KR20160108280A - 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 통상적으로 사용되는 동결보존제에 더하여, 항산화제의 일종인 미세조류 유래의 아스타잔틴 또는 울금유래의 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 돼지 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 돼지 정자를 동결보존하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 돼지 정자 동결보존용 조성물을 이용하면, 우수한 품종의 돼지 정자의 동결보존시 돼지 정자의 손상을 최소화 할 수 있으므로, 돼지의 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물{Composition for cryopreservating boer sperm comprising astaxanthin or curcumin}
본 발명은 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 통상적으로 사용되는 동결보존제에 더하여, 항산화제의 일종인 미세조류 유래의 아스타잔틴 또는 울금유래의 커큐민을 포함하는 돼지 정자 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 돼지 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 돼지 정자를 동결보존하는 방법에 관한 것이다.
정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 품종의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 특히, 동결 과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다. 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 희석 과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다. 글리세롤은 세포에 독성이 있는 물질이고 특히, 돼지의 정자는 다른 가축 동물의 정자보다 외부 자극에 대한 감수성이 높기 때문에 글리세롤에 의해 쉽게 손상을 받을 수 있다.
이러한 동결보존(cryopreservation)은 실험 및 인공수정(artificial insemination, AI)을 위한 정자 세포의 유용성을 확장시킨다. 다양한 기술적 제약에도 불구하고, 정자에의 접근가능성은 인공수정 및 시험관내 수정(in vitro fertilization, IVF)의 발전을 가능케 하였다. 그러나, 동결-융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다.
이러한 변이는 저온에서 액상에서 겔상으로 변화하는 막에 의해 유도된다. 이는 동결보존 시 정자의 생존력 및 수정능을 감소시키는 주된 원인 중 하나이다. 그 중에서도 정자 막의 콜레스테롤/인지질 비율은 동결보존 시 막 유동성 및 안정성에 있어서 주요 결정인자이다. 인간 및 토끼 정자와 같은, 매우 높은 콜레스테롤/인지질 비율을 가지는 종에서 얻은 정자는 냉각될 때 이러한 막 손상을 겪지 않음이 보고되었다. 통상적으로, 막의 손상은 세포사멸에 대한 주요 원인 중 하나로 여겨지고 있다. 막의 주요 구성 요소인, 콜레스테롤은 막 기능의 조절과 같은 중요한 역할을 하고, 세포막에서 콜레스테롤은 막 유동성 및 투과성의 주요 결정인자로 알려져 있다.
이러한 변이를 최소화하여, 동결보존시에 세포의 손상을 최소화하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, WO 01/037655에는 포유류 정자의 동결보존 방법에 사용되는 희석액이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2009-0024029호에는 아마이드를 포함하는 정자의 동결보존제가 개시되어 있으며, 한국특허공개 제2011-0020066호에는 정액 특이적인 동결보존제를 사용하여 정액을 동결보존하는 방법이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2010-0117497호에는 자바리 정자의 냉동보존용 인공정장이 개시되어 있다.
이처럼, 다양한 사육동물의 정자를 동결보존하기 위한 연구가 진행되고 있으나, 주요 가축 중의 하나인 돼지에 대한 연구는 거의 진행되지 못하고 있다. 그 이유는, 돼지 정자는 다른 축종에 비하여 정자의 세포막에 불포화 지방산이 높은 비율로 포함하고 있어 지질 과산화가 일어나기 쉽고, 자체적인 항산화 물질이 적기 때문에 저온 충격에 대한 저항성이 낮아서 급격한 온도 변화에 쉽게 그 기능이 소실되어 동결보존에 어려움이 있기 때문이다. 이에, 이러한 문제점을 해결하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있으나, 돼지 정자를 효과적으로 동결보존할 수 있는 방법은 아직까지 개발되지 않고 있는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 돼지 정자를 효과적으로 동결보존할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 항산화제의 일종인 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 조성물을 이용할 경우, 동결 및 해동시에 돼지 정자의 손상을 최소화하여 생존율을 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 돼지 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 돼지 정자를 동결보존하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 동결 및 해동시에 생성되는 과도한 산화물질과, 산화적 스트레스에 대하여 쉽게 손상되는 세포막을 포함하는 정자의 특성으로 인하여, 동결보존이 어려운 돼지 정자를 대상으로 하여, 정자의 손상을 최소화하면서 동결보존할 수 있는 방법을 개발하기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 항산화제의 일종인 아스타잔틴과 커큐민에 주목하게 되었다. 아스타잔틴은 수생동물 및 미생물에 널리 분포된 항산화활성을 갖는 카로티노이드 화합물의 일종으로서, 우수한 일중항산소 소거활성과 지질 과산화 억제활성을 나타내고, 커큐민은 생강과 식물인 울금, 강황 등에 포함된 항산화물질의 하나로서, 특유의 맛과 향으로 인하여 향신료로서 사용될 뿐만 아니라, 의학적으로는 항암제, 항바이러스제 등의 다양한 의약품의 유효성분으로서 사용되고 있다. 본 발명자들은 상기 아스타잔틴과 커큐민이 식용으로 사용될 수 있을 정도로 안전하면서도, 고온 고압등의 급격한 환경변화에도 내성을 나타낼 정도의 안정성을 나타내기 때문에, 정자의 급속동결과 같은 환경에서도 정상적인 항산화 활성을 나타낼 수 있을 것으로 기대하였다. 이에, 미세조류로부터 추출된 아스타잔틴 또는 울금으로부터 추출된 커큐민을 다양한 농도로 첨가한 동결보존액을 제조하고, 이를 사용하여 돼지의 정자를 동결 및 해동시킨 후, 정자의 운동성 및 정자 세포내에 포함된 산화물질(산소라디칼 또는 과산화수소라디칼)의 함량변화를 측정한 결과, 아스타잔틴은 산화물질을 효과적으로 제거하지 못하였음에도 불구하고, 다른 작용기작에 의하여 돼지 정자의 생존율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 동결 및 해동으로 인하여 야기되는 돼지 정자의 운동성 저하의 수준을 억제시킬 수 있음을 확인하였고, 커큐민은 돼지 정자의 동결 및 해동시에 증가하는 산화물질을 효과적으로 제거함으로써 돼지 정자의 생존율을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 동결 및 해동으로 인하여 야기되는 돼지 정자의 운동성 저하의 수준을 억제시킬 수 있음을 확인하였다.
따라서, 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 동결보존용 조성물은 돼지 정자의 효과적인 동결보존에 활용될 수 있고, 특히 아스타잔틴은 항산화활성이 아닌 다른 작용기작으로 인하여 동결보존에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 (a) 동결보존제; 및 (b) 아스타잔틴 또는 커큐민을 포함하는 돼지 정자의 동결보존용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "동결보존"이란, 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 동결보존은 돼지 정자의 동결보존을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "동결보존제"란, 동결보호제라고도 하고, 생물세포를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 매액(媒液)에 첨가시키는 물질을 의미한다.
본 발명의 목적상, 상기 동결보존제는 동해에 의한 정자의 손상을 방지하고, 정액의 농도를 저하시켜서, 동결보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 동결보존제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 염류, 항산화제, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 완충액이 될 수 있는데, 바람직하게는 시트르산염, 바이카보네이트염 등의 염류; 타우린(taurine), 하이포타우린(hypotaurine), 트레할로스(trehalose) 등의 항산화제; 글리세롤, 글루코스, 수크로스, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 프럭토스, 덱스트란 등의 당류; 히알루론산, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 난황단백질, 아미노산 등의 단백질류를 포함하는 완충액이 될 수 있고, 이들 각성분은 당업자가 필요에 따라 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 용어 "아스타잔틴(astaxanthin)"이란, C40H52O4의 화학식으로 표시되고, 596.84Da의 분자량을 갖으며, 항산화 활성을 나타내는 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 아스타잔틴은 돼지 정자 세포막의 지질과산화를 방지하고, 동결 및 해동시에 생성되는 산화물을 제거하여, 궁극적으로는 돼지 정자의 손상을 방지하는 역할을 수행하는 유효성분으로서 사용된다. 본 발명의 돼지 정자의 동결보존용 조성물에 포함된 아스타잔틴의 함량은 돼지 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 100 내지 500μM, 보다 바람직하게는 500μM이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "커큐민(curcumin)"이란, C21H20O6의 화학식으로 표시되고, 368.38Da의 분자량을 갖으며, 항산화 활성을 나타내는 화합물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 커큐민은 돼지 정자 세포막의 지질과산화를 방지하고, 동결 및 해동시에 생성되는 산화물을 제거하여, 궁극적으로는 돼지 정자의 손상을 방지하는 역할을 수행하는 유효성분으로서 사용된다. 본 발명의 돼지 정자의 동결보존용 조성물에 포함된 커큐민의 함량은 돼지 정자의 동결보존 효과를 나타내게 할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 10 내지 100μM, 보다 바람직하게는 10μM이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "정자"란, 정충이라고도 하고, 정자는 웅성동물의 고환에서 생산되는 성세포를 의미하는데, 길이는 약 0.02㎜이며, 머리, 경부 및 긴 꼬리의 세 부분으로 구성된다. 머리 부분에는 웅성 동물의 DNA가 들어 있고, 머리 부분의 맨 앞쪽에 존재하는 첨체에는 난자의 난막을 녹일 수 있는 효소가 포함되어 있고; 상기 경부에는 에너지 저장고인 당분을 함유한 미토콘드리아가 포함되어 있으며; 상기 꼬리는 가는 실 묶음으로 되어 있는데 가는 실 묶음이 교묘하게 신축하여 꼬리를 움직이게 한다.
본 발명에 있어서, 상기 정자는 세포막에 불포화지방산을 높은 함량으로 포함하고, 내재적 항산화물질을 적게 포함하는 특징을 나타내는 돼지 정자가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 울금으로부터 추출된 커큐민 또는 미세조류로부터 추출된 아스타잔틴을 돼지 정자에 다양한 농도로 처리하고, 상기 아스타잔틴 또는 커큐민이 처리된 돼지 정자를 동결시켰다(실시예 1). 상기 동결된 각 돼지 정자를 해동시키고, 이들의 운동성 및 이동속도를 측정하여, 아스타잔틴 또는 커큐민의 처리여부에 따른 효과를 분석한 결과, 아스타잔틴 또는 커큐민을 처리한 경우에 대체로 운동성 및 이동속도가 높은 수준을 나타내었으므로, 아스타잔틴 또는 커큐민이 동결된 정자를 해동할 경우, 정자의 생존율을 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 1, 도 2 및 표 1). 아울러, 상기 해동된 돼지 정자의 세포내에 포함된 산소라디칼의 수준을 측정한 결과, 아스타잔틴 또는 커큐민을 처리한 경우에는 산소라디칼 값이 저하됨을 확인하였으므로, 아스타잔틴 또는 커큐민이 산소라디칼을 제거하는 효과를 나타내고, 이로 인하여 사멸하는 정자의 수를 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다(도 3, 도 4 및 표 2). 끝으로, 상기 해동된 돼지 정자의 세포내에 포함된 과산화수소라디칼의 수준을 측정한 결과, 커큐민을 처리한 경우에는 과산화수소라디칼 값이 저하되었으나, 아스타잔틴을 처리한 경우에는 과산화수소라디칼 값이 변화되지 않거나 오히려 증가함을 확인하였다. 따라서, 커큐민은 과산화수소라디칼을 제거하는 효과를 나타내고, 이로 인하여 사멸하는 정자의 수를 감소시키는 효과를 나타내는 반면, 아스타잔틴은 항산화 활성과는 별도의 작용기작에 의하여 동결 및 해동시에 정자의 사멸을 억제하는 효과를 나타내는 것으로 분석되었다(도 5, 도 6 및 표 3).
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 (a) 상기 동결보존용 조성물과 돼지 정자를 혼합하여 동결보존 혼합물을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 돼지 정자의 동결보존방법을 제공한다.
이때, 상기 동결보존용 조성물은 상술한 바와 동일하고; 상기 동결보존용 조성물에 포함되는 정자의 농도는 바람직하게는 동결보존액 단위부피(㎖)당 1 X 1010 내지 10 X 1010개 이고, 보다 바람직하게는 단위부피(㎖)당 3 X 1010 내지 7 X 1010개 이며, 가장 바람직하게는 단위부피(㎖)당 5 X 1010개 이고; 상기 동결 및 보존은 정자를 동결보존할 수 있는 한 공지된 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 액화질소를 사용하여 -196℃에서 동결 및 보존을 수행할 수 있고, 상기 동결된 정자는 반영구적으로 보존할 수 있다.
아울러, 본 발명의 방법은 상기 동결보존된 정자를 해동시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
이때, 상기 해동방법은 상기 동결보존된 정자를 정상상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있는데, 바람직하게는 동결보존된 정자를 상온에서 일정시간 동안 정치시킴으로써 상기 정자에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 60℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 보다 바람직하게는 동결보존된 정자를 4℃의 물에 5분 동안 침지하거나, 37℃의 물에 20초 동안 침지하거나, 70℃의 물에 3초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 동결보존된 정자를 50℃의 온수에서 10초 동안 침지함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 돼지 정자 동결보존용 조성물을 이용하면, 우수한 품종의 돼지 정자의 동결보존시 돼지 정자의 손상을 최소화 할 수 있으므로, 돼지의 품종개량에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 정자의 운동성 및 속도에 대한 아스타잔틴의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 정자의 운동성 및 속도에 대한 커큐민의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 아스타잔틴이 처리되고 Yo-Pro-1/HE로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 4는 커큐민이 처리되고 Yo-Pro-1/HE로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 5는 아스타잔틴이 처리되고 PI/DCF로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
도 6은 커큐민이 처리되고 PI/DCF로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 돼지 정자의 채취 및 동결보존
장기이식에 사용되는 미니돼지의 일종인 PWG miniature pig을 대상으로 음경 수압법을 적용하여 주 1회 돼지 정액을 채취하였다. 채취된 돼지 정액은 17~19℃에서 약 30분 정도 정치시키고, 이중에서 3㎕를 분취하여 37℃로 예열한 슬라이드(20 μM depth, Leja, Nieuw Vennep, The Netherlands)에 안치시켰으며, CASA(Hamilton Thorne, Inc., HTM-HELOS, Beverly, MA, USA)를 이용하여 정자의 수와 운동성을 측정하였다. 이 중에서, 정자의 80% 이상이 움직임을 보이고 그 중 70% 이상이 직진 운동을 보인 정자만을 시료로서 사용하였다.
상기 시료에 3배 부피의 희석제인 mMB(modified Modena B: 0.45g EDTA, 1.38g sodium citrate, 0.2g sodium bicarbonate, 1g Tris base, 0.5g citric acid, 0.01g cysteine, 0.8g BSA 및 0.06g kanamycin sulfate, pH 7)를 가하여 희석하고 원심분리(400×g, 10분, 20℃)하여 침전물을 수득하는 방식을 2 내지 5회 반복하여 상기 시료에 포함된 정장액, 정관내 탈락된 세포 잔류물 등의 불순물을 제거하고, 뭉쳐진 정자를 풀어주었다. 최종적으로 수득한 침전물에 1차 동결보존액인 LEY(lactose-egg yolk: 80%(v/v) lactose solution[310 mM], 20%(v/v) egg yolk 및 100㎍/㎖ kanamycin sulfate; pH 6.2)을 가하여 돼지 정자의 농도가 1×109/㎖인 정자-LEY 혼합용액을 수득하고, 1시간 동안 온도를 서서히 저하시켜서 최종적으로 4℃가 되도록 하였다.
한편, LEYGO(LEY-glyserol-Orvus-ES-Paste: 89.5%(v/v) LEY, 9%(v/v) glycerol, 1.5%(v/v) OrvusESPate[OEP], 100mM trehalose)를 제조하고, 이에, 항산화제로서, 미세조류로부터 추출된 아스타잔틴 또는 울금으로부터 추출된 커큐민을 각각 0, 10, 100 또는 500 μM 이 되도록 가하여 각각의 2차 동결보존액을 수득하였다.
상기 4℃로 유지된 정자-LEY 혼합용액에 동일 부피의 2차 동결보존액을 가하여 각각의 정자-LEYGO 혼합용액을 수득하고, 이를 0.5㎖ 튜브에 주입한 다음, 액체질소에 침지하여 2주일 이상의 시간동안 동결보존시켰다.
실시예 2: 동결보존된 돼지 정자의 운동성 평가
상기 동결보존된 각각의 정자-LEYGO 혼합용액을 50℃ 수조에 10초 동안 침지하여 해동시키고, 해동된 용액에 10㎖ mMB용액을 가하여 각각의 희석액을 수득하였으며, 상기 수득한 각각의 희석액을 37℃ 수조에서 10분간 침지하여 37℃까지 승온시켰다. 상기 승온된 희석액을 원심분리(13,000rpm, 4분)하여 침지된 정자를 수득하고, 상기 수득한 정자에 mMB용액을 가하여 5×107/㎖의 농도를 갖는 희석액을 수득하였다. 상기 수득한 희석액 3㎕를 분취하여 37℃로 예열한 Leja 슬라이드에 안치시키고 CASA(Hamilton Thorne, Inc., HTM-HELOS, Beverly, MA, USA)를 이용하여 정자의 이동시 연속사진을 45frame/sec의 속도로 촬영하고, 각 촬영된 영상을 컴퓨터 프로그램(HELOS software)에 적용하여, 정자머리의 위치 및 방향을 분석함으로써, 운동성을 나타내는 정자의 비율, 진척된 운동성을 나타내는 정자의 비율, 정자의 평균속도(Average-path velocity, VAP), 정자의 직선구간 속도(Straight-line velocity, VSL) 및 정자의 곡선구간 속도(Curvilinear velocity, VCL)를 각각 산출하였다(도 1, 도 2 및 표 1). 이때, 대조군으로는 동결보존을 수행하지 않은 정자를 사용하였다.
정자의 운동성 및 속도에 대한 항산화제의 효과(평균±표준편차)
항산화제 운동성(%) 진척된 운동성(%) VAP(㎛/s) VSL(㎛/s) VCL(㎛/s)
처리군 농도
(μM)
대조군 - 93.4±5.8 71±9.2 100.3±15.5 70.9±15.7 182.6±30.8
커큐민
처리군		 0
10
100
500		 42.7±5.5
50.4±2.9
45.7±3.8
37.4±8.3		 23±2.6
31.7±4
27±4
21.7±3.2		 81.7±7.4
80.3±24.8
84.5±1.7
79.3±4.2		 47.3±2.7
57±4.5
50.9±1.4
47.1±4.2		 157.8±9.9
364.9±325.7
163.5±3.1
160.8±10
아스타잔틴 처리군 0
10
100
500		 49.8±4
42±11.8
52.7±3
66±1.7		 33.4±2.5
27±7.2
31±5.3
45.7±2.5		 99.3±9.6
92.74±4.5
98.5±5
110.4±11.5		 63.4±7.7
58.7±1.7
56.6±7.6
70.8±5.9		 180.9±12.5
178.2±10.3
192.9±9.2
203.4±26
상기 도 1, 도 2 및 표 1에서 보듯이, 전체적으로 동결해동 절차를 수행한 정자는 동결해동 절차를 수행하지 않은 대조군의 정자에 비하여 대부분의 시험항목에서 낮은 값을 나타내었다. 또한, 동결해동 절차를 수행한 정자 중에서는 아스타잔틴 또는 커큐민을 처리한 경우에 대체로 각 시험항목의 측정값이 높은 수준을 나타냄을 확인하였다. 이는 아스타잔틴 또는 커큐민이 동결된 정자를 해동할 경우, 정자의 생존율을 향상시킬 수 있기 때문인 것으로 분석되었다.
또한, 커큐민은 10μM의 농도로 처리할 경우, 대체적으로 우수한 운동성 및 속도를 나타내고, 처리농도가 증가할 수록 운동성 및 속도가 감소되는 경향을 나타냄을 확인하였다. 이와는 달리, 아스타잔틴은 10μM의 농도로 처리할 경우, 아스타잔틴을 처리하지 않은 시료보다도 운동성 및 속도가 낮은 값을 나타내었으나, 아스타잔틴의 처리농도가 증가할 수록 운동성 및 속도가 증가되는 경향을 나타냄을 확인하였다.
실시예 3: 동결보존된 돼지 정자에 포함된 산화물질에 미치는 항산화제의 효 과
상기 실시예 2에서 운동성을 평가하기 위하여 사용된 시료를 유세포 분석에 적용하여 상기 각 시료에 포함된 산화물질의 수준과 분포를 분석하고자 하였다.
구체적으로, 대조군 및 항산화제 처리군(10, 100 및 500μM 처리군)의 정자에 mMB를 가하여 1×103/㎖의 농도를 갖는 희석액을 수득하고, 상기 각 군의 희석액을 대상으로 산소라디칼의 양을 측정하기 위한 염색과 과산화수소라디칼의 양을 측정하기 위한 염색을 각각 개별적으로 수행하였다.
실시예 3-1: 동결보존된 돼지 정자에 포함된 산소라디칼에 미치는 항산화제 의 효과
산소라디칼의 양을 측정하기 위한 염색은 상기 각 희석액에 0.05 μM의 Yo-Pro-1 iodide 형광염료(Yo-Pro-1; Molecular Probes Inc.) 및 4 μM의 Hydroethidine 형광염료(HE; Mole-cular Probes Inc., Eugene, OR, USA)를 가하고, 37℃에서 40-60분간 반응시켜서 수행하였다. 상기 염색이 종료된 후, 각 시료를 원심분리(1,500 rpm, 3분)하여 침전된 정자를 수득하고, 이에 6㎖의 mMB를 가하여 희석액을 수득하였으며, 상기 희석액을 FACS (500 series, Beckman, Coulter, Inc., FL, USA)에 적용하여 유세포 분석을 수행하여, 사멸한 정자의 수와 정자 내 산화 물질의 양을 측정하였다(도 3, 도 4 및 표 2). 이때, 사멸세포는 이미 죽은 정자의 수를 나타내고, 빈사세포는 세포자멸에 의하여 죽어가는 세포의 수를 나타내며, V1 영역은 낮은 세포내 산소라디칼 값을 갖고 살아있는 정자의 수를 나타내며, V2 영역은 높은 세포내 산소라디칼 값을 갖고 살아있는 정자의 수를 나타내고, MFI total은 전체 정자에서 측정된 평균형광강도(mean fluorescence intensity)를 나타내며, MFI viable은 전체 정자 중에서 살아있는 정자에서 측정된 평균형광강도를 나타낸다.
항산화제가 처리되고 Yo-Pro-1/HE로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과
항산화제 사멸세포 빈사세포 V1 영역 V2 영역 MFI total MFI viable
처리군 농도
(μM)
커큐민 0
10
100
500		 27.3±1.1
26.9±1.3
26.2±1.4
28.5±3.0		 6.0±0.4
7.2±0.4
5.65±0.7
7.1±0.6		 17.8±1.3
18.3±1.3
19.7±2.5
15.5±3.5		 48.9±1.0
43.5±0.9
45.0±1.1
45.8±0.7		 488.5±66.7
545.5±76.2
571.3±59.8
55.15±25.5		 453.1±64.4
501.9±76.5
517.7±52.1
490.2±23.8
아스타잔틴 0
10
100
500		 26.1±2.7
20.7±1.3
21.9±1.2
23.7±0.7		 5.8±0.5
4.9±0.2
5.6±0.4
6.26±0.5		 31.3±0.4
25.3±0.7
27.7±0.7
24.9±0.7		 519.9±72.6
425.3±63.1
471.7±35.4
495.4±36.1		 31.5±1.8
44.4±1.0
41.14±0.9
40.8±0.1		 486.2±61.5
406.4±50.9
436.7±30.8
457.4±24.9
상기 도 3, 도 4 및 표 2에서 보듯이, 정자 세포내 산소라디칼의 값(Moribund+V2)은 전체적으로 항산화제를 처리하지 않은 정자에 비하여 각 아스타잔틴 또는 커큐민 처리군이 낮은 값을 나타내었으므로, 아스타잔틴 또는 커큐민이 산소라디칼을 제거하는 효과를 나타내고, 이로 인하여 사멸하는 정자의 수를 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 아스타잔틴은 10 μM의 농도로 처리한 경우에 산소라디칼의 값을 최소화 시킬 수 있었고, 커큐민 역시 10 μM의 농도로 처리한 경우에 산소라디칼의 값을 최소화 시킬 수 있었다.
한편, 커큐민의 경우에는 표 1 및 표 2의 결과가 서로 부합됨을 확인하였으나, 아스타잔틴의 경우에는 표 1 및 표 2의 결과가 서로 부합되지 않음을 알 수 있었다. 즉, 커큐민을 10 μM의 농도로 처리한 정자는 우수한 운동성 및 속도를 나타내고, 정자 세포내의 산소라디칼의 값을 최소화 시키는 반면, 아스타잔틴의 경우에는 500μM의 농도로 처리한 정자가 우수한 운동성 및 속도를 나타내고, 10 μM의 농도로 처리한 정자가 정자 세포내의 산소라디칼의 값을 최소화 시킴을 확인하였다.
상기 결과는, 커큐민은 자체의 항산화활성만으로도 동결 및 해동시에 정자의 사멸을 억제할 수 있는 능력을 나타내는 반면, 아스타잔틴은 항산화활성과는 별도의 작용기작에 의하여 동결 및 해동시에 정자의 사멸을 억제할 수 있는 능력을 나타내는 것으로 분석되었다.
실시예 3-2: 동결보존된 돼지 정자에 포함된 과산화수소라디칼에 미치는 항 산화제의 효과
과산화수소라디칼의 양을 측정하기 위한 염색은 상기 각 희석액에 0.76 μM의 Propidium Iodide 형광염료(PI; Sigma-Aldrich) 및 200 μM의 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate 형광염료(DCF; MolecularProbes, Inc.)를 가하고, 37℃에서 40-60분간 반응시켜서 수행하였다. 상기 염색이 종료된 후, 각 시료를 원심분리(1,500 rpm, 3분)하여 침전된 정자를 수득하고, 이에 6㎖의 mMB를 가하여 희석액을 수득하였으며, 상기 희석액을 FACS에 적용하여 유세포 분석을 수행하여, 사멸한 정자의 수와 정자 내 산화 물질의 양을 측정하였다(도 5, 도 6 및 표 3). 이때, 상기 PI/DCF 염색시 과산화수소라디칼 뿐만 아니라 산소라디칼도 함께 측정되며, 사멸세포, V1 영역, V2 영역, MFI total 및 MFI viable은 상기 실시예 3-1에서 정의한 바와 동일하고, V3 영역은 높은 세포내 과산화수소라디칼 값을 갖고 살아있는 정자의 수를 나타낸다.
항산화제가 처리되고 PI/DCF로 형광표지된 돼지 정자에 대한 유세포 분석결과
항산화제 사멸세포 V1 영역 V2 영역 V3 영역 MFI total MFI viable
처리군 농도
(μM)
커큐민 0
10
100
500		 33.9±0.6
33.8±1.1
33.4±2.3
34.1±1.1		 18.2±1.5
19.2±2.5
20.5±1.7
20.9±2.1		 36.5±1.3
38.5±0.1
35.6±1.5
35.9±3.8		 4.1±1.0
2.7±0.5
3.2±1.0
3.2±0.2		 483.6±29.7
473.3±10.6
535.7±155.4
485.7±17.4		 440±21.6
435.3±10.4
514.0±108.4
445.6±15.2
아스타잔틴 0
10
100
500		 34.7±3.0
26.8±1.6
29.1±2.4
31.5±0.7		 31.3±0.8
31.1±2.16
32.6±2.4
28.3±1.2		 24.3±1.8
30.9±1.4
28.3±1.6
30.0±1.2		 4.0±0.8
4.8±0.9
4.8±0.9
4.3±0.3		 513.4±11.2
521.7±17.8
487.4±6.5
518.5±8.6		 467.0±11.9
471.4±13.8
448.9±3.5
473.8±5.4
상기 도 5 및 표 3에서 보듯이, 아스타잔틴을 처리한 정자에서는, 정자 세포내 과산화수소라디칼의 값이 높은 수준을 나타내는 정자세포의 수(V3)가 전체적으로 아스타잔틴을 처리하지 않은 정자에 비하여 동등하거나 오히려 높은 값을 나타내었으므로, 아스타잔틴이 과산화수소라디칼을 제거하는 효과를 나타내지 못함을 확인하였다. 그러나, 사멸세포의 수를 비교하면, 전체적으로 아스타잔틴을 처리하지 않은 정자에 비하여 감소됨을 확인하였다. 상기 결과는 상기 표 2에 나타난 것과 유사한 결과로서, 아스타잔틴은 항산화활성과는 별도의 작용기작에 의하여 동결 및 해동시에 정자의 사멸을 억제할 수 있는 능력을 나타냄을 다시한번 확인할 수 있었다.
이에 반하여, 도 6 및 표 3에서 보듯이, 커큐민을 처리한 정자에서는, 정자 세포내 과산화수소라디칼의 값이 높은 수준을 나타내는 정자세포의 수(V3)가 전체적으로 커큐민을 처리하지 않은 정자에 비하여 낮은 값을 나타내었으므로, 커큐민이 과산화수소라디칼을 제거하는 효과를 나타내고, 이로 인하여 사멸하는 정자의 수를 감소시킬 수 있음을 확인하였다.

Claims (5)

1) 락토오스 용액, 난황 및 카나마이신 설페이트(kanamycin sulfate)로 구성된 1차 동결보존용 조성물과 돼지 정자를 혼합하여 돼지 정자의 농도가 1 X 1010 내지 10 X 1010개/㎖가 되도록 동결보존 혼합물을 수득하는 단계;
2) 상기 1차 동결보존용 조성물, 글리세롤 및 트레할로오스(trehalose)로 구성된 조성물을 수득하는 단계;
3) 상기 단계 2)에 아스타잔틴을 가하여 2차 동결보존용 조성물을 수득하는 단계;
4) 상기 단계 1)의 동결보존 혼합물에 상기 단계 3)의 2차 동결보존용 조성물을 가하여 혼합물을 수득하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 혼합물을 동결 및 보존하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지 정자의 동결보존방법.
제1항에 있어서,
상기 동결 및 보존은 액화질소를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 락토오스 용액은 70 내지 90%(v/v), 난황은 10 내지 30%, 카나마이신 설페이트는 50 내지 200 ㎍/㎖, 글리세롤은 1.0 내지 2.0%(v/v) 및 트레할로오스는 50 내지 150 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 아스타잔틴의 농도는 100 내지 500uM인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 방법으로 제조된 돼지 정자 동결보존용 조성물.


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