和质膜完整率差异显著(p<0.05)。
进一步，为了说明本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山羊的各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，特设置了实施例6：
实施例6：
本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液对多个品种的山羊的各个年龄阶段精液冷冻保存均具有良好的效果，试验已经对不同年龄段的陕西关中奶山羊、不同年龄段的黑山羊以及黄羊的精液冷冻保存效果均进行了验证，试验方法同上(不做详述)，结果表明：本发明的山羊精子冷冻保存用稀释液，能有效提高解冻后精液的精子活率、顶体完整率，降低精子畸形率，提高奶山羊冻精生产效率冻精品质。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (1)

1.一种山羊精子冷冻保存用稀释液，其特征在于，所述的山羊精子冷冻保存用稀释液包括肝素钠、果糖、柠檬酸三钠、柠檬酸、碳酸氢钠、卵磷脂、二甲基亚砜、乙二醇、青霉素和链霉素；
所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的pH值为7；
所述的山羊精子冷冻保存用稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将柠檬酸钠1.25g，柠檬酸3.35g，碳酸氢钠0.28g，加50mL无菌水溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到A液；
(2)将果糖2.25g，卵磷脂0.53g，二甲基亚砜18mL，乙二醇18mL，加A液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到B液；
(3)将青霉素0.25g，链霉素0.25g，加B液50mL溶解，调节pH至7后定容至100mL，得到C液；
(4)取肝素钠0.005g，加入C液50mL溶解后定容至100mL，即得到山羊精子冷冻保存用稀释液。
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