KR20160001454A

KR20160001454A - 앙콜 소 정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160001454A
Application number: KR1020140080018A
Authority: KR
Inventors: 김성우; 고응규; 도윤정; 변미정; 김재환; 성환후; 조영무
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2014-06-27
Publication date: 2016-01-06
Also published as: KR101821545B1

Abstract

본 발명은 글리세롤과 eqeux STM 페이스트를 포함하는 앙콜 소 정자의 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 앙콜 소 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 앙콜 소 정자의 동결보존 방법에 관한 것이다. 본 발명의 앙콜 소 정액의 동결보존용 조성물을 이용하면, 앙콜 소의 정자를 동결보존하여 인공수정 등의 다양한 방법으로 활용할 수 있으므로, 앙콜 소의 육종 및 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

앙콜 소 정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도{Composition for cryopreservating sperm of ankole cow and uses thereof}

본 발명은 앙콜 소 정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 글리세롤과 eqeux STM 페이스트를 포함하는 앙콜 소 정자의 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 앙콜 소 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 앙콜 소 정자의 동결보존 방법에 관한 것이다.

정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 품종의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 특히, 동결 과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다. 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 희석 과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다.

특히, 소의 경우에는 육종을 위한 기초 기술로서 많은 연구를 통하여 동결보존기술이 최적화되어 있는데, 소의 인공수정에는 활력있는 정자의 수가 2×10⁶ 내지 4×10⁶ 정도는 되어야 하는 것으로 알려져 있으며 최소 40% 이상의 정자가 생존하여야 인공수정으로 산자의 생산을 보증할 수 있다고 알려져 있다.

이러한 동결보존(cryopreservation)은 실험 및 인공수정(artificial insemination, AI)을 위한 정자 세포의 유용성을 확장시킨다. 다양한 기술적 제약에도 불구하고, 정자에의 접근가능성은 인공수정 및 시험관내 수정(in vitro fertilization, IVF)의 발전을 가능케 하였다. 그러나, 동결-융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다.

이같은 정자의 동결보존을 보다 효과적으로 수행하기 위하여 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개(WO) 01/037655호에는 사람, 소, 말, 돼지, 양 및 바이슨 정자와 같은 포유류 정자에 희석액을 가하고, 동결보존하는 단계를 포함하는 정자세포의 동결보존방법이 개시되어 있고, 한국특허등록 제427850호에는 소형개의 정액을 채취하여 완만동결 또는 초급속동결 방법으로 동결하고 액체질소통에 영구히 보존하면서 인공수정하는 방법이 개시되어 있다.

한편, 아프리카의 고유 품종으로서 더위에 적응해온 인 앙콜 소의 경우, 다른 소에서 성공적인 결과를 보고하고 있는 방법으로는 정액의 동결보존후 정자의 생존율이 30% 미만을 나타내었는데, 이는 인공수정을 통한 앙콜 소의 번식에 이용할 수 없을 뿐 아니라, 아프리카 고유품종의 유전자원을 영구적으로 보존하는데 있어 심각한 문제를 야기할 수 있다는 문제점이 제기되었으나, 상기 앙콜 소 정액의 동결보존기술에 대하여는 지금까지 전혀 연구되지 않았다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 앙콜 소의 정액을 동결보존할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 글리세롤과 eqeux STM 페이스트를 포함하는 앙콜 소 정자의 동결보존용 조성물을 이용하여 앙콜 소의 정액을 동결보존할 경우, 인공수정이 가능한 한계 생존율(40%) 이상의 정자 생존율을 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 글리세롤과 eqeux STM 페이스트를 포함하는 앙콜 소 정액의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 앙콜 소 정액에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 앙콜 소 정액의 동결보존방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 앙콜 소 정액을 동결보존할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 통상적인 동결보존제로 사용되어온 글리세롤에 주목하게 되었다. 통상적으로, 한우 또는 젖소의 정액을 동결보존할 경우에 사용되는 동결보존액에는 5.4 내지 7%의 글리세롤이 포함되어 있으며, 상기 동결보존액을 사용할 경우, 한우 또는 젖소 정자의 생존율이 70 내지 90%를 나타낸다고 공지되어 있으므로, 앙콜 소 정액을 동결보존하기에 적합한 동결보존액에 포함된 글리세롤의 농도를 확인한 결과 8% 이상의 글리세롤을 포함하는 동결보존액이 인공수정이 가능한 한계 생존율(40%) 이상의 정자 생존율을 나타냄을 확인하였다. 이에, 앙콜 소 정액의 동결보존 효율을 향상시키기 위하여, 상기 글리세롤의 효과를 보조할 수 있는 성분을 발굴하기 위하여 다양한 연구를 수행한 결과, eqeux STM 페이스트를 발굴하였다. 이에, 앙콜 소 정액의 동결보존에 대한, 글리세롤과 eqeux STM 페이스트의 조합효과를 검증한 결과, 8% 이상의 글리세롤과 0.4% 이상의 eqeux STM 페이스트를 포함하는 동결보존액을 사용할 경우, 앙콜 소 정액을 효과적으로 동결보존할 수 있음을 확인하였다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 글리세롤과 eqeux STM 페이스트를 포함하는 앙콜 소 정액의 동결보존용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "eqeux STM 페이스트(eqeux STM paste)"란 미국 Nova chemicals에서 제조 판매하는 액상의 복합 계면활성제 제제를 의미하는데, 주요성분으로서 SDS(sodim docecyl sulphate) 등을 포함한다. 본 발명의 앙콜 소 정액의 동결보존용 조성물에 상기 상기 eqeux STM 페이스트를 포함하면, 동결시 생성되는 얼음결정에 의한 세포손상을 억제할 수 있는데, 상기 조성물에 포함된 eqeux STM 페이스트의 함량이 너무 낮은 경우에는 동결보존시 별다른 효과를 나타내지 못하고, 함량이 너무 많은 경우에는 계면활성제의 특성으로 인하여 세포가 손상될 수 있어, 적절한 수준으로 포함되어야 한다.

본 발명에 있어서, 앙콜 소 정액의 동결보존용 조성물에 포함된 eqeux STM 페이스트의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 0.1 내지 1.5%(w/w)가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 0.3 내지 1%(v/v)가 될 수 있으며, 바람직하게는 0.4%(v/v)가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "앙콜 소(ankole cow)"란, 아프리카 토착종인 소를 의미하는데, 학명으로는 Ankole Longhorn로 표시된다. 대체로, 상기 앙콜 소는 아프리카 중서부지역인 빅토리아호수를 중심으로 사육되고 있으며, 기원전 7000년 전부터 사육되어온 품종임이 고고학적으로 증명되었는데, 아프리카에서 생존하기 적합하도록, 흡혈곤충에 대한 저항성이 있고, 열대성 질병과 가뭄에 대한 내성이 강하여 가혹한 환경에 대한 적응성이 우수하다는 장점이 있다. 이에 반하여, 도체율과 육질이 낮고, 우유생산량이 적다는 단점이 있으나, 이러한 단점을 개선하기 위한 지속적인 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명의 용어 "정액"이란, 수컷 동물의 생식 기관을 통해 배출된 액체를 의미하는데, 정자를 비롯하여 정자가 여성의 몸 속에서 이동하기 위해 필요한 여러 물질들로 구성되어 있다.

본 발명의 용어 "정자"란, 정충이라고도 하고, 정자는 웅성동물의 고환에서 생산되는 성세포를 의미하는데, 길이는 약 0.02㎜이며, 머리, 경부 및 긴 꼬리의 세 부분으로 구성된다. 머리 부분에는 웅성 동물의 DNA가 들어 있고, 머리 부분의 맨 앞쪽에 존재하는 첨체에는 난자의 난막을 녹일 수 있는 효소가 포함되어 있고; 상기 경부에는 에너지 저장고인 당분을 함유한 미토콘드리아가 포함되어 있으며; 상기 꼬리는 가는 실 묶음으로 되어 있는데 가는 실 묶음이 교묘하게 신축하여 꼬리를 움직이게 한다.

본 발명의 목적상 상기 정자는 앙콜 소의 정자를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "동결보존"이란, 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다.

본 발명의 목적상 상기 동결보존은 앙콜 소 정자의 동결보존을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "동결보존제(cryoprotectant)"란, 동결보호제라고도 하고, 생물세포를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 매액(媒液)에 첨가시키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 동결보존제는 가축의 정자를 동결보존하기 위하여 사용되며, 본 발명에서는 글리세롤과 eqeux STM 페이스트의 혼합물을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "동결보존용 조성물"이란, 본 발명의 동결보존제로 사용되는 글리세롤과 eqeux STM 페이스트의 혼합물을 포함하는 조성물을 의미한다.

본 발명의 용어 "동결보존액"이란, 본 발명의 동결보존용 조성물과 희석액이 혼합된 액상의 정자 동결보존용 제제를 의미한다. 상기 동결보존액은 본 발명의 동결보존용 조성물에 더하여 희석액을 추가로 포함하여 구성할 수 있다. 상기 희석액은 원 정액의 농도를 저하시켜서, 동결보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위하여 사용된다. 상기 희석액은 특별히 이에 제한되지 않으나, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 완충액이 될 수 있는데, 바람직하게는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 덱스트란 등의 당류; 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 및 난황을 포함하는 완충액이 될 수 있고, 이들 각성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 앙콜 소 정액을 동결보존하기 위하여 다양한 농도의 글리세롤을 포함하는 동결보존액을 제조하고, 상기 제조된 각 동결보존액을 이용하여 앙콜 소 정액을 동결보존한 후, 동결보존된 앙콜 소 정액에 포함된 정자의 생존율을 비교한 결과, 인공수정이 가능한 한계 생존율(40%)을 나타내기 위하여는 상기 동결보존액에 포함된 글리세롤의 함량이 적어도 8% 이상이어야함을 확인하였다(표 1). 또한, 상기 앙콜 소 정액의 동결보존에 대한 글리세롤의 효과를 보조하기 위한 eqeux STM 페이스트의 효과를 검증한 결과, 인공수정이 가능한 한계 생존율(40%)을 나타낼 수 있는 글리세롤의 함량(8%) 이상의 함량을 포함하고, eqeux STM 페이스트를 0.4% 이상의 함량으로 포함하는 앙콜 소 정액용 동결보존액을 사용할 경우에는 앙콜 소 정자에 대한 동결보존효과를 증진시킬 수 있음을 확인하였다(표 2).

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 상기 동결보존용 조성물을 포함하는 동결보존액에 앙콜 소 의 정액을 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 앙콜 소 정액의 동결보존방법을 제공한다.

상술한 바와 같이, 상기 동결보존용 조성물은 글리세롤과 eqeux STM 페이스트의 혼합물을 포함할 수 있고, 상기 조성물에 포함된 글리세롤의 조성물 최종 부피에 대하여 8 내지 10%(v/v)가 될 수 있고; 상기 조성물에 포함된 eqeux STM 페이스트의 함량은 0.4 내지 1.0%(v/v)가 될 수 있다.

또한, 상기 동결보존액에 포함되는 동결보존용 조성물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 1 내지 80%(w/w), 보다 바람직하게는 10 내지 50%(w/w), 가장 바람직하게는 30%(w/w)가 될 수 있다.

아울러, 상기 동결보존액은 본 발명의 동결보존용 조성물에 더하여, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, DMSO, 덱스트란, 1,2-프로판디올, 히알루론산 등의 공지된 동결보존제를 단독으로 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수도 있다.

한편, 상기 동결보존액에 포함되는 정자의 수는 바람직하게는 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 10⁶ 내지 7 X 10⁶개 이고, 보다 바람직하게는 단위부피(㎖)당 2 X 10⁶ 내지 4 X 10⁶개 이며, 가장 바람직하게는 단위부피(㎖)당 3 X 10⁶개 이다.

끝으로, 상기 동결 및 보존은 정자를 동결보존할 수 있는 한 공지된 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 액화질소를 사용하여 -196℃에서 동결 및 보존을 수행할 수 있고, 상기 동결된 정자는 반영구적으로 보존할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명의 동결보존방법으로 보존된 앙콜 소 정액은 상기 동결보존된 정액을 융해시켜서 사용할 수 있다.

이때, 상기 동결된 앙콜 소 정액을 융해시키는 방법은 상기 동결보존된 정액을 정상상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있는데, 바람직하게는 동결보존된 정액을 상온에서 일정시간 동안 정치시킴으로써 상기 정액에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 40℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 동결보존된 정액을 상온에서 10 내지 20초 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 4℃의 물에 5분 동안 침지하거나, 37℃의 물에 20초 동안 침지하거나, 70℃의 물에 3초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 20초동안 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 37℃의 온수에서 20초 동안 침지함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 앙콜 소 정액의 동결보존용 조성물을 이용하면, 앙콜 소의 정자를 동결보존하여 인공수정 등의 다양한 방법으로 활용할 수 있으므로, 앙콜 소의 육종 및 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 글리세롤을 이용한 앙콜 소의 정액의 동결보존

앙콜 소 정액용 동결보존액으로서 6, 8 또는 10%(v/v)의 글리세롤이 포함된 소 정액 희석액(Tris 30.25g/ℓ, Citric acid 17g/ℓ, Fructose 12.5g/ℓ 및 20%(v/v) 난황)을 제조하고, 이들 각 동결보존액에 앙콜 소 정액을 가하여 동결시킨 다음, 동결된 앙콜 소 정액을 37℃에서 1분간 융해시켰으며, 융해된 앙콜 소 정액을 현미경하에서 관찰하여 움직임이 있는 생존 정자수를 Markler chamber를 사용하여 계수하고, 이로부터 정자 생존율을 산출하였다(표 1).

글리세롤의 함량에 따른 앙콜 소 정자의 생존율

글리세롤 함량(%)	생존율(%)
6 8 10	21.2±8.9 42.1±10.3 60.2±7.6

상기 표 1에서 보듯이, 동결보존액에 포함된 글리세롤의 함량이 증가할 수록 동결 및 해동된 앙콜 소 정자의 생존율이 증가함을 알 수 있었고, 인공수정이 가능한 한계 생존율(40%)을 나타내기 위하여는 상기 동결보존액에 포함된 글리세롤의 함량이 적어도 8% 이상이어야 하며, 상기 동결보존액에 포함된 글리세롤의 함량이 10%인 경우, 가장 높은 생존율을 나타냄을 확인하였다.

통상적으로, 한우 또는 젖소의 정액을 동결보존할 경우에 사용되는 동결보존액에는 5.4 내지 7%의 글리세롤이 포함되어 있으며, 상기 동결보존액을 사용할 경우, 한우 또는 젖소 정자의 생존율이 70 내지 90%를 나타낸다고 공지되어 있다. 이러한 공지기술을 감안한다면, 앙콜 소 정액의 동결보존시에는 한우 또는 젖소의 정액을 동결보존할 경우보다도 더 높은 함량의 글리세롤이 포함된 동결보존액이 사용되어야 함을 알 수 있었다.

실시예 2: 글리세롤과 eqeux STM 페이스트의 혼합물을 이용한 앙콜 소의 정액의 동결보존

상기 실시예 1의 결과로부터, 한우 또는 젖소의 정액과는 달리, 앙콜 소 정액을 동결보존하기 위하여는 적어도 8% 이상의 글리세롤을 포함하는 동결보존액이 사용되어야 함을 확인하였으므로, 상기 앙콜 소 정액의 돌결보존을 위한 글리세롤의 효과를 보조할 수 있는 보조제로서 eqeux STM 페이스트의 효과를 검증하고자 하였다.

구체적으로, 인공수정이 가능한 한계 생존율에 미치지 못한 정자 생존율을 나타내는 6% 글리세롤을 포함하는 앙콜 소 정액용 동결보존액과, 가장 높은 정자 생존율을 나타내는 10% 글리세롤을 포함하는 앙콜 소 정액용 동결보존액에 앙콜 소 정액을 가하여 1차 희석액과, 상기 소 정액 희석액에 각각 0.6% 및 0.8%의 eqeux STM 페이스트(Nova Chemical Sales, Scituate Inc., MA, USA)를 가하여 제조한 2차 희석액을 각각 준비한 다음, 상기 1차 희석액과 각 2차 희석액을 1:1로 혼합하여 최종 eqeux STM 페이스트의 농도가 각각 0.3% 및 0.4%로 포함하는 앙콜 소 정액용 동결보존액을 수득하였다. 상기 수득한 각각의 개선된 앙콜 소 정액용 동결보존액을 동결시킨 다음, 동결된 앙콜 소 정액을 37℃에서 1분간 융해시켰으며, 융해된 앙콜 소 정액을 현미경하에서 관찰하여 움직임이 있는 생존 정자수를 Markler chamber를 사용하여 계수하고, 이로부터 정자 생존율을 산출하였다(표 2).

글리세롤과 eqeux STM 페이스트의 함량에 따른 앙콜 소 정자의 생존율

시료	생존율(%)
6% 글리세롤 + 0.3% STM 10% 글리세롤 + 0.4% STM	19.8±10.7 74.9±7.6

상기 표 2에서 보듯이, 6% 글리세롤을 포함하는 앙콜 소 정액용 동결보존액을 사용할 경우에는 eqeux STM 페이스트를 추가할 경우에도 인공수정이 가능한 한계 생존율(40%)까지 앙콜 소 정자 생존율이 증가하지 못하였고, 오히려 정자 생존율이 감소함(약 7%)을 확인하였다. 이에 반하여, 6% 글리세롤을 포함하는 앙콜 소 정액용 동결보존액을 사용할 경우에는 eqeux STM 페이스트를 추가함으로써 정자 생존율이 추가로 증가함(약 24%)을 확인하였다.

상기 결과로부터, 글리세롤을 포함하는 앙콜 소 정액용 동결보존액에 단순히 eqeux STM 페이스트를 첨가한다고 하여 앙콜 소 정자의 생존율이 증가하는 것은 아니라는 점을 알 수 있었다. 즉, 글리세롤이 앙콜 소 정액용 동결보존액에 첨가되어 앙콜 소 정자를 동결보존하는 효과를 나타낼 수 있으나, 상기 글리세롤의 함량 또는 eqeux STM 페이스트의 함량에 따라 앙콜 소 정자를 동결보존에 대한 eqeux STM 페이스트의 효과가 달라질 수 있음을 알 수 있었다.

다만, 인공수정이 가능한 한계 생존율(40%)을 나타낼 수 있는 글리세롤의 함량(8%) 이상의 함량을 포함하고, eqeux STM 페이스트를 0.4% 이상의 함량으로 포함하는 앙콜 소 정액용 동결보존액을 사용할 경우에는 앙콜 소 정자에 대한 동결보존효과를 증진시킬 수 있는 것으로 분석되었다.

Claims

글리세롤과 eqeux STM 페이스트를 포함하는 앙콜 소 정액의 동결보존용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 글리세롤의 함량은 조성물 최종부피에 대하여 8 내지 10%(v/v)인 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 eqeux STM 페이스트의 함량은 조성물 최종부피에 대하여 0.4 내지 1.0%(v/v)인 것인 조성물.
제1항에 있어서,
글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, DMSO, 덱스트란, 1,2-프로판디올, 히알루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 동결보존제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 동결보존용 조성물을 포함하는 동결보존액에 앙콜 소 정액을 혼합하는 단계; 및
(b) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 앙콜 소 정액의 동결보존방법.
제5항에 있어서,
상기 동결보존액에 포함된 동결보존용 조성물의 함량은 1 내지 80%(w/w)인 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 정자의 수는 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 10⁶ 내지 7 X 10⁶개인 것인 방법.
제5항에 있어서,
상기 동결 및 보존은 액화질소를 사용하여 -196℃에서 수행되는 것인 방법.