CN115517242A - 一种猪精冷冻保存试剂盒及其应用 - Google Patents

一种猪精冷冻保存试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪精冷冻保存试剂盒及其应用，该试剂盒包含猪冻精用冷冻稀释液Ⅰ、冷冻稀释液Ⅱ和解冻稀释液。其中冷冻稀释液Ⅰ为将海藻糖、新鲜鸡蛋蛋黄、青霉素以及链霉素溶于无菌水中所制备的稀释液；冷冻稀释液Ⅱ为将冷冻稀释液Ⅰ、甘油、Equex STM以及溶于乙醇的肉豆蔻酸溶液混匀制备的稀释液；解冻稀释液为将葡萄糖、柠檬酸三钠、Na2‑EDTA、碳酸氢钠、氯化钾、青霉素以及链霉素溶于无菌水中所制备的BTS（Betsville Thawing Solution）稀释液。该试剂盒可用于改善猪精冷冻保存的质量，提高优秀种猪的利用效率，具有显著的应用价值。

Description

一种猪精冷冻保存试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猪精冷冻保存试剂盒及其应用。
背景技术
在现代养猪生产中，人工授精(Artificial Insemination，AI)一直是最关键和应用最广泛的繁殖技术。在进行人工授精之前，猪精液可以保存在17℃的常温稀释液中，也可以长期冷冻保存。超低温冷冻保存是在精液中添加冷冻保护剂后保存在-79℃～-196℃的环境中。尽管冷冻保存是长期保存高质量猪精液的最有效的手段，但只有不到1％的人工授精是使用猪冷冻精液完成的。冻融过程造成的冷冻损伤是该技术使用受限的主要原因之一。冷冻损伤包括了对猪精子运动性、质膜和顶体完整性以及线粒体功能的有害影响。冷冻保存过程促进精子内活性氧(ROS)生成与脂质过氧化，同时降低抗氧化水平，最终导致精子增加氧化应激与凋亡反应。
近年来，我国学者为了改进猪精冷冻保存方法做出了许多努力。目前在猪冷冻精液制作过程中多使用葡萄糖-蛋黄-甘油的组合作为基础稀释液，但其冷冻保护效果有限，无法增强猪精的抗氧化能力。研究发现，在常温稀释液中添加抗氧化物能够显著提高精子质量与受精能力，改善人工授精的胚胎发育状况。现有技术中有报道以解冻稀释液作为基础成分的冷冻稀释液配方。解冻稀释液不仅成分复杂，其中如Tris、柠檬酸钠、碳酸氢钠等物质也可能导致精子发生获能反应，不利于精子长期保存。因此，简化猪精液冷冻的抗冻剂配方并添加抗氧化物是提高猪冻精质量的有效手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪精冷冻保存试剂盒及其应用，试剂盒中包含猪冻精用冷冻稀释液Ⅰ、冷冻稀释液Ⅱ与解冻稀释液，为解决猪精子在冷冻保存过程中易发生活力下降等问题，提高种猪优质精子的保存质量和利用率，增加其应用价值。
为了达到上述目的，本发明提供了一种猪精冷冻保存试剂盒，包含冷冻稀释液Ⅰ、冷冻稀释液Ⅱ与解冻稀释液：
其中，冷冻稀释液Ⅰ为将100～110g的海藻糖、200mL的新鲜鸡蛋蛋黄、10～12万IU的青霉素以及100～140mg的链霉素溶于无菌水中并定容至1L所制备的稀释液；
冷冻稀释液Ⅱ为将271～273mL的冷冻稀释液Ⅰ、18mL的甘油、6～8mL的EquexSTM以及0.6mL的30～100mmol/L溶于乙醇的肉豆蔻酸溶液混匀制备的稀释液；
解冻稀释液为将37～40g的葡萄糖、2.95～3.05g的柠檬酸三钠、1.23～1.27g的Na2-EDTA、1.23～1.27g的碳酸氢钠、0.73～0.76g的氯化钾、10～12万IU的青霉素以及100～140mg的链霉素溶于无菌水中并定容至1L所制备的稀释液。
优选地，上述的冷冻稀释液Ⅰ为将100g的海藻糖、200mL的新鲜鸡蛋蛋黄、10万IU的青霉素以及100mg链霉素溶于无菌水中并定容至1L所制备而成。
优选地，上述的冷冻稀释液Ⅱ为将273mL的冷冻稀释液Ⅰ、18mL的甘油、6mL的EquexSTM以及0.6mL的30～100mmol/L溶于乙醇的肉豆蔻酸溶液混匀制备而成。
优选地，上述的解冻稀释液为将37g的葡萄糖、3g的柠檬酸三钠、1.25g的Na2-EDTA、1.25g的碳酸氢钠、0.75g的氯化钾、10万IU的青霉素以及100mg的链霉素溶于无菌水中并定容至1L所制备而成的稀释液。
优选地，上述的冷冻稀释液Ⅰ、冷冻稀释液Ⅱ与解冻稀释液的pH为7.0～7.5。
本发明还提供了一种猪精冷冻保存方法，包括以下步骤：
1)将采集的新鲜猪精液去除精浆后，用解冻稀释液进行等温等体积稀释混合后于17℃下进行保存；
2)将步骤1)中稀释后的精液在17℃预冷的冷冻高速离心机中以1300～1500rpm离心5～7分钟，去上清液，使用17℃预冷的冷冻稀释液Ⅰ重悬精子沉淀；
3)将步骤2)中重悬后的精液置于冰箱中隔水降温至4～5℃，或者置于程序冷冻仪中，以0.1℃/min的降温速率使精液从17℃降温至4～5℃，加入4℃预冷的冷冻稀释液Ⅱ等体积稀释混匀；
4)在4～5℃的条件下，将上一步稀释好的精液灌装至冻精细管中并封口；
5)将冻精细管置于含有纱布的架子上使用液氮熏蒸15～20min，细管距离液面3～5cm，温度控制在-140～-150℃，然后将冻精细管保存在液氮中。
本发明还提供了一种猪冻精解冻活力检测方法，包括以下步骤：
1)取出在液氮中保存的一支细管，在45～50℃水浴解冻10～12s，打开封口并置于37℃水浴预热的1.5mL离心管中，用注射器将精液吹入管中；
2)取50～60μL的精液加入至1mL的37～38℃预热的解冻稀释液中，于37～38℃孵育3～5min后通过CASA检测精子活力。
本发明提供的猪精冷冻保存试剂盒和猪精冷冻保存方法可应用于猪精冷冻保存中，尤其可用于改善猪精冷冻保存的质量，提高优秀种猪的利用效率。
本发明的猪精冷冻保存试剂盒及其应用，解决了猪精子在冷冻保存过程中易发生活力下降等问题，并具有以下优点：
本发明提供的试剂盒针对猪精子的常温处理、冷冻和解冻针对性开发了适宜的稀释液，海藻糖具备提高酶的抗氧化活性，保护精子免受ROS和膜脂质过氧化影响，肉豆蔻酸具有更高的抗氧化活性，具备提高精子的抗冻性，本发明通过添加适宜的上述有效成分制备的冷冻保存试剂盒可有效改善猪精冷冻保存的质量，提高优秀种猪的利用效率，具有显著的应用价值。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
1.解冻稀释液BTS(Betsville Thawing Solution)，配方为：按实物量计算：葡萄糖37g，柠檬酸三钠3g，Na2-EDTA 1.25g，碳酸氢钠1.25g，氯化钾0.75g，10万IU的青霉素、100mg的链霉素；按下述步骤进行配制：
步骤一：将葡萄糖、氯化钾、Na2-EDTA、碳酸氢钠、柠檬酸三钠、青链霉素溶液，用无菌水配制成1L水溶液。调整该稀释液pH至7.0；
步骤二：加入磁力搅拌子，置于37℃磁力搅拌器上混匀至充分溶解；
步骤三：用0.22μm除菌滤器进行过滤；
步骤四：使用前将经上述步骤所制备的解冻稀释液置于37℃水浴锅中预热，保证新鲜猪精或解冻精液在等温环境下稀释。
2.冷冻稀释液Ⅰ，各组分的配比是：冷冻稀释液Ⅰ：海藻糖100g、新鲜鸡蛋蛋黄200mL、青霉素10万IU、链霉素100mg；其配制方法按下述步骤进行：
步骤一：将海藻糖与青链霉素溶于无菌水中，使用移液器加入新鲜鸡蛋蛋黄，混匀后定容至1L；
步骤二：调整该稀释液pH至7.00。
3.冷冻稀释液Ⅱ，各组分的配比是：冷冻稀释液Ⅰ273mL，甘油18mL，Equex STM6mL，50mmol/L溶于乙醇的肉豆蔻酸溶液0.6mL，其配制方法按下述步骤进行：
步骤一：取273mL冷冻稀释液Ⅰ，使用移液器加入18mL甘油，反复颠倒混匀；
步骤二：使用移液器匀速缓慢吸取6mL常温Equex STM添加至上述溶液中，反复吹打至枪头中的Equex STM完全溶解，将溶液在水浴锅加热至37℃；
步骤三：精确称量1.142g肉豆蔻酸粉末，溶解在乙醇溶液中，定容至100mL，得到50mmol/L的肉豆蔻酸乙醇溶液：
步骤四：使用移液器吸取0.6mL的步骤三中所得的肉豆蔻酸乙醇溶液添加至步骤二中的稀释液，即为冷冻稀释液Ⅱ。
4.利用上述猪冻精冷冻稀释液进行猪精液冷冻保存，步骤如下：
步骤一：采集猪精液，使用纱布过滤掉精浆与其他杂质后记录猪精体积，加入等温等体积的解冻稀释液，在17℃的恒温箱中保存备用；
步骤二：将稀释的精液分装至15mL离心管中，使用17℃预冷的冷冻高速离心机中以1500rpm离心7分钟，去上清液，缓慢加入17℃预冷的冷冻稀释液Ⅰ重悬精子沉淀；
步骤三：将稀释后的精液置于冰箱中隔水降温至4～5℃，或者置于程序冷冻仪中，以0.1℃/min的降温速率使精液从17℃降温至5℃，期间每隔20min轻晃精液数次，防止精子假死。加入4℃预冷的冷冻稀释液Ⅱ等体积稀释混匀，在4℃继续平衡30min；
步骤四：在4～5℃的低温操作柜中将上一步稀释好的精液用自制注射器灌装至0.25mL冻精细管中并使用止血钳热封或封口粉封口，立即放到液氮上方3cm处含有六层纱布的架子上熏蒸15min，然后浸入液氮中保存。
5.应用四种不同的冷冻保存试剂对猪精进行冻存后进行活力检测比较
如下表1所示，其中的对照组为购买自“田园奥瑞”公司的商品猪精冻存试剂盒；海藻糖组为将本发明中冷冻稀释液Ⅱ中的Equex STM与肉豆蔻酸去除后制备而成；Equex STM组为将本发明中冷冻稀释液Ⅰ中的海藻糖替换为葡萄糖，并将冷冻稀释液Ⅱ中的肉豆蔻酸去除后制备而成；发明组即为本发明中的冷冻保存试剂盒。
使用上述四种试剂盒同时对5个批次的猪精按操作步骤进行冷冻保存并置于液氮中保存，用镊子取出在液氮中保存的一支细管，在50℃水浴锅中解冻12s，将水擦拭干剪断细管尾部的封口，后置于37℃水浴预热的1.5mL离心管中，再剪断细管头部，用自制注射器将精液吹入管中；吸取50μL精液加入1mL 37℃预热的解冻稀释液，在37℃金属浴中孵育5min；移液器吸取3μL解冻稀释后的精液，滴在一次性精子计数板上，随后通过CASA检测精子活力，并在程序内设定好猪精子对应的参数，记录测定数据。
使用市场购买的猪冻精试剂套装按说明书操作对猪精液进行冻存后，使用其稀释剂稀释解冻，同样用移液器吸取3μL解冻稀释后的精液，滴在一次性精子计数板上，随后通过CASA检测精子活力，并在程序内设定好猪精子对应的参数，记录测定数据。
四种不同试剂盒的试验测定结果和数据如下表1所示：
表1四种试剂盒冻存后精液解冻质量的对比
Figure BDA0003837070470000061
注：所有数据均表示为平均值±标准误，对照组为市场购买的猪冻精稀释剂处理结果，发明组为本发明的试剂盒处理结果。
结果表明，采用本试剂盒对猪精液进行冷冻保存，可显著改善猪精子的质量，具有潜在的应用价值。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种猪精冷冻保存试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含冷冻稀释液Ⅰ、冷冻稀释液Ⅱ与解冻稀释液：
其中，冷冻稀释液Ⅰ为将100～110g的海藻糖、200mL的新鲜鸡蛋蛋黄、10～12万IU的青霉素以及100～140mg的链霉素溶于无菌水中并定容至1L所制备的稀释液；
冷冻稀释液Ⅱ为将271～273mL的冷冻稀释液Ⅰ、18mL的甘油、6～8mL的Equex STM以及0.6mL的30～100mmol/L溶于乙醇的肉豆蔻酸溶液混匀制备的稀释液；
解冻稀释液为将37～40g的葡萄糖、2.95～3.05g的柠檬酸三钠、1.23～1.27g的Na2-EDTA、1.23～1.27g的碳酸氢钠、0.73～0.76g的氯化钾、10～12万IU的青霉素以及100～140mg的链霉素溶于无菌水中并定容至1L所制备的稀释液。
2.根据权利要求1所述的猪精冷冻保存试剂盒，其特征在于，所述的冷冻稀释液Ⅰ为将100g的海藻糖、200mL的新鲜鸡蛋蛋黄、10万IU的青霉素以及100mg链霉素溶于无菌水中并定容至1L所制备而成。
3.根据权利要求1所述的猪精冷冻保存试剂盒，其特征在于，所述的冷冻稀释液Ⅱ为将273mL的冷冻稀释液Ⅰ、18mL的甘油、6mL的Equex STM以及0.6mL的30～100mmol/L溶于乙醇的肉豆蔻酸溶液混匀制备而成。
4.根据权利要求1所述的猪精冷冻保存试剂盒，其特征在于，所述的解冻稀释液为将37g的葡萄糖、3g的柠檬酸三钠、1.25g的Na2-EDTA、1.25g的碳酸氢钠、0.75g的氯化钾、10万IU的青霉素以及100mg的链霉素溶于无菌水中并定容至1L所制备而成的稀释液。
5.根据权利要求1所述的猪精冷冻保存试剂盒，其特征在于，所述的冷冻稀释液Ⅰ、冷冻稀释液Ⅱ与解冻稀释液的pH为7.0～7.5。
6.一种猪精冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将采集的新鲜猪精液去除精浆后，用如权利要求1中所述的解冻稀释液进行等温等体积稀释混合后于17℃下进行保存；
2)将步骤1)中稀释后的精液在17℃预冷的冷冻高速离心机中以1300～1500rpm离心5～7分钟，去上清液，使用17℃预冷的如权利要求1中所述的冷冻稀释液Ⅰ重悬精子沉淀；
3)将步骤2)中重悬后的精液置于冰箱中隔水降温至4～5℃，或者置于程序冷冻仪中，以0.1℃/min的降温速率使精液从17℃降温至4～5℃，加入4℃预冷的如权利要求1中所述的冷冻稀释液Ⅱ等体积稀释混匀；
4)在4～5℃的条件下，将上一步稀释好的精液灌装至冻精细管中并封口；
5)将冻精细管置于含有纱布的架子上使用液氮熏蒸15～20min，细管距离液面3～5cm，温度控制在-140～-150℃，然后将冻精细管保存在液氮中。
7.一种猪冻精解冻活力检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取出在液氮中保存的一支细管，在45～50℃水浴解冻10～12s，打开封口并置于37℃水浴预热的1.5mL离心管中，用注射器将精液吹入管中；
2)取50～60μL的精液加入至1mL的37～38℃预热的如权利要求1中所述的解冻稀释液中，于37～38℃孵育3～5min后通过CASA检测精子活力。
8.如权利要求1中任意一项所述的猪精冷冻保存试剂盒在猪精冷冻保存中的应用。
9.如权利要求6所述的猪精冷冻保存方法在猪精冷冻保存中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的应用包含改善猪精冷冻保存的质量，提高优秀种猪的利用效率。
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