KR20210074852A - 아메로카나 난황 추출물을 유효성분으로 포함하는 정액 동결 보존용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아메로카나 난황 추출물을 유효성분으로 포함하는 정액 동결 보존용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 아메로카나 난황 추출물은 대조군인 회갈색재래 닭 난황 추출물에 비해 더 많은 콜레스테롤을 함유하며, 아메로카나 난황 추출물은 미리스틱산, 팔미토닉산, 스테아릭산, 리롤레익산, 감마리롤레익산, 리놀레닉산, 에이코세노익산의 함량이 대조군보다 더 많이 함유되어 있는 것에 반해, 정자에 직접 자극을 주어 정자의 장수성에 악영향을 끼치는 아라키도닉산의 함량이 낮다. 특히, 본 발명에 따른 아메로카나 난황 추출물을 함유한 정액 동결 보존용 조성물에서동결되고 이후 융해된 정자의 생존율은 77.5±4.2%이므로, 정자 동결에 효과적으로 적용할 수 있다.

Description

아메로카나 난황 추출물을 유효성분으로 포함하는 정액 동결 보존용 조성물{Composition for cryopreservating semen containing Amerokana egg yolk extract as an active ingredient}

본 발명은 아메로카나 난황 추출물을 유효성분으로 포함하는 정액 동결 보존용 조성물에 관한 것이다.

정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 품종의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 특히, 동결 과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다. 또한, 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 상기 희석액은 원 정액의 농도를 저하시켜서, 동결 보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위하여 사용된다.

특히, 소의 경우에는 육종을 위한 기초 기술로서 많은 연구를 통하여 동결 보존기술이 최적화되어 있는데, 소의 인공수정에는 활력있는 정자의 수가 2Х10⁶ 내지 4Х10⁶ 정도는 되어야 하는 것으로 알려져 있으며 최소 40% 이상의 정자가 생존하여야 인공수정으로 산자의 생산을 보증할 수 있다고 알려져 있다.

이러한 동결 보존(cryopreservation)은 실험 및 인공수정(artificial insemination, AI)을 위한 정자 세포의 유용성을 확장시킨다. 다양한 기술적 제약에도 불구하고, 정자에의 접근가능성은 인공수정 및 시험관내 수정(in vitro fertilization, IVF)의 발전을 가능케 하였다. 그러나, 동결-융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다. 이러한 변이는 저온에서 액상에서 겔상으로 변화하는 막에 의해 유도되며, 이는 동결 보존 시 정자의 생존력 및 수정능을 감소시키는 주된 원인 중 하나이다.

통상적으로, 막의 손상은 세포사멸에 대한 주요 원인 중 하나로 여겨지고 있다. 막의 주요 구성 요소인 콜레스테롤은 막 유동성 및 투과성의 주요 결정인자로 알려져 있으며, 막의 전이온도를 낮추고, 낮아진 온도에서 그들을 액상으로 유지시켜 저온에서 발생하는 막손상을 감소시킨다고 알려져 있다.

한편, 닭 중 아메로카나(Amerokana) 종계는 남아메리카 칠레 원산지의 아로카나(Arokana) 종계가 미국으로 도입된 후 척추의 미발달을 유도하여 꽁지깃을 없게 만드는 치사유전자를 없애고 푸른색 알(청색란)을 생산하도록 계량한 종이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 가축의 정자를 보다 효율적으로 동결 보존할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 아메로카나 난황 추출물을 포함하는 정액 동결 보존용 조성물을 이용할 경우, 종래의 희석액보다 정자를 효율적으로 동결보존할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 포함하는 용액을 첨가하여 추출한 아메로카나 닭 유래 난황 추출물을 유효성분으로 포함하는, 정액 동결 보존용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 a) 아메로카나 닭 유래 난황 및 염화나트륨 수용액을 교반하는 단계; b) 상기 염화나트륨 수용액과 교반된 아메로카나 닭 유래 난황에 SDS를 포함하는 용액을 첨가하여 추출한 후, 원심분리하고 상층액을 수득하여 난황 추출물을 제조하는 단계; 및 c) 상기 난황 추출물을 트릴라딜과 혼합하는 단계;를 포함하는, 정액 동결 보존용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 정액 동결 보존용 조성물에 정액을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는, 정액의 동결 보존방법을 제공하는 것이다.

이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 한편, 본 발명에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 포함하는 용액을 첨가하여 추출한 아메로카나 닭 유래 난황 추출물을 유효성분으로 포함하는, 정액 동결 보존용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "정액"이란, 수컷 동물의 생식 기관을 통해 배출된 액체를 의미하는데, 정자를 비롯하여 정자가 암컷 동물의 몸 속에서 이동하기 위해 필요한 여러 물질들로 구성되어 있다.

본 발명에서 용어, "정자"란, 정충이라고도 하고, 웅성동물의 고환에서 생산되는 성세포를 의미하는데, 길이는 약 0.02㎜이며, 머리, 경부 및 긴 꼬리의 세 부분으로 구성된다. 머리 부분에는 웅성 동물의 DNA가 들어 있고, 머리 부분의 맨 앞쪽에 존재하는 첨체에는 난자의 난막을 녹일 수 있는 효소가 포함되어 있고; 상기 경부에는 에너지 저장고인 당분을 함유한 미토콘드리아가 포함되어 있으며; 상기 꼬리는 가는 실 묶음으로 되어 있는데 가는 실 묶음이 교묘하게 신축하여 꼬리를 움직이게 한다.

본 발명에 있어서, 상기 정액은 포유동물의 정액일 수 있고, 구체적으로 칡소의 정액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "칡소"란, 몸에 검은색 줄무늬가 있는 한우 품종을 의미하며, 온 몸에 검은색 줄무늬가 있는 것이 특징이다.

본 발명에서 용어, "정액 동결"이란, 장기간에 걸쳐 정자를 안정하게 유지시키기 위해 정액을 냉동하는 것을 의미하며, 상기 동결은 동결 보존과 혼용하여 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 정액 동결은 칡소 정액의 동결을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "정액 동결 보존용 조성물"이란, 정액을 동결 보존하기 위한 용도로 사용되는 조성물을 의미한다. 본 발명에 따른 조성물은 정액 동결용 희석액으로써 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "정액 동결용 희석액"이란, 원 정액의 농도를 저하시켜서, 동결 보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위하여 사용된다. 상기 희석액은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 완충액일 수 있고, 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 덱스트란 등의 당류; 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 및 난황을 포함하는 완충액일 수 있으며, 이들 각성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.

상기 희석액은 동결보존제(cryoprotectant)와 혼합함으로써 동결보존액으로 제조하여 정액 동결에 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "동결보존제(cryoprotectant)"란, 동결보호제라고도 하고, 생물세포를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 매액(媒液)에 첨가시키는 물질을 의미하며, 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다.

본 발명에서 용어, "동결보존액"이란, 정액 동결용 희석액과 동결보존제가 혼합된 액상의 정액 동결보존용 제제를 의미한다. 상기 동결보존액은 본 발명의 정액 동결 보존용 조성물에 동결보존제를 추가로 포함하여 구성할 수 있다.

본 발명에서 용어. "아메로카나 닭"이란, 닭 중 아메로카나(Amerokana) 종계를 의미하며, 남아메리카 칠레 원산지의 아로카나(Arokana) 종계가 미국으로 도입된 후 척추의 미발달을 유도하여 꽁지깃을 없게 만드는 치사유전자를 없애고 푸른색 알(청색란)을 생산하도록 계량한 종이다.

본 발명에서 용어, "난황"이란, 새나 물고기 같은 난생 동물의 알에 포함되어 있는 영양 물질로서, 달걀을 깨면 나오는 노른자위가 매우 대표적인 사례이다.

본 발명에 있어서, 상기 난황은 아메로카나 닭이 낳은 알의 난황일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 아메로카나 닭이 낳은 알의 난황은 아메로카나 난황으로 명명될 수 있다.

본 발명에서 용어, "추출물"이란, 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물에 더하여, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 이들의 조정제물, 정제물 등 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 제조 가능한 모든 제형의 물질을 포함할 수 있다.

상기 추출물을 제조하기 위한 추출방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 추출 온도는 당업자가 추출 방법에 적절한 다양한 온도 범위를 채택할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 또한, 추출시간은 추출방법에 따라 상이하며, 당업자가 적절한 추출시간을 채택할 수 있으며, 단회 또는 복수회로 수행될 수 있다. 상기 1차 추출 용매로 추출을 수행하여 얻어진 추출물은 통상의 방법에 따라 여과하여 불순물을 제거한 액상 형태로 얻거나, 얻어진 액상 형태의 추출물을 통상의 방법에 따라 감압농축 및/또는 건조하여 분말 형태로 얻을 수 있다. 또한, 상기 추출공정은 필요에 따라, 유효성분의 함량이 높은 분획을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "난황 추출물"이란, 특정 용매를 이용하여 난황의 유효성분을 추출한 결과물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 난황 추출물은 아메로카나 난황의 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 아메로카나 난황의 추출물은 아메로카나 난황 추출물로 명명될 수 있다.

상기 아메로카나 난황 추출물은 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 포함하는 용액을 첨가하여 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 SDS를 포함하는 용액은 이?o스 STM 페이스트(equex STM paste)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어, "이?o스 STM 페이스트(eqeux STM paste)"란, 미국 Nova chemicals에서 제조 판매하는 액상의 복합 계면활성제 제제를 의미하며, 주요성분으로 세포독성이 낮은 SDS(SodimDocecylSulphate) 등을 포함한다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 아메로카나 난황 추출물은 염화나트륨 수용액과 교반된 아메로카나 난황에 이?o스 STM 페이스트를 첨가하여 제조하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 이?o스 STM 페이스트는 아메로카나 난황의 유화도를 증진시키며, 이로 인해 이?o스 STM 페이스트로 추출한 아메로카나 난황 추출물이 포함된 정액 동결 보존용 조성물은 아메로카나 난황이 포함된 정액 동결 보존용 조성물에 비해 우수한 정자 생존율을 나타낸다.

본 발명에 있어서, 아메로카나 난황 추출물 제조시 첨가되는 이?o스 STM 페이스트의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 염화나트륨 수용액과 교반된 아메로카나 난황의 전체 부피에 대하여 0.1 내지 1.0%(v/v)일 수 있고, 보다 구체적으로는 0.4%(v/v)일 수 있다.

상기 이?o스 STM 페이스트의 함량이 이보다 적은 경우에는 추출시 효과적이지 못하고, 함량이 이보다 많은 경우에는 계면활성제의 특성으로 인하여 이후 첨가되는 정자가 손상될 수 있어, 적절한 수준으로 포함되어야 한다.

본 발명에 있어서, 정액 동결 보존용 조성물에 첨가되는 아메로카나 닭 유래 난황 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 정액 동결 보존용 조성물 전체 부피에 대하여 5 내지 20 부피%(v/v)로 포함되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 10 부피%(v/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 아메로카나 닭 유래 난황 추출물의 함량이 이보다 적은 경우에는 정자의 동결 보존 효과가 저감될 수 있고, 함량이 이보다 많은 경우에는 동결 보존용 조성물의 침투를 방해하여 정자의 생존성이 낮아질 수 있다.

상기 정액 동결 보존용 조성물은 난황 희석액인 트릴라딜(triladyl)을 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 정액 동결 보존용 조성물에 첨가되는 난황 희석제는 트릴라딜 외에도 공지된 난황 희석액이라면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 난황 희석제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 정액 동결 보존용 조성물 전체 부피에 대하여 70 내지 95 부피%(v/v)일 수 있고, 보다 구체적으로는 90 부피%(v/v)일 수 있다.

상기 트릴라딜 희석제의 함량은 아메로카나 난황의 비율을 달리 첨가함에 따라 조절되며, 이에 추가로 동결 보호제를 첨가하여 정자의 동결 보존 효과를 상승시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 아메로카나 난황을 포함하는 동결 정액의 융해후 정자 생존율은 회갈색재래 닭 난황을 포함하는 동결 정액에 비해 낮았으나, 아메로카나 난황 추출물을 포함하는 동결 정액의 융해후 정자 생존율은 회갈색재래 닭 난황 추출물을 포함하는 동결 정액에 비해 높았다. 이는 이?o스 STM 페이스트를 이용하여, 콜레스테롤 함량이 높은 아메로카나 난황 추출물을 제조하고 이를 정액 동결 보존용 조성물에 포함함에 따른 시너지 효과에 의해 나타난 것으로 분석되었다. 특히, 이?o스 STM 페이스트를 이용하여 추출한 아메로카나 난황 추출물은 미리스틱산, 팔미토닉산, 스테아릭산, 리롤레익산, 감마리롤레익산, 리놀레닉산 및 에이코세노익산이 회갈색재래 닭 난황 추출물에 비해 더 많이 함유되어 있을 뿐만 아니라, 정자에 직접 자극을 주어 정자의 장수성에 악영향을 끼치는 것으로 알려져 있는 아라키도닉산의 함량이 낮아, 정자의 동결 보존에 유리하다.

본 발명에서 용어, "동결 정액"은 본 발명에 따른 정액 동결 보존용 조성물을 이용하여 동결시킨 정액을 의미한다.

본 발명의 다른 양태는 a) 아메로카나 닭 유래 난황 및 염화나트륨 수용액을 교반하는 단계;

b) 상기 염화나트륨 수용액과 교반된 아메로카나 닭 유래 난황에 SDS를 포함하는 용액을 첨가하여 추출한 후, 원심분리하고 상층액을 수득하여 난황 추출물을 제조하는 단계; 및

c) 상기 난황 추출물을 트릴라딜과 혼합하는 단계;를 포함하는, 정액 동결 보존용 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 단계 a)에서 상기 아메로카나 닭 유래 난황 및 염화나트륨 수용액은 1 내지 1 : 0.5 내지 2(v/v)로 첨가하여 교반하는 것일 수 있고, 구체적으로 1 : 1(v/v)로 교반하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 염화나트륨 수용액이 상기 비율보다 적게 첨가되는 경우 난황 추출물의 점도가 지나치게 높아져 정액 동결 효과가 감소될 수 있고, 상기 비율보다 많이 첨가되는 경우 점도가 지나치게 낮아져 정액 동결 효과가 감소될 수 있다.

상기 단계 b)에서 상기 SDS를 포함하는 용액은 이?o스 STM 페이스트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단계 b)에서 상기 염화나트륨 수용액과 교반된 아메로카나 닭 유래 난황에 이?o스 STM 페이스트 첨가시, 이?o스 STM 페이스트를 난황 전체 부피에 대하여 0.1 내지 1.0 부피%(v/v)로 첨가하는 것일 수 있고, 구체적으로 0.4 부피%(v/v)를 첨가하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 이?o스 STM 페이스트의 함량이 상기 범위를 벗어나는 경우, 전술한 문제점이 발생할 수 있다.

상기 단계 b)에서 상기 난황 추출물은 이?o스 STM 페이스트 첨가 후 30분 내지 2시간, 구체적으로 1시간 동안 추출하여 제조하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 시간 범위보다 짧은 시간 추출하는 경우에는 난황의 유효성분이 충분이 추출되지 않을 수 있고, 긴 시간 추출하는 경우에는 난황 유래 오염균이 증식할 위험성이 있을 수 있다.

상기 단계 c)에서 상기 난황 추출물 및 트릴라딜은 정액 동결 보존용 조성물 전체 부피에 대하여 각각 5 내지 20 부피%(v/v) 및 70 내지 95 부피%(v/v)로 포함될 수 있고, 구체적으로 10 부피%(v/v) 및 90 부피%(v/v)로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 난황 추출물 및 트릴라딜의 함량이 상기 범위를 벗어나는 경우, 전술한 문제점이 발생할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 정액 동결 보존용 조성물에 정액을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는, 정액의 동결 보존방법을 제공한다.

상기 정자의 수는 정액 동결 보존용 조성물 단위부피(㎖)당 1Х10⁷ 내지 9Х10⁷개일 수 있고, 구체적으로는 8Х10⁷ 내지 9Х10⁷개, 보다 구체적으로는 8Х10⁷개일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 동결 및 보존은 정자를 동결 보존할 수 있는 한 공지된 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 액화질소를 사용하여 -190 내지 -200℃, 구체적으로 -196℃에서 동결 및 보존을 수행할 수 있고, 상기 동결된 정자는 반영구적으로 보존할 수 있다.

본 발명의 동결 보존방법으로 보존된 정액은 상기 동결 보존된 정액을 융해시켜서 사용할 수 있다.

이때, 상기 동결된 정액을 융해시키는 방법은 상기 동결 보존된 정액을 정상 상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있는데, 구체적으로는 동결 보존된 정액을 상온에서 일정시간 동안 정치시킴으로써 상기 정액에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하거나 또는 제거하지 않고, 정액을 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 40℃의 물에 10 내지 1분 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 동결 보존된 정액을 4℃의 물에 5분 동안 침지하거나, 37℃의 물에 1분 동안 침지하거나, 70℃의 물에 3초 동안 침지하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에서는 동결 보존된 정자를 37℃의 물에 1 분 동안 침지하여 융해하였으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 방법으로 제조된 동결 정액은 융해후 정자 생존율이 73% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 아메로카나 난황 및 이의 추출물은 대조군인 회갈색재래 닭 난황 및 이의 추출물에 비해 더 많은 콜레스테롤을 함유하며, 아메로카나 난황 추출물은 미리스틱산, 팔미토닉산, 스테아릭산, 리롤레익산, 감마리롤레익산, 리놀레닉산, 에이코세노익산의 함량이 대조군보다 더 많이 함유되어 있는 것에 반해, 정자에 직접 자극을 주어 정자의 장수성에 악영향을 끼치는 아라키도닉산의 함량이 낮다. 특히, 본 발명에 따른 아메로카나 난황 추출물을 함유한 정액 동결 보존용 조성물에서동결되고 이후 융해된 정자의 생존율은 77.5±4.2%이므로, 정자 동결에 효과적으로 적용할 수 있다.

도 1은 회갈색재래 닭의 난황(G-EY)과 아메로카나 닭의 난황(A-EY)을 포함하는 동결 정액의 정자 생존율을 나타낸 도이다.
도 2는 회갈색재래 닭의 난황추출물(G-EYP)과 아메로카나 닭의 난황 추출물(A-EYP)을 포함하는 동결 정액의 정자 생존율을 나타낸 도이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예1. 아메로카나 난황을 포함하는 동결 정액의 정자 생존율 검정

아메로카나 닭에서 유래한 난황 또는 대조군인 회갈색재래 닭에서 유래한 난황 각각 20%를 난황 희석액인 트릴라딜(triladyl)에 혼합하여 정액 동결 보존용 조성물을 제조하였다.

제조한 각 조성물로 실시예 1에서 회수한 정액에 대하여 1:1(v/v) 희석을 반복하여 원하는 농도로 희석하였다. 칡소 정액의 정자 농도를 8Х10⁷개/ml(전체 조성물 당)이 되도록 희석하고 2~3시간에 걸쳐 22~27℃에서 5℃로 저온 중탕법으로 냉각시켰다. 스티로폼을 활용한 간이동결방법으로 정자를 동결하였으며 액체질소(liquid nitrogen) 표면 위 5cm에서 10 분간 노출시켜 예비동결을 실시하고 액체질소에 침지시켜 동결한 후 액체질소에서 보존하였다.

정자의 생존율은 동결한 정자를 37℃의 물에1 분간 침지하여 융해한 후, 융해된 정액을 10배 또는 20배 대물 랜즈을 장착한 현미경하에서 관찰하여 움직임이 있는 생존 정자수를 마클러챔버(Markler chamber)를 사용하여 계수하고, 이로부터 정자 생존율을 산출하였다.

그 결과, 도 1과 같이 회갈색재래 닭 난황(G-EY)을 함유한 동결 정액의 융해후정자 생존율은 67.4±4.5%, 아메로카나 난황(A-EY)을 함유한 동결 정액의 융해후 정자 생존율은 54.8±6.8%로 나타나, 회갈색재래 닭 난황의 효과가 더 우수하였다. Student t-test에 의한 유의성 검증값은 0.022이었다.

상기 결과와 같이, 아메로카나 난황은 콜레스테롤 함량이 높은 것으로 알려진 청색란임에도 불구하고 이를 포함하는 동결 정액의 융해후 정자 생존율은 회갈색재래 닭에 비해 오히려 낮았다. 이에, 각 난황을 함유한 조성물을 현미경으로 확인한 결과, 아메로카나 난황의 조성물은 난황 미세알갱이의 형태가 회갈색재래 닭 보다 큰 것으로 관찰되었다. 즉, 이러한 현상은 아메로카나 난황이 희석제에 유화되는 정도가 회갈색재래 닭에 비해 낮기 때문인 것으로 추측되었다.

실시예 2. 아메로카나 난황 추출물을 포함하는 동결 정액의 정자 생존율 검정

실시예 1의 결과를 바탕으로 아메로카나 난황의 유화도를 증진시키기 위해, 세포독성이 낮은 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)가 주성분인 이?o스 STM 페이스트(equex STM paste, Nova Chemicals)를 첨가하여 난황 추출물을 제조하였다. 추출을 위해, 140mM NaCl 수용액(생리식염수)을 아메로카나 난황 또는 대조군인 회갈색재래 닭 난황과 1:1(v/v)로 교반하고 5분 후, 이?o스 STM 페이스트 0.4%를 첨가하여 1시간 동안 추출하였다. 추출액을 10,000 g로 45분 동안 원심분리하고 상층액을 회수하여 냉장보존하였다. 트릴라딜에 제조한 난황 추출액이 10%로 함유되도록 혼합하고, 이에 채정된 정자의 농도가 8Х10⁷개/ml(전체 조성물 당)이 되도록 혼합한 뒤실시예 1의 방법에 따라 간이동결하고, 융해후 정자 생존율을 확인하였다.

그 결과, 도 2와 같이 회갈색재래 닭 난황 추출물(G-EYP)을 함유한 동결 정액의 융해후 정자 생존율은 70.2±2.0%, 아메로카나 난황 추출물(A-EYP)을 함유한 동결 정액의 융해후 정자 생존율은 77.5±4.2%로 나타나, 아메로카나 난황 추출물의 효과가 더 우수하였다. Student t-test에 의한 유의성 검증값은 0.02이었다.

상기 결과와 같이, 실시예 1와 동일한 양의 정액을 첨가하였음에도 불구하고 실시예 1과 달리 아메로카나 난황 추출물을 포함하는 동결 정액의 융해후 정자 생존율이 회갈색재래 닭 보다 더 우수한 것을 확인하였다.

이는 이?o스 STM 페이스트를 이용하여 아메로카나 난황을 추출함에 따른 시너지 효과에 의해 나타난 것으로 분석되었다.

실시예 3. 아메로카나 난황 및 아메로카나 난황 추출물의 콜레스테롤 및 지방산 함량 분석

정액 동결 시 정자의 생존에 영향을 주는 난황의 성분은 막 성분에 침투하여 물리적인 안정성을 부여하는 콜레스테롤 및 지방구 마이셀 구조를 형성하는 지방산으로 알려져 있다. 이에, 실시예 1의 아메로카나 난황 및 대조군인 회갈색재래 닭 난황, 실시예 2의 아메로카나 난황 추출물 및 대조군인 회갈색재래 닭 난황 추출물에 대해 콜레스테롤 및 지방산 함량을 분석하였다.

콜레스테롤 분석을 위해, 시료 5 g에 60 % KOH/D.W.8 mL 및 반응용 알콜 40 mL(EtOH : MeOH : Isoproylacohol =90:5:5)을 넣고 수조에서 100℃로 0검화(비누화) 반응시켰다. 1시간 후 50℃로 냉각한 다음 반응용 알코올 60 mL을 냉각관을 통해 주입한 후 분액여두 500 mL에 옮기고 지방수기를 닦아주기 위해 벤젠(benzene) 50 mL를 2번 나눠서 분액여두로, 1N KOH 100 mL를 2번 나눠서 분액여두로 넣었다. 분액여두에서 1분간 진탕하고 1시간 동안 층분리한 후 하층을 제거하였다. 상층액에 0.5N KOH 20 mL을 주입하고 1시간 동안 강하게 진탕한 후 하층을 제거하였다. D.W.을 넣어서 수기를 진탕한 후 층분리를 1시간 이상 3번 반복, 상층액이 불투명에서 투명하게 변할 때까지 수행하였다. 벤젠층(상층)을 100 mL 지방수기에 탈수여과하여 농축한 후 IS(스쿠알렌 0.5164 g/500 mL, 1000ppm)를 핵산에 녹여 IS 2 mL로 매스업(mass up)하고 가스 크로마토그래피(HP-7890A, Agilent Technologies, USA)를 이용하여 분석하였다.

지방산 분석은 Folch 등(1957)의 방법에 따라 수행하였다. 구체적으로, 시료 50g과 클로로폼(chloroform) : 메탄올(methanol)(2 : 1) 용액 150 mL을 호모게나이저(homogenizer) 2500 rpm으로 균질하여 지질을 추출한 다음, 무수황산나트륨을 이용하여 수분을 제거하고 여과액을 50~55℃에서 농축하였다. 농축액 중 100 ㎕을 0.5N NaOH 용액 1 mL 를 가하여 100℃에서 20분간 가열한 후 30분간 방냉하였다. 이후, BF3-메탄올(methanol)를 2 mL 첨가하고 20분간 가열한 후 30분간 방냉하였다. 헵탄(heptane) 1 mL 와 NaCl 8 mL을 첨가한 후 상등액을 취하여 가스크로마토그래피(HP-6890, Agilent Technologies, USA)에 주입하여 지방산 조성 및 함량을 측정하였다.

콜레스테롤 분석 결과, 하기 표 1과 같이 아메로카나 난황(A)은 1121.9mg/100g, 회갈색재래 닭 난황(G)은 959.26mg/100g의 농도로 콜레스테롤을 함유하여, 아메로카나 난황은 일반 난황에 1.169배 더 많은 콜레스테롤을 함유하는 것을 확인하였다. 또한, 아메로카나 난황 추출물(ASTM)은 551.54mg/100g, 회갈색재래 닭 난황 추출물(GSTM)은 472.76mg/100g의 농도로 콜레스테롤을 함유하여, 아메로카나 난황 추출물의 콜레스테롤 함량이 약간 낮아졌으나 큰 차이가 없는 것으로 판단하였으며, 동결 정액의 융해후 정자 생존율은 아메로카나 난황 추출물에서 더 우수한 효과가 있으므로 아메로카나 난황 추출물 내 콜레스테롤의 활용도가 더 높다고 판단하였다.

A: Ameraucana egg yolk, ASTM: Ameraucana egg yolk plasm, G: Gray Brown Korean Native Chicken egg yolk, GSTM; Gray Brown Korean Native Chicken egg yolk plasma

지방산 분석 결과, 하기 표 2와 같이 아메로카나 난황 추출물(ASTM)은 미리스틱산, 팔미토닉산, 스테아릭산, 리롤레익산, 감마리롤레익산, 리놀레닉산 및 에이코세노익산이 회갈색재래 닭 난황 추출물(GSTM)에 비해 더 많이 함유되어 있으며, 팔미톨레익산, 오레익산 및 아라키도닉산의 함량은 낮은 것으로 확인되었다. 특히, 아라키도닉산은 정자에 직접 자극을 주어 정자의 장수성에 악영향을 끼치는 것으로 알려져 있으며 이러한 유효성분의 차이가 정자의 동결 보존에 유효한 것으로 판단하였다. 아메로카나 난황 추출물(ASTM)은 추출물로 제조되면서 포화지방산의 상대적 함량은 35.9%로 높아지고 불포화지방산의 함량은 64.1%로 낮아졌으며, 이는 정자의 동결 보존에 유효한 것으로 판단된다.

A: Ameraucana egg yolk, ASTM: Ameraucana egg yolk plasm, G: Gray Brown Korean Native Chicken egg yolk, GSTM; Gray Brown Korean Native Chicken egg yolk plasma

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

1. SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)를 포함하는 용액을 첨가하여 추출한 아메로카나 닭 유래 난황 추출물을 유효성분으로 포함하는, 정액 동결 보존용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 SDS를 포함하는 용액은 이?o스 STM 페이스트(equex STM paste)인, 정액 동결 보존용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 아메로카나 닭 유래 난황 추출물은 상기 정액 동결 보존용 조성물 전체 부피에 대하여 5 내지 20 부피%로 포함되는 것인, 정액 동결 보존용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 정액 동결 보존용 조성물은 트릴라딜(triladyl)을 더 포함하는 것인, 정액 동결 보존용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 정액은 칡소의 정액인, 정액 동결 보존용 조성물.
   
6. a) 아메로카나 닭 유래 난황 및 염화나트륨 수용액을 교반하는 단계;
   b) 상기 염화나트륨 수용액과 교반된 아메로카나 닭 유래 난황에 SDS를 포함하는 용액을 첨가하여 추출한 후, 원심분리하고 상층액을 수득하여 난황 추출물을 제조하는 단계; 및
   c) 상기 난황 추출물을 트릴라딜과 혼합하는 단계;를 포함하는, 정액 동결 보존용 조성물의 제조방법.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 단계 a)에서 상기 아메로카나 닭 유래 난황 및 염화나트륨 수용액은 1 : 0.5 내지 2(v/v)로 첨가하여 교반하는 것인, 정액 동결 보존용 조성물의 제조방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 단계 b)에서 상기 염화나트륨 수용액과 교반된 아메로카나 닭 유래 난황에 SDS를 포함하는 용액을 난황 전체 부피에 대하여 0.1 내지 1.0 부피%(v/v)로 첨가하는 것인, 정액 동결 보존용 조성물의 제조방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 단계 c)에서 상기 난황 추출물 및 트릴라딜은 정액 동결 보존용 조성물 전체 부피에 대하여 각각 5 내지 20 부피%(v/v) 및 70 내지 95 부피%(v/v)로 포함되는 것인, 정액 동결 보존용 조성물의 제조방법.
   
10. 제1항의 정액 동결 보존용 조성물에 정액을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는, 정액의 동결 보존방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 정자의 수는 정액 동결 보존용 조성물 단위부피(㎖)당 1Х10⁷ 내지 9Х10⁷개인, 정액의 동결 보존방법.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 동결 및 보존은 액화질소를 사용하여 -190 내지 -200℃에서 수행되는 것인, 정액의 동결 보존방법.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 방법으로 제조된 동결 정액은 융해후 정자 생존율이 73% 이상인, 정액의 동결 보존방법.

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