BR112019006765A2 - Crioprotetor derivado de planta para congelar células e tecidos, e, método e sistema para congelar células e tecidos. - Google Patents

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Abstract

as modalidades da presente invenção proporcionam extratos derivados de plantas como uma substituição para crioprotetores tradicionais utilizados para congelar tecido e células proporcionando um método para diminuir o dano pós-descongelamento como criado pelo crioprotetor. por exemplo, extratos do gênero hippophae ou outras fontes ou composições de plantas podem ser usadas como um crioprotetor ou podem até mesmo ser usadas para substituir pelo menos parte de um crioprotetor tradicional.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO
Pedido de Patente de Invenção para “CRIOPROTETOR DERIVADO DE PLANTA PARA CONGELAR CÉLULAS E TECIDOS, E, MÉTODO E SISTEMA PARA CONGELAR CÉLULAS E TECIDOS”
REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS
RELACIONADOS [001] Este é um pedido de patente internacional reivindicando o benefício de e prioridade do Pedido Provisório U.S. N° 62/404,034 depositado em 04 de outubro de 2016, que é aqui incorporado por referência.
CAMPO TÉCNICO [002] A presente invenção refere-se à criopreservação de tecidos e células e métodos para mitigar alguns danos associados com a criopreservação pela substituição de vários extratos vegetais e outras porções para crioprotetores anteriormente definidos.
FUNDAMENTOS [003] É bem entendido que, enquanto a criopreservação é geralmente um bom método para preservar células tais como gametas, células germinativas, células de células únicas, células tronco, células bacterianas, fúngicas, algas e semelhantes, infelizmente, a criopreservação pode afetar negativamente a integridade das células possivelmente causando mudanças na bicamada de lipídeo, as proteínas dentro da bicamada de lipídeo, ou mesmo dano oxidativo ao DNA e organelas. Similarmente, dano celular agregado pode ser identificado como dano a tecidos ou órgãos in vitro. Tais mudanças podem ser fatais à célula. Por exemplo, na criopreservação de células de esperma equino e bovina, pelo menos 50% das células são mortas quando as células são descongeladas. Similarmente, em células tais como o
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2/58 sangue do cordão umbilical, dependendo da técnica usada, somente 40% ou menos das células podem ser viáveis.
[004] Células criopreservadas podem ser armazenadas a cerca de -20° C, cerca de -80° C Ou cerca de -196° C (Armazenagem de nitrogênio líquido). A transição de cerca de 37° C para as temperaturas extremas causam danos às membranas, incluindo a reorganização de lipídeos de membrana, intumescimento celular, e semelhantes. Por exemplo, fosfatidil serina, normalmente apenas encontrada na casca interna da bicamada de membrana, pode ser retirado para o folhelho externo da membrana. Em algumas membranas, tais como esperma de javali, a membrana plasmática, uma entidade não homogênea, com relação à estrutura e função, pode ser particularmente sensível. De modo interessante, não são apenas células de mamíferos que estão sujeitas a desafios crioprotetores. O esperma de peixe também pode ser friável com relação à criopreservação e ao uso crioprotetor.
[005] Métodos passados para proteger células contra danos de criopreservação incluem o uso de crioprotetores tais como glicerol, DMSO, metanol, o uso de certas proteínas, e açúcares altamente concentrados, ou porções de cadeia longa. Entretanto, além das soluções de criopreservação, especialmente quando um crioprotetor pode ser adicionado, pode estar muito fora de uma osmolalidade fisiológica e a célula criopreservada pode ser danificada pelo estresse osmótico subsequente (por exemplo, efluxo de água) e pode requerer a reidratação com o descongelamento. Além disso, as células podem experimentar toxicidade bioquímica. Os efeitos de toxicidade podem incluir reorganização citoesquelética, supressão de metabolismo normal e alterações de composição de membrana. Após o descongelamento, se a célula sobreviveu os efeitos da toxicidade, frequentemente, os componentes da célula podem ser modificados de modo que a célula não seja mais funcional. Além disso, os crioprotetores podem atuar pelo aumento da concentração de soluto no interior da célula, para auxiliar o congelamento
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3/58 ou tratamento da célula pode funcionar para diminuir os efeitos de cristais de gelo dentro da célula por redução da água intracelular. Entretanto, muitos dos crioprotetores aceitos são tóxicos em um grande nível celular ou mesmo celular. E imperativo que os crioprotetores biologicamente relevantes não devem ser tóxicos para as células ou tecido. De fato, na maioria dos casos o uso de um crioprotetor é um equilíbrio entre efeitos benéficos e inerentemente prejudiciais.
[006] Processos geralmente conhecidos são métodos para combater parte da toxicidade bioquímica incluindo a adição de crioprotetores tais como glicerol em uma maneira escalonada, aumentar gradualmente a concentração e/ou a adição de crioprotetores em temperaturas reduzidas (por exemplo, refrigerada). Um exemplo da tentativa de equilibrar os pros e cons de crioprotetores podem incluir glicerol. O glicerol pode ser o crioprotetor mais comumente usado em células reprodutivas e, de fato, foi um aditivo de capacitação quando o congelamento do esperma foi desenvolvido em primeiro lugar. No entanto, em muitas espécies, tais como garanhões e galos, a toxicidade do glicerol podería impactar a saúde do esperma pósdescongelamento. Além disso, o glicerol é um contraceptivo para algumas espécies; portanto, existe uma necessidade de alternativas para glicerol e/ou método para diminuir a quantidade de glicerol necessária.
[007] Em outro exemplo, a criopreservação de células tronco requer o uso de crioprotetores que são compatíveis com tecidos receptores (por exemplo, biologicamente inerte ou mesmo não irritante), ou requer que as células sejam lavadas antes do uso. O último, exacerba ainda mais os danos criados durante a criopreservação, mas é o padrão atual. Portanto, o desenvolvimento de um crioprotetor que não requer a remoção, e proporciona funcionalidade não irritante, é desejável.
[008] Uma variedade de agentes crioprotetores é conhecida por aqueles versados na técnica. Exemplos de agentes crioprotetores anteriores
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4/58 incluem, mas não estão limitados a: acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclo-hexanodiol, dextrano, dietileno giicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno giicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno giicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno giicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno giicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose. Em geral, estas moléculas podem ser amplamente classificadas como álcoois, aminas, açúcares, amido, álcoois de açúcar, álcoois de diol, polissacarídeos, sais, solventes, polímeros ou aminoácidos. Estes mesmos agentes podem ser eficazes na vitrificação bem como em criopreservação de resfriamento lento.
[009] Inerente à criopreservação é o desejo de que os materiais crioconservados sejam viáveis após o material ser descongelado. Infelizmente, o dano causado pelas mudanças de pressão osmótica induzida por crioconservantes é um evento principal em lesões de células de congelamento lento. Tais danos podem ser irreversíveis. Portanto, há um desejo de se encontrar agentes crioconservantes alternativos que possam limitar o dano às células, ainda outra função para reduzir o gelo intracelular.
[010] Exemplos anteriores incluem Roy Et al (US79560098) que pode requerer a adição de um agente quelante além de polietileno giicol (um composto poliéter) de dois pesos moleculares diferentes para as células de congelamento. Em órgãos de proteção, Banurst et al (US6495532) pode
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5/58 ensinar o uso de ácidos lisofosfóicos e um componente ‘potenciador’, tal como polietileno glicol que pode aumentar a eficácia do ácido lisofosfotídico. Polietileno glicol pode não ser um produto biológico de ocorrência natural como derivado de petróleo. Liu et al (Cryobiology (2016) 72: 162-167) pode ensinar o uso de um crioprotetor singular que é um açúcar para uso durante a vitrificação. Os monossacarídeos e dissacarídeos podem ser crioprotetores comuns para uso em vitrificação de esperma que podem melhorar a saúde do esperma pós-descongelamento. Existem vários mecanismos de ação para a criopreservação, incluindo os crioconservantes de penetração ou não penetração e mesmo a nucleação de gelo (Sieme, Oldenhin, e Wolkers 2016). Em uma revisão recente de crioprotetores, Elliott et al (Elliott, Wang E Fuller2017) pode falar com os problemas associados com a toxicidade crioconservante e a composição de crioconservantes para criopreservação e vitrificação que incluem glicerol, etileno glicol, propileno glicol, MezSCU, trehelose, Sacarose. Matsumura (US9603355) pode ensinar a combinação de monotioglicerol, um crioprotetor, junto com um protetor de membrana e células de esperma. Neste caso, o protetor de membrana pode ser um composto proteináceo.
[011] Tentativas anteriores em alternativas para crioprotetores tradicionais têm sido menos satisfatórias. Além disso, a adição de lipídios ao meio de cultura celular pode ser conhecida como sendo tóxica para células cultivadas por causa de problemas com toxicidade de lipídios livres em solução (D Bames e G Sato (1980) Analytical Biochemistry 102, p 255). O uso de óleos gerais e lipídeos e açúcares específicos tem sido atendido com resultados mistos.
[012] Publicação de Patente US N° US2011/0086336 de Herickhoff et al., e Patente US N°s 8202558 e 7622143 ambas de Herickhoff et al., cada uma incorporada aqui por referência em sua totalidade, discutem o uso de extratos do gênero Hippophae ou outras fontes ou composições de plantas.
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As referências Herickhoff referem-se ao uso de extratos de planta do gênero Hippophae, e outros, como antioxidante que pode ser usado em combinação com processos padrão de congelamento e resfriamento para células. Por exemplo, tais extratos vegetais e outros podem ser usados em combinação com agentes crioprotetores tradicionais. As referências Herckhoff podem não relacionar a substituição destes crioprotetores típicos com alguns ou mesmo todos os ditos extratos vegetais e outros.
[013] Novas soluções possíveis existentes, surpreendentemente, utilização de alguns tipos de extratos vegetais ou técnicas biológicas ou moleculares que têm certos tipos de características como descobriu-se que uma substituição parcial ou mesmo uma substituição completa dos agentes crioprotetores tradicionais trabalhem com o congelamento de tecidos e células. Modalidades da presente invenção proporcionam um método de combinar funcionalidades de aditivos, minimizando assim o número de compostos que podem ser requeridos para criopreservação. Por exemplo, a adição de um antioxidante, lipídeos vegetais e açúcares derivados de plantas como um método para funcionar, em parte, como um crioprotetor, pode permitir a minimização do uso de crioprotetores prejudiciais ou potencialmente tóxicos tais como glicerol ou outros crioprotetores tradicionais. Além do mais, as modalidades da presente invenção podem permitir a redução da toxicidade crioconservante, bem como da necessidade de remover o dito crioconservante da suspensão celular ou de tecido.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [014] Consequentemente, a presente invenção inclui uma variedade de aspectos ou modalidades que são selecionados em diferentes combinações para adequar às necessidades do usuário. De acordo com os objetivos desta invenção, pode-se entender que as tentativas de adicionar crioprotetores diferentes daquelas no passado, tem sido pendido com obstáculos, incluindo a sintetização das células não viáveis, biologicamente inativo, diminuindo a
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7/58 motilidade e/ou deixar de conferir benefícios protetores. Além disso, algumas porções podem atuar como criosensibilizantes (por exemplo, reduzindo a sobrevivência pós-descongelamento) ou pode requerer a remoção imediatamente pós-descongelamento. Uma solução mais orgânica para a funcionalidade crioprotetor é necessária em um mercado onde os clientes são os produtos de todos os produtos naturais. A capacidade de adicionar uma mistura de compostos que podem servir como um crioprotetor e auxiliar na retenção da integridade da célula, ou tecido com relação à sua funcionalidade pós-descongelamento, talvez sem a remoção necessária pósdescongelamento, constitui um objetivo geral deste sistema.
[015] Um outro objetivo da invenção pode ser fornecer um crioprotetor para células de congelamento e tecidos que diminui os efeitos prejudiciais que os crioprotetores têm tido em células para o processo de congelamento. Os aspectos da invenção podem proporcionar a exclusão de todos ou mesmo substancialmente todos os crioprotetores danosos. Em algumas modalidades, a presente invenção pode fornecer o uso de uma pequena quantidade de crioprotetores antigos.
[016] As modalidades da presente invenção podem realizar várias metas que podem ser implementadas sozinhas ou em combinações para a obtenção de uma variedade de objetivos. Em um objetivo geral, pode funcionar para uma grande variedade de células, coleções celulares, misturas de tipos de células, tecidos e amostras de tecidos, órgãos e outras amostras a serem criopreservadas que podem se beneficiar tal como a partir do uso da substituição de crioconservantes tradicionais, tal como glicerol, talvez em parte ou mesmo no total, com substâncias naturais na solução de criopreservação.
[017] Em um outro objetivo geral, as modalidades da presente invenção podem incluir a capacidade de diminuir a discrepância relativa entre o intracelular e a osmolaridade extracelular ou osmolalidade enquanto
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8/58 ainda cria um método pelo qual para diminuir a água intracelular e funcionar como um crioprotetor.
[018] Em outro objetivo geral, as modalidades da presente tecnologia podem incluir a capacidade de reduzir a pressão osmótica em células para o processo de congelamento.
[019] Naturalmente, outras metas e objetivos da presente invenção podem existir e podem ser apresentadas por todas as outras áreas do relatório descritivo e figuras. Deve-se entender que as modalidades da presente invenção podem incluir modificações que podem levar em conta as diferentes quantidades de crioprotetores alternativos a serem usados em aplicações diferentes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [020] A figura 1 mostra um gráfico dos efeitos benéficos de substituição de glicerol com óleo de polpa de espinheiro-marítimo sobre a saúde do esperma de javali imediatamente pós-descongelamento (0 hora). Como uma medida da saúde de esperma, a percentagem de células mortas (morto_sybr negativo; incapaz de funcionar pós-descongelamento), a percentagem de células que têm um acrossoma total (intacto_acrossoma_(alexafluor_negativo), e a proporção de células que têm uma membrana plasmática completamente intacta (live_(sybr_positivo) são mostrados tanto para um tratamento onde o óleo de polpa de espinheiromarítimo é substituído pelo crioprotetor, glicerol (Al) ou onde glicerol é o crioprotetor primário (A2).
[021] A figura 2 mostra um gráfico do efeito positivo da substituição de glicerol com o óleo de polpa de espinheiro-marítimo na saúde do esperma javali três horas pós-descongelamento (3 horas). Como uma medida da saúde do esperma, a percentagem de células mortas (Morto_(sybr negativo; incapaz de funcionar pós-descongelamento), a percentagem de células que
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9/58 têm um acrossoma total (intacto_acrossoma_(alexafluor_negativo), e a proporção de células que têm uma membrana plasmática completamente intacta (live_(sybr_positivo) são mostrados tanto para um tratamento onde o óleo de polpa de espinheiro-marítimo é substituído pelo crioprotetor, glicerol ou onde glicerol é o crioprotetor (A2).
[022] A figura 3 demonstra graficamente os efeitos de aumento da substituição de glicerol com óleo de polpa de espinheiro-marítimo sobre a motilidade principal de esperma. Neste exemplo, o EYC 7 é o método de controlo onde o glicerol compreende o crioprotetor inteiro a 7% (final, v/v). GG 5, 6 e 7 representam glicerol em 2,5, 3 ou 3,5% (final, v Zv) com óleo de polpa de espinheiro-marítimo a 5%, portanto, a concentração de crioconservação total foi 7,5, 8 ou 8,5 % total (v/v final) em ejaculatos a partir de 3 touros diferentes em seguida congelados em um dos 3 métodos (rápido (F), normal (N) ou lenta (S). Motilidade total e motilidade progressiva são uma medida da saúde de esperma pós-descongelamento.
[023] A figura 4 demonstra os efeitos positivos de substituição de glicerol com óleo de polpa de espinheiro-marítimo (GGP) ou óleo de polpa de espinheiro-marítimo (GGP) mais suco de espinheiro-marítimo (GG1) sobre atributos de esperma pós-descongelamento. Live_intact são aquelas células que têm uma membrana plasmática intacta mais um acrossoma intacto (plenamente funcional). Estas células podem ser usadas para fermentar um oócito. As células mortas são aquelas células que têm uma membrana plasmática comprometida ou danificada. Motile_percent do total demonstra aquelas células que estão crescendo ativamente ou têm propulsão de cauda. Cada um desses traços de saúde de esperma é mostrado imediatamente pós-descongelamento (0 h.) E depois de ser mantida 3 horas a 37C (3 horas.).
MODO (S) PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
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10/58 [024] Como mencionado anteriormente, a presente invenção inclui uma variedade de aspectos, que podem ser combinados de maneiras diferentes. As descrições a seguir são fornecidas para listar elementos e descrever algumas das modalidades da presente invenção. Estes elementos são listados com modalidades iniciais, entretanto, deve ser entendido que elas podem ser combinadas de qualquer maneira e em qualquer número para criar modalidades adicionais. Os exemplos variadamente descritos e modalidades preferidas não devem ser construídos para limitar a presente invenção a apenas os sistemas explicitamente descritos, técnicas e aplicações. A modalidade especifica ou as modalidades mostradas são apenas exemplos. O relatório descritivo deve ser entendido e destina-se a suportar as reivindicações amplas bem como de cada modalidade, e mesmas reivindicações onde outras modalidades podem ser excluídas. De forma importante, a descrição de modalidades meramente exemplificativas não tem a intenção de limitar a abrangência de outras reivindicações mais abrangente que podem ser feitas por apenas um dos vários métodos ou modalidades que poderíam ser empregados em uma reivindicação mais ampla ou similares. Além disso, esta descrição deve ser entendida para suportar e abranger descrições e reivindicações de todas as várias modalidades, sistemas, técnicas, métodos, dispositivos, e aplicações com qualquer número dos elementos expostos, com cada elemento sozinho, e também com qualquer e todas as várias permutações e combinações de todos os elementos neste ou em qualquer aplicação subsequente.
[025] Modalidades da presente invenção referem-se a uma combinação de compostos que juntos são crioprotetor e também protegem células in vitro, tecidos ou mesmo órgãos de danos durante a criopreservação. Várias modalidades da presente invenção referem-se a uma combinação de compostos que juntos podem ser antioxidantes protegendo in vitro, tecidos ou órgãos contra danos durante processamento in vitro assim
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11/58 como criopreservação. A invenção refere-se a uma combinação de compostos que juntos são de ocorrência natural, mas também podem ser fabricadas sinteticamente para produzir compostos quimicamente identicamente. Os compostos na concentração utilizada podem ser atóxicos ao material que está sendo crioconservado. A invenção descrita também pode conter compostos que podem inibir a cristalização de gelo. A invenção descrita pode também reduzir ou eliminar a necessidade de agentes crioprotetores. A presente invenção refere-se ao uso de extratos de espinheiro-marítimo em combinação com outros e em combinação um com o outro, para servir como um crioprotetor. Este crioprotetor pode ser adicionado a qualquer variedade de tipos de células ou tecidos para diminuir a água celular (aumento da concentração de soluto) desse modo protegendo a célula ou tecido durante a criopreservação. A invenção pode incluir glicose, frutose, metil celulose ou trealose, glicerol, ou qualquer outra combinação dos crioprotetores acima mencionados para modificar ainda mais a pressão osmótica o que é requerido pelo tipo de célula específica ou linha, geralmente e aproximadamente 1000 mOsm.
[026] As modalidades da presente invenção também podem incluir a adição do crioprotetor pode ocorrer tanto em adição escalonada como em uma única etapa como necessário para a célula ou tipo de tecido particular. Pode-se entender que a invenção pode também ser utilizada para a vitrificação. A invenção também pode incluir um método de resfriamento especializado para permitir ou otimizar o uso de um crioprotetor alternativo. A invenção pode ser aplicável a uma ampla variedade de meios comumente utilizados para criopreservação.
[027] Em uma modalidade da presente invenção, a tecnologia pode ser aplicada a células, tecidos, extratos biológicos, soro ou semelhantes. Em outras modalidades, um novo crioconservante pode ser usado em conjunto com um crioconservante tradicional, talvez para criar uma sinergia entre os
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12/58 crioconservantes. Em ainda outras modalidades, um novo crioconservante pode ser usado em qualquer um dos métodos comumente usados para congelar células, tecidos ou órgãos incluindo congelamento, congelamento por taxa controlada, vitrificação, congelamento ultra-rápido, congelamento ultra-rápido utilizando um sistema micro-capilar, vitrificação ultra-rápida, rastreamento de líquido, congeladores programáveis lentos, reprofusão, duas etapas (congelamento por equilíbrio), um recipiente de crio congelamento Mr Frosty® e recipientes de congelamento similares ou prateleiras de congelamento, encapsulação, ou similares. Em outra modalidade, um crioprotetor não precisa ser lavado a partir de tecidos ou células após congelamento. Em outra modalidade, um crioconservante também pode agir como um antioxidante e pode ser multi-benéfico para as células crioproconservadas, tecidos, extratos biológicos, soro ou semelhantes.
[028] Em ainda outras modalidades, um novo crioconservante pode ser usado em uma pressão osmótica fisiológica apropriada para o tipo de célula usado. O gradiente entre a pressão osmótica intracelular e a pressão osmótica intracelular pode ser diminuído ainda mais eficaz para reduzir a água intracelular. Além disso, em outra modalidade, a mudança de pressão osmótica pode ser suficiente para diminuir a água intracelular sem interromper a membrana plasmática ou outras membranas, organelas ou ligações de tecido dentro da célula ou tecido a serem crioconservados. Em outras modalidades, um novo crioconservante pode ser utilizado para aumentar a viscosidade do meio usado para criopreservação ou mesmo vitrificação. Outra modalidade da presente invenção pode incluir a encapsulação dos referidos materiais em um lipossoma ou outra vesícula discreta. Tal recinto pode ajudar os materiais permanecerem em suspensão até o momento em que elas sejam necessárias para estarem em contato com a célula, tecido, extrato biológico, soro ou outros materiais biológicos.
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13/58 [029] As modalidades da presente invenção podem proporcionar utilização para Rastreamento de Líquido onde agentes podem ser requeridos para ter tendências de formação de vidro com baixas viscosidades apropriadas e mesmo toxicidades. Em tal aplicação, pode fornecer concentrações incrementalmente crescentes de crioprotetores de penetração. As modalidades da presente invenção podem ser utilizadas para a criação de uma viscosidade extremamente elevada, talvez para permitir a vitrificação sem nucleação e cristalização de gelo, crescimento de cristais. Um produto resultante pode permitir a obtenção de um estado vítreo em temperaturas extremamente baixas. Esta obtenção pode ser o resultado de interferir com a cinética de crescimento de cristais, a formação de um núcleo de gelo ou mesmo a estrutura da formação de gelo. Em ainda outras modalidades da presente invenção, a tecnologia pode ser utilizada em uma faixa de temperaturas, incluindo resfriamento ou congelamento a cerca de 17° C, cerca de 4o C, cerca de -20° C, cerca de -80° C, cerca de -196° C ou qualquer um da infinidade de temperaturas entre. Além disso, a temperatura pode se estender abaixo daquela do nitrogênio líquido.
[030] A presente invenção pode fornecer, em algumas modalidades, a aplicação de tecnologias a uma variedade de volumes de amostra a partir de < cerca de 1 μΐ e talvez em uma grade de microscópio eletrônico para talvez muitos litros de volume de amostra, tal como requerido para perfusão de órgãos. Outros sistemas podem incluir canudos (variando de cerca de 250 a cerca de 5 ml), cortes abertos, semi-canudos, criotopos, crobotipos, microcapilares de quartzo, ou semelhantes. Modalidades da presente invenção podem ser aplicadas a não apenas células livres, tais como células de esperma, mas também se aplica àqueles que podem ser funcionalmente interconectados, tais como aqueles em músculos lisos ou similares. Em ainda outra modalidade, tecidos ou órgãos de células a serem crioconservados podem ser isolados de fontes procarióticas ou eucarióticas incluindo fontes
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14/58 de mamíferos, fontes vegetais, fontes fúngicas, protistas, arqueobactérias, bactérias, ou podem ser eucariotas. Estas células, tecidos, órgãos, materiais biológicos, pode ser utilizada em um número de diferentes campos incluindo, mas não limitado a, terapia reprodutiva, transplante de células tronco hematopoiéticas, bancários de sementes, bancários de oócitos ou embriões, banco de recursos genéticos de plantas, medicina regenerativa. Cada um dos mencionados acima pode estar em uma variedade de concentrações incluindo uma única célula em solução tal como um oócito, milhões de células por mililitro no caso de células de esperma, > cerca de 1 milhão de células no caso de um órgão ou tecido complexo, ou similar.
[031] Modalidades da presente invenção podem ser utilizadas para prolongar o uso de material biológico crioconservado, talvez através da inibição de danos tradicionalmente induzidos por tecnologias de criopreservação tradicionais [032] Em ainda outras modalidades, a presente invenção pode fornecer uma interação química reduzida com biomoléculas sensíveis, reduzida permeação de crioprotetor, e podem mesmo permitir o uso do crioprotetor em diferentes faixas de temperatura ou com diferentes taxas de congelamento do que as que podem ter sido tradicionalmente utilizadas, desse modo limitando o dano à célula, órgão, tecido ou extrato biológico.
[033] Criopreservação ou congelamento pode se referir a um processo em que organelas, células, tecidos, matriz extracelular, os órgãos ou outros constituintes biológicos são preservados por resfriamento até uma temperatura onde as atividades bioquímicas são desaceleradas ou cessadas temporariamente, a fim de preservar a estrutura bioquímica e funções quando as organelas, células, tecidos, matriz extracelular, órgãos ou outros constituintes biológicos são aquecidos a temperaturas bioquimicamente ativas. A criopreservação pode ser entendida como abrangendo uma variedade de temperaturas para armazenamento, incluindo quaisquer
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15/58 temperaturas que retardam ou inibem a atividade bioquímica e pode geralmente se situar na faixa de 4o C a -196° C E pode incluir temperaturas de refrigeração, criogênicas ou quase congelantes. Além disso, a criopreservação pode abranger os vários métodos para a obtenção da redução em temperaturas incluindo a vitrificação, arrefecimento em duas etapas, ou semelhantes. A vitrificação pode ser uma solidificação de uma solução em baixa temperatura, obtendo-se uma alta viscosidade, talvez sem nucleação e cristalização de gelo.
[034] Material biológico pode se referir a quaisquer organelas, células, tecidos, matriz extracelular, órgãos ou outros constituintes biológicos que podem ser crioconservados a partir de uma variedade de fontes incluindo fontes procarióticas ou eucarióticas incluindo fontes de mamíferos, fontes vegetais, fontes fúngicas, protista, arqueobactérias, bactérias, ou podem ser eucariotas.
[035] Um crioprotetor pode ser o uso de um agente que diminui ou mesmo impede o dano de matérias biológicas criopreservadas através da HPT uma variedade de mecanismos e ações incluindo prevenção de formação de gelo intracelular, dessecação ou criação de uma solução hipoosmótica. Um crioprotetor pode ser um soluto que, quando adicionado a células em seu meio, pode permitir maiores recuperações de pósdescongelamento do que se não estivessem presentes (Elliott et al 2017). Agente crioprotetor, crioconservante ou criopreservação pode ser considerado como termos equivalentes.
[036] A ocorrência natural pode se referir a materiais que podem ser derivados de uma fonte biológica encontrada na natureza [037] Um extrato pode incluir qualquer variação de compostos que podem ser isolados como uma porção bruta ou refinada ou grupo de porções. Por exemplo, um extrato de etanol pode incluir a incubação de uma
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16/58 quantidade de etanol com uma quantidade de etanol. A solução resultante, se filtrado ou não filtrado, pode ser chamado de ‘extrato’.
[038] Um agente osmótico pode incluir aqueles materiais que criam uma osmolalidade maior do que aquela interna a uma célula, tecido, órgão ou extrato biológico que causa uma resposta hiperosmótica. Isto é, faz com que a água escorra para fora da célula. Deve ser entendido que a invenção abrange aqueles agentes osmóticos não listados, mas que pode ser considerado como um agente osmótico e pode ser compatível com o material a ser crioconservado.
[039] Tecidos e células usadas em modalidades da presente invenção podem incluir um ou uma pluralidade de oócitos, células de esperma, embriões, células tronco embrionárias, ou quaisquer outras células ou linhagens celulares. Tecidos e células podem ser humanos, não-mamíferos, humanos, não-animal, talvez obtido de qualquer espécie de animal sem limitação de bovino, equino, ovino, ou espécies de suíno ou raça, ou células de aves obtidas sem limitação de frangos, patos, gansos, perus, faisões, e codomas, ou similares. Tecidos e células também podem incluir uma pluralidade de células, e/ou tecidos a partir de uma pluralidade de fontes tais como células vegetais mais células de esperma de mamíferos e pode não ser uma composição homogênea de tipos de células ou tecidos.
[040] Extratos individualmente ou em várias combinações ou como composições preparadas por técnicas de biologia molecular ou técnicas de síntese química que contêm porções ou combinações de tais porções identificadas dentro de tais extratos de origem vegetal como descrito aqui e sem limitação podem incluir composições que compreendem qualquer um ou qualquer combinação dos mesmos: pelo menos uma quantidade de atividade antioxidante de pelo menos 90 micromolar de Trolox equivalente por grama, uma quantidade de ácidos graxos de pelo menos 3 por cento (tal como ácido palmítico, ácido linoleico, ácido esteárico e suas misturas) ou
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17/58 uma quantidade de compostos polifenólicos de pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas, ou como especificamente descrito aqui. Uma composição pode incluir tocoferóis de cerca de 60 mg/100g ou mesmo lipídeos polares de cerca de 10% a cerca de 15%.
[041] As modalidades da presente invenção podem fornecer um crioprotetor derivado de planta para o congelamento de tecidos e células que incluem um extrato de planta e possivelmente também um agente osmótico adicional. Exemplos de um extrato de planta podem incluir, mas não é limitada a um extrato produzido a partir de uma planta de um ou mais dos seguintes gêneros: Hippophae, Vitis, Pruns, Punica, Vaccinium, Primus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, ou semelhantes, e qualquer combinação dos mesmos. Outros exemplos de extratos vegetais podem incluir, mas não é limitada a, extratos dos seguintes gêneros e espécies: Hippophae (tais como espinheiromarítimo), Vitis (tal como uva), Prunus, Prunus Padus (tais como chokecherry ou até chokeberry), Punica (tal como romãzeira), Vaccinium (tal como mirtilo), Euterpe (tal como açaí), Glycine (tal como soja), Lycium (tal como gogi), Carya (tal como noz-pecã), Rosacea (tal como morango), Litchi (tal como lichia), Amelanchier (tal como saskatoon), Olea (tal como azeitona), ou similar, e qualquer combinação dos mesmos.
[042] Um crioprotetor tradicional pode ser o agente osmótico adicional do qual pelo menos algumas das vacinas a quantidade tradicional de crioprotetor pode ser substituída por um extrato de planta. Exemplos de um agente osmótico adicional pode incluir, mas não está limitado a, acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclohexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol,
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18/58 glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil-formamida, metil-ureia, metil-glicose, metil-glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno glicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina, xilose ou similares.
[043] Um extrato de planta pode ser usado como uma substituição parcial para um crioprotetor tradicional, a combinação de extrato de planta para agente osmótico adicional pode variar. Por exemplo, uma proporção percentual de um extrato de planta para um agente osmótico adicional em um crioprotetor pode incluir, mas não é limitada a cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional; cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional; cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional; cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional; cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional; cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional; cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional; cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional; cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional. Naturalmente, qualquer faixa de razões percentuais (por exemplo, 0,1% - 99,9%) podem ser usados e todos são incluídos nesta descrição.
[044] Em outro exemplo, a quantidade de agente osmótico usada em combinação com um extrato de planta pode ser menor que cerca de 7% v/v
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19/58 em uma concentração final ou pode mesmo ser menor do que cerca de 5% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula. Outras quantidades de v/v em uma concentração final podem ser usadas incluindo, mas não limitadas a, menos que cerca de 10%, menos do que cerca de 6,5%, menos do que cerca de 6%, menos do que cerca de 5,5%, menos do que cerca de 4,5%, menos do que cerca de 4,5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3,5%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2,5%, menos do que cerca de 2%, menos do que cerca de 1,5%, menos do que cerca de 0,5%, ou semelhantes. Naturalmente, qualquer faixa de percentagens pode ser usada e todas são incluídas nesta descrição. Em um crioprotetor tradicional onde o glicerol pode ter sido usado como o único crioprotetor, uma quantidade padrão de glicerol pode ter sido entre cerca de 7% e cerca de 10% v/v em uma concentração final.
[045] Outras modalidades da presente invenção podem fornecer um crioprotetor derivado de planta para o congelamento de células consistindo em um extrato de planta. Exemplos de um extrato de planta podem incluir, mas não é limitada a um extrato produzido a partir de uma planta de um ou mais dos seguintes gêneros: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, ou similares e qualquer combinação dos mesmos. Outros exemplos de extratos vegetais podem incluir, mas não estão limitados a, extratos dos seguintes gêneros e espécies: Hippophae (tais como espinheiromarítimo), Vitis (tal como uva), Prunus, Prunus Padus (tais como chokecherry ou até chokeberry), Punica (tal como romãzeira), Vaccinium (tal como mirtilo), Euterpe (tal como açaí), Glycine (tal como soja), Lycium (tal como gogi), Carya (tal como noz-pecã), Rosacea (tal como morango), Litchi (tal como lichia), Amelanchier (tal como saskatoon), Olea (tal como azeitona), ou similar, e qualquer combinação dos mesmos. Um extrato de planta pode ter características tais como qualquer um ou mais de: pelo menos
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20/58 um antioxidante que proporciona pelo menos 90 mg/m2 equivalente por grama de dito extrato; pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato; e pelo menos um composto polifenólico que proporciona pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato, ou semelhantes.
[046] Ainda outras modalidades da presente invenção podem fornecer um sistema para o congelamento de tecidos e células que compreendem: composição crioprotetor compreendendo ou talvez consistindo em qualquer um ou mais dentre: pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol (micromolar) equivalente de Trolox por grama; pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume da dita composição crioprotetora; e pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas. Um crioprotetor tendo uma ou mais destas características pode ser um extrato de planta, ou podem ser meios quimicamente definidos, ou semelhantes.
[047] Em outras modalidades, a presente invenção pode fornecer um sistema para congelamento de tecidos ou células compreendendo um crioprotetor para congelamento de tecidos ou células, em que o dito crioprotetor pode ser capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda o dito crioprotetor tecidos ou ditas células entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol). Em outras modalidades, a presente invenção pode fornecer um sistema para congelamento de tecidos ou células compreendendo um crioprotetor para congelamento de tecidos ou células, em que o dito crioprotetor pode ser capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou as ditas células menores do que cerca de 5000 mOsm (miliosmoles). Naturalmente, outras opções podem incluir menos de 4500 mOsm, menos de 4000 mOsm, ou similares e qualquer e todos os números podem ser usados e todos são incluídos nesta descrição.
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21/58 [048] Um crioconservante típico pode ser de cerca de 4 A cerca de 8 vezes A pressão osmótica da célula. Portanto, a presente invenção pode prover, em várias modalidades, um múltiplo mínimo requerido para se obter um desequilíbrio osmótico como reduzido para talvez cerca de 3 a cerca de 7 vezes a pressão osmótica da célula ou até menos de cerca de 4 a menos de cerca de 8 vezes a pressão osmótica da célula, ou semelhantes. A presente invenção pode fornecer um desbalanceamento de pressão osmótica de um ambiente que circunda tecidos ou células entre cerca de 3 a cerca de 7 vezes a pressão osmótica da célula ou pode até mesmo fornecer um desequilíbrio de pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou ditas células entre menos do que cerca de 4 a menos do que cerca de 8 vezes a pressão osmótica da célula. Deve-se entender que uma tolerância hiperosômica pode ser aumentada pelo uso das várias modalidades apresentadas neste pedido. Além disso, a presente invenção pode proporcionar um método para reduzir mudanças de volume induzidas osmoticamente requeridas pelo uso de um novo crioprotetor. Entende-se que as tolerâncias de mudança de volume induzidas osmoticamente podem ser afetadas pela célula ou tipo de tecido.
[049] Métodos de realização da presente invenção podem incluir a obtenção de tecidos ou células, a criação de uma suspensão de ditos tecidos ou células; a adição de um crioprotetor de acordo com qualquer uma das várias modalidades aqui discutidas nos ditos tecidos ou células; e talvez até o congelamento dos ditos tecidos ou células. Um outro método da presente invenção pode fornecer um método melhorado para o congelamento de células e tecidos compreendendo as etapas de: produção de tecidos ou células; a criação de uma suspensão de ditos tecidos ou células; criando uma pressão osmótica da dita suspensão para entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmoles) com um crioprotetor; e talvez até o congelamento das ditas células.
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22/58 [050] Em uma etapa de fornecer tecidos ou células, as modalidades da presente invenção podem incluir a coleta de tecidos ou células, obtenção de tecidos ou células, ou qualquer outra maneira de produzir tecidos ou células disponíveis.
[051] Suspensões de tecidos ou células podem ser diluídas com um extensor ou outros componentes para o processo de congelamento. O congelamento de tecidos ou células pode incluir temperaturas abaixo de -4 graus Celsius e pode incluir criopreservação de resfriamento lento, vitrificação ou similar. Tecidos ou células podem incluir, mas não estão limitados a, células reprodutivas, células de esperma, oócitos, embriões e células tronco embrionárias.
[052] As modalidades da presente invenção podem proporcionar que, após a utilização de qualquer um dos diversos crioprotetores e tecidos ou células de congelamento ou similares, os tecidos e células podem ser descongelados de acordo com práticas padrões; e o tecido ou células descongeladas podem ser utilizados sem a lavagem de um crioprotetor dos tecidos e das células. Isto pode proporcionar menos desperdício, menos etapas, e eficiência ótima global para os processos de congelamento e pode mesmo permitir a recuperação de uma maior percentagem das células, tecidos, ou semelhantes.
[053] Modalidades da presente invenção podem fornecer encapsulação de crioprotetores talvez um lipossoma, outra vesícula discreta, ou similar. A encapsulação pode permitir a penetração de agentes osmóticos não permeáveis à membrana a tecidos, células, ou similar e pode mesmo permitir liberações controladas de crioprotetor de tal forma que uma célula possa ser exposta a FT gradiente contínuo de pressão osmótica que pode então diminuir o trauma ou dano a uma célula, tecido ou similar. Vários lipídeos ou outras vesículas podem ser usados, talvez dependendo do tipo de células ou tecidos
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Exemplo 1: estudo de esperma javali [054] Em um experimento, uma determinada percentagem do crioprotetor total no meio extensor, neste caso glicerol, foi substituído com óleo de espinheiro-marítimo. O glicerol compreendia cerca de 25% ou cerca de 75% da concentração total de crioprotetor. A concentração total de crioprotetor foi de cerca de 2% final (v/v), e a percentagem de mar do mar foi de cerca de 6% no tratamento de Al ou o oposto para o tratamento A2 em extensor de USDA (preparado pela combinação de 88 g/1 lactose, 20% (v/v) gema de ovo de galinha 1,5% pasta de Equex (Nova Chemical Sales Inc. Scituate, MA) e 80% de ddH20, pH 6,8 e osmolalidade de 300-320 mOsm antes da adição crioconservante).
[055] Uma alíquota de cada ejaculate foi diluída a 400 xl06 esperma/mL em tratamentos de Al ou A2. Sêmen completamente estendido foram colocados em canudos de 0,5 cc frio. O sêmen foi congelado colocando-se uma prateleira (mesa de congelamento de Sêmen Flutuante MOFA® #15042) contendo os canudos em vapor de nitrogênio líquido e congelado utilizando a curva a seguir: 4o C a -8o C a -20° C por minuto, -8o C a -120° C a -69° C por minuto, -120° C a -140° C a -20° C por minuto. As amostras foram então mergulhadas em nitrogênio líquido onde elas são retidas para armazenamento. Os canudos foram descongelados e foram analisados depois do aquecimento a 37° C (0 h.; Figura 1) ou após a manutenção a 37C por 3 horas (3 h.; Figura 2) para simular condições estressantes.
[056] Esperma foi analisado quanto à atividade de acrossoma utilizando-se FITC-PNA e a qualidade da membrana (utilizando-se o Sybrverde e o iodeto de propídio). Os dados desta análise são mostrados nas Figuras 1 e 2. Na Figura 1: Substituição de 3/4 do glicerol com espinheiromarítimo (Gameteguard ™ (GG); tratamento de Al), a percentagem de esperma tendo acrossomas intactos aumentados em aproximadamente 50%
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24/58 e a percentagem de células de esperma tendo membranas intactas (‘Vivas’ na Figura 1 & 2) aumentado em cerca de 19%. Em 3 horas, esta diferença tinha aumentado, talvez melhor ilustrado pela porcentagem de células mortas aumentada em cerca de 23% na amostra contendo mais glicerol (Fig. 2).
Tabela 1: Osmolalidade
Tratamento Osmolalidade
Al: 75% GG/25% glicerol 699
A2: 25% GG/75% glicerol 902
[057] Como pode ser visto na Tabela 1 acima, a substituição de 3/4 ou % do glicerol com óleo de polpa de espinheiro-marítimo diminui a osmolalidade. Embora esteja criando um ambiente hiperosmótico, este ambiente não pode ser tão extremo, diminuindo o dano nas células. Se o crioprotetor fosse 100% de glicerol, deve-se esperar que a osmolalidade seja maior do que 1000 mOsm.
Exemplo 2: Estudo de Espermatozóides [058] Em outra experiência, a concentração de glicerol variou para cerca de 2,5%, cerca de 3% ou cerca de 3,5% (v/v; concentração final) enquanto a concentração do óleo do mar do mar foi mantida constante a cerca de 5% (v/v; a concentração final). Ejaculatos de três (3) touros foram utilizados neste estudo de ejaculado dividido. O esperma foi coletado utilizando uma vagina artificial, a concentração e a motilidade determinadas pelos métodos padrão da indústria. Esperma foi diluído A 80x106 esperma/ml em parte de extensor de citrato de gema de ovo (sem crioprotetor, mas contendo 5% de óleo de espinheiro-marítimo) e resfriada a 4o C, então parte B contendo tanto 5%, 6% ou 7% de glicerol. Células de esperma em cada tratamento foram congeladas utilizando-se um dos três métodos denominados: rápido (F; 11 graus C/min)), normal (N; 17 graus C/min), ou lenta (S; 21 graus C/min).
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25/58 [059] Palhetas foram analisadas após aquecimento a 37° C. Como pode ser visto na Figura 3, a motilidade, um indicador da saúde do esperma pós-descongelamento, de amostras contendo 2,5% ou 3% de glicerol mais Oleo de espinheiro-marítimo (GG5 ou GG6) foram superiores com relação às amostras contendo 7% de glicerol com ou sem o espinheiro-marítimo (GG7). Portanto, a substituição do glicerol com óleo de espinheiro-marítimo proporciona benefícios para a saúde do esperma pós-descongelamento independentemente do método de congelamento. Em tudo exceto o método de congelamento rápido, o esperma todos os tratamentos GG foram superiores ao tratamento com 7% de glicerol.
Exemplo 3: Estudo de Espermatozóides [060] Em outra experiência, a concentração de glicerol usada variou entre 5%, 6% ou 7% (v/v); concentração final) enquanto a concentração do óleo de espinheiro-marítimo foi mantida constante a 5% (v/v; concentração final). Ejaculatos de três (3) touros foram utilizados neste estudo de ejaculado dividido. O esperma foi coletado utilizando uma vagina artificial, a concentração e a motilidade determinadas pelos métodos padrão da indústria. Esperma foi diluído a 80x106 esperma/ml em parte de extensor de citrato de gema de ovo (sem crioprotetor, mas contendo 5% de óleo de espinheiro-marítimo) e resfriado a 4o C, então parte B contendo tanto 5%, 6% ou 7% de glicerol. As células foram criopreservadas em seguida descongeladas para avaliar a saúde. As células de esperma foram analisadas imediatamente após o descongelamento e aquecimento a 37° C então, elas foram mantidas por 3 horas a 37° C.
[061] Canudos foram analisados após aquecimento a 37° C Como pode ser visto na Tabela 2, 5% ou 6% de glicerol mais óleo de espinheiromarítimo (GG5 ou GG6) foi superior a amostras contendo 7% de glicerol. Portanto, a substituição do glicerol com o óleo do Mar Do Mar proporciona benefícios às células de esperma, especialmente durante as condições
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26/58 estressantes (comparar 3 horas. 7% De Glicerol vs 5% de glicerol + 5% de espinheiro-marítimo.
Tabela 2:
Tempo Tratamento Acrossomo intacto, células vivas Mudança na saúde celular, de 0 a 3 horas
0 horas pós congelamento 5% glicerol + 5% espinheiromarítimo 64,75
7% glicerol 64,5
3 horas pós congelamento 5% glicerol + 5% espinheiromarítimo 57,25 -7,5
7% glicerol 52,5 -12
Exemplo 4: esperma de Cabra [062] Estudo de ejaculado dividido foi usado para avaliar a criosobrevivência de esperma de cabra em que glicerol é substituído em parte com óleo de polpa de espinheiro marítimo, óleo de polpa do espinheiro(GGP) mais suco de espinheiro-marítimo (GG1). Os ejaculatos foram coletados a partir de duas cabras e divididos em diferentes tratamentos a 25xl06 esperma/ml. Crioprotetor foi de 5% ou 10% (v/v final). Neste experimento uma percentagem do glicerol foi substituída com óleo de espinheiro-marítimo (a 5% final v/v). Adicionalmente, em um tratamento, o suco do espinheiro-marítimo foi adicionado a 3%. Este experimento foi conduzido como um congelamento de 1 etapas. Isto é, esperma foi diluído
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27/58 no extensor de citrato de gema de ovo contendo crioconservante, então resfriado e congelado.
[063] Sêmen foi congelado colocando-se uma prateleira (mesa de congelamento de Sêmen Flutuante MOFA ® #15042) contendo os canudos em vapor de nitrogênio líquido, então, armazenado em nitrogênio líquido para análise posterior.
[064] A saúde de esperma foi avaliada por dissecções de descongelamento em um banho de água a 37° C Por 30-60 segundos. Análise de 0 E 3 horas foi realizada utilizando o CASA para motilidade e Citometria de Fluxo para integridade viva/morta e acrossoma.
[065] O mostrado a seguir demonstra um exemplo não limitativo da composição dos materiais acima mencionados usados para substituir o glicerol como um crioconservante:
Antioxidante (μΜ/g equivalente de Trolox) Compostos polifenólicos (equivalentes de ácido gálico; mg por 100g de material bruto) Lipídeo (%)
Óleo de polpa de Hippophae 1290 216 80
Suco de Hippophae 2674 126 7
Glicerol* 0 0 0*
* Precursor para a síntese de triacilgliceróis e fosfolipídios [066] Embora a invenção tenha sido descrita com relação a algumas modalidades preferidas, não se destina a limitar o escopo da invenção à
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28/58 forma particular apresentada, mas ao contrário, pretende-se cobrir tais alternativas, modificações, e equivalentes que podem ser incluídos dentro do espírito e escopo da invenção como definido pelas declarações da invenção. Exemplos de reivindicações alternativas podem incluir:
[067] 1. Um crioprotetor derivado de planta para o congelamento de tecidos e células compreendendo:
- um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos; e
-um agente osmótico adicional.
[068] 2. Um crioprotetor derivado de planta de acordo com a cláusula ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito crioprotetor derivado de planta selecionado a partir de um grupo consistindo em:
- cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
- cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
- cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
- cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
- cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
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- cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
- cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
- cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
- cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
- cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
[069] 3. Um crioprotetor derivado de planta de acordo com a cláusula ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende menos do que cerca de 7 % v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula.
[070] 4. Um crioprotetor derivado de planta de acordo com a cláusula ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende glicerol.
[071] 5. Um crioprotetor derivado de planta de acordo com a cláusula ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional é selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclo-hexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol,
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30/58 proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno glicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
[072] 6. Um crioprotetor derivado de planta de acordo com a cláusula ou qualquer outra cláusula em que o dito extrato de planta compreende:
- pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalente por grama de dito extrato; e
- pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato.
[073] 7. Um crioprotetor derivado de planta de acordo com a cláusula ou qualquer outra cláusula em que o dito extrato de planta compreende pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato.
[074] 8. Um crioprotetor derivado de planta de acordo com A cláusula ou qualquer outra cláusula em que o agente crioprotetor derivado de planta é capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou ditas células entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol).
[075] 9. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos compreendendo as etapas de:
- fornecer tecidos ou células;
- criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
- adicionar um crioprotetor derivado de planta aos ditos tecidos ou células; e
- congelar os ditos tecidos ou células;
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31/58 em que o dito crioprotetor derivado de planta compreende:
- um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos; e
- um agente osmótico adicional.
[076] 10. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outro e ainda compreendendo uma etapa de diluir a dita suspensão dos ditos tecidos ou das ditas células.
[077] 11 . Método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito crioprotetor derivado de planta selecionado a partir de um grupo consistindo em:
- cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
- cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
- cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
- cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
- cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
- cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
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- cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
- cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
- cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
- cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
[078] 12. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula [079] 13. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende glicerol.
[080] 14. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional é selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclohexanodiol, dextrano, dietileno giicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno giicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno giicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol,
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33/58 propileno glicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
[081] 15. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula em que o dito extrato de planta compreende:
- pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalente por grama de dito extrato; e
- pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato.
[082] 16. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 15 ou qualquer outra cláusula em que o dito extrato de planta compreende pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato.
[083] 17. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula em que a dita etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células compreende uma etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células a menos de -4 graus Celsius.
[084] 18. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula em que a dita etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células é selecionada a partir de um grupo consistindo em congelamento por taxa controlada, vitrificação, congelamento ultra-rápido, congelamento ultra-rápido, utilizando-se um sistema micro-capilar, vitrificação ultra-rápida, rastreamento de líquido, congeladores programáveis lentos e reprofusão, duas etapas.
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34/58 [085] 19. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma etapa de:
descongelamento dos ditos tecidos ou células congeladas; e uso do dito tecido congelado ou das células sem a lavagem do dito crioprotetor dos ditos tecidos e das células.
[086] 20. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula em que os ditos tecidos ou células são selecionados a partir de um grupo consistindo em células reprodutivas, células de esperma, oócitos, embriões e células tronco embrionárias.
[087] 21. Um método melhorado para congelar células e tecidos de acordo com a cláusula 9 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma etapa de criar uma pressão osmótica da dita suspensão para entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol) antes da etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células.
[088] 22. Um sistema para congelamento de tecidos ou células compreendendo um crioprotetor para congelamento de tecidos ou células, em que o dito crioprotetor é capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou as ditas células entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol).
[089] 23. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 22 ou qualquer outra cláusula em que o dito crioprotetor compreende um meio quimicamente definido.
[090] 24. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 22 ou qualquer outra cláusula em que o dito crioprotetor compreende um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo
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35/58 consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos.
[091] 25. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com A cláusula 22 ou qualquer outra cláusula em que a dita composição crioprotetora ainda compreende um agente osmótico adicional.
[092] 26. Sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 25 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito crioprotetor selecionado a partir de um grupo consistindo em:
- cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
- cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
- cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
- cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
- cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
- cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
- cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
- cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
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- cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
- cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
[093] 27. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 25 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula [094] 28. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 25 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende glicerol.
[095] 29. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 25 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional é selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclohexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinil pirrolidona, prolina, propanodiol, propileno glicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
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37/58 [096] 30. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com A cláusula 24 ou qualquer outra cláusula em que o dito extrato de planta compreende:
- pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalente por grama de dito extrato; e
- pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato.
[097] 31. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com A cláusula 30 ou qualquer outra cláusula em que o dito extrato de planta compreende pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato.
[098] 32. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos compreendendo as etapas de:
- fornecer tecidos ou células;
- criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
- criar uma pressão osmótica da dita suspensão para entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmoles) com um crioprotetor; e
- congelar as ditas células [099] 33. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula em que o dito crioprotetor compreende um meio quimicamente definido.
[0100] 34. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma etapa de diluir a dita suspensão dos ditos tecidos ou das ditas células.
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38/58 [0101] 35. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula em que o dito crioprotetor compreende um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos.
[0102] 36. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula em que a dita composição crioprotetora ainda compreende um agente osmótico adicional.
[0103] 37. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito crioprotetor selecionado a partir de um grupo consistindo em:
- cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
- cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
- cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
- cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
- cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
- cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
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39/58
- cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
- cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
- cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
- cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
[0104] 38. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula.
[0105] 39. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende glicerol.
[0106] 40. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional é selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclohexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil-ureia, metil-glicose, metil-glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol,
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40/58 propileno glicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
[0107] 41. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 35 ou qualquer outra cláusula em que o dito extrato de planta compreende:
- pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalente por grama de dito extrato; e
- pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato [0108] 42. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 41 ou qualquer outra cláusula em que o dito extrato de planta compreende pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato.
[0109] 43. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula em que a dita etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células compreende uma etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células a menos de -4 graus Celsius.
[0110] 44. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 32 ou qualquer outra cláusula em que os ditos tecidos ou células são selecionados a partir de um grupo consistindo em células reprodutivas, células de esperma, oócitos, embriões e células tronco embrionárias.
[0111] 45. Sistema para o congelamento de tecidos e células compreendendo:
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41/58 uma composição criogênica compreendendo:
pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol (micromolar) de Trolox equivalente por grama; e pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume da dita composição crioprotetora.
[0112] 46. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com A cláusula 45 ou qualquer outra cláusula em que a dita composição crioprotetora compreende pelo menos um composto polifenólico que proporciona pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas.
[0113] 47. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 45 ou qualquer outra cláusula em que o dito crioprotetor compreende um meio quimicamente definido.
[0114] 48. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 45 ou qualquer outra cláusula em que a dita composição crioprotetora compreende um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos.
[0115] 49. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com A cláusula 45 ou qualquer outra cláusula em que a dita composição crioprotetora ainda compreende um agente osmótico adicional.
[0116] 50. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 49 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional na dita composição crioprotetora selecionada a partir de um grupo consistindo em:
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- cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
- cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
- cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
- cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
- cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
- cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
- cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
- cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
- cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
- cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
[0117] 51. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 49 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula [0118] 52. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com A cláusula 49 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende glicerol.
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43/58 [0119] 53. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 49 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional é selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclohexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno glicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
[0120] 54. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com A cláusula 45 ou qualquer outra cláusula em que a dita composição crioprotetora é capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou ditas células entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol).
[0121] 55. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos compreendendo as etapas de:
- fornecer tecidos ou células;
- criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
- adicionar um crioprotetor aos ditos tecidos ou células; e
- congelar ditos tecidos ou células;
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44/58 em que o dito crioprotetor compreende:
pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol (Micromolar) de Trolox equivalente por grama; e pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume da dita composição crioprotetora.
[0122] 56. Um método melhorado para congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula em que o dito crioprotetor compreende pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas.
[0123] 57. Um método melhorado para o congelamento de tecidos e células de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula em que o dito crioprotetor compreende um meio quimicamente definido.
[0124] 58. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma etapa de diluir a dita suspensão dos ditos tecidos ou das ditas células.
[0125] 59. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula em que o dito crioprotetor compreende um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos.
[0126] 60. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula em que o agente crioprotetor ainda compreende um agente osmótico adicional.
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45/58 [0127] 61. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 60 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito crioprotetor selecionado a partir de um grupo consistindo em:
- cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
- cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
- cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
- cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
- cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
- cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
- cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
- cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
- cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
- cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
[0128] 62. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 60 ou qualquer outra cláusula em que o dito
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46/58 agente osmótico adicional compreende menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula.
[0129] 63. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 60 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional compreende glicerol.
[0130] 64. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 60 ou qualquer outra cláusula em que o dito agente osmótico adicional é selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclohexanodiol, dextrano, dietileno giicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno giicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil-ureia, metil-glicose, metil-glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno giicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno giicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno giicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
[0131] 65. Um método melhorado para congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula em que a dita etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células compreende uma etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células a menos de -4 graus Celsius.
[0132] 66. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula em que a dita
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47/58 etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células é selecionada a partir de um grupo consistindo em congelamento por taxa controlada, vitrificação, congelamento ultra-rápido, congelamento ultra-rápido, utilizando-se um sistema micro-capilar, vitrificação ultra-rápida, rastreamento de líquido, congeladores programáveis lentos e reprofusão, duas etapas.
[0133] 67. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma etapa de:
descongelar ditos tecidos ou células congeladas; e utilizar o dito tecido congelado ou das células sem a lavagem do dito crioprotetor dos ditos tecidos e das células [0134] 68. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula em que os ditos tecidos ou células são selecionados a partir de um grupo consistindo em células reprodutivas, células de esperma, oócitos, embriões e células tronco embrionárias.
[0135] 69. Um método melhorado para congelar células e tecidos de acordo com a cláusula 55 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma etapa de criar uma pressão osmótica da dita suspensão para entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol) antes da etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células.
[0136] 70. Um crioprotetor derivado de planta para o congelamento de células consistindo em um extrato de planta, dito extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado dentre um grupo consistindo em:
Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Primus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos;
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48/58 em que o dito extrato de planta compreende:
pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalente por grama de dito extrato; e pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato.
[0137] 71. Um método melhorado para o congelamento de células compreendendo as etapas de:
- fornecer tecidos ou células;
- criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
- adicionar um crioprotetor aos ditos tecidos ou células; e
- congelar os ditos tecidos ou células;
em que o dito crioprotetor compreende:
pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalente por grama de dito extrato; e pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato [0138] 72. Um método melhorado para o congelamento de células de acordo com a cláusula 9, 32, 55, 71 ou qualquer outra cláusula e ainda compreendendo uma etapa de encapsular o dito crioprotetor em pelo menos um tipo de lipossoma.
[0139] 73. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos compreendendo as etapas de:
- fornecer tecidos ou células;
- criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
- criar uma pressão osmótica da dita suspensão a menos de cerca de 5000 mOsm (miliosmoles) com um crioprotetor
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- congelar ditas células [0140] 74. Um sistema para congelamento de tecidos e células de acordo com A cláusula 45 ou qualquer outra cláusula em que a dita composição crioprotetora é capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou as ditas células a menos do que cerca de 5000 mOsm (miliosmoles).
[0141] 75. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos compreendendo as etapas de:
- fornecer tecidos ou células;
- criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
- fornecer um desequilíbrio de pressão osmótica da dita suspensão entre cerca de 3 a cerca de 7 vezes a pressão osmótica dos ditos tecidos ou células com um crioprotetor; e congelando os ditos tecidos ou células.
[0142] 76. Um método melhorado para o congelamento de células e tecidos compreendendo as etapas de:
- fornecer tecidos ou células;
- criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
- fornecer um desequilíbrio de pressão osmótica da dita suspensão entre menos do que cerca de 4 a menos do que cerca de 8 vezes a pressão osmótica dos ditos tecidos ou células com um crioprotetor; e
- congelar ditos tecidos ou células.
[0143] 77. Um sistema para congelamento de tecidos ou células compreendendo um crioprotetor para congelamento de tecidos ou células, em que o dito crioprotetor é capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda o dito crioprotetor tecidos ou células a menos do que cerca de 5000 mOsm (miliosmoles).
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50/58 [0144] 78. Um sistema para congelamento de tecidos ou células compreendendo um crioprotetor para congelamento de tecidos ou células, em que o dito crioprotetor é capaz de criar um desequilíbrio de pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou ditas células entre cerca de 3 a cerca de 7 vezes a pressão osmótica da célula.
[0145] 79. Um sistema para congelamento de tecidos ou células compreendendo um crioprotetor para congelamento de tecidos ou células, em que o dito crioprotetor é capaz de criar um desequilíbrio de pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou as ditas células entre menos do que cerca de 4 a menos do que cerca de 8 vezes a pressão osmótica da célula.
[0146] Como pode ser facilmente entendido a partir do precedente, os conceitos básicos da presente invenção podem ser incorporados em uma variedade de formas. Ela envolve tanto técnicas de criopreservação assim como dispositivos para realizar a qualidade de pós-descongelamento apropriada da célula. Neste pedido, as técnicas crioprotetoras são apresentadas como parte dos resultados mostrados na figura obtido pelos vários dispositivos descritos e como etapas inerentes à utilização. Elas são simplesmente o resultado natural da utilização dos dispositivos como pretendido e descrito. Além disso, embora alguns dispositivos sejam descritos, deve ser entendido que estes não apenas realizam certos métodos, mas também podem ser variados de diversas maneiras. De forma importante, de acordo com todo o precedente, todas estas facetas devem ser entendidas como abrangidas por esta descrição.
[0147] A discussão incluída neste pedido é destinada a servir como uma descrição básica. O leitor deve estar ciente de que a discussão específica não pode descrever explicitamente todas as modalidades possíveis; muitas alternativas são implícitas. Também pode não explicar completamente a natureza genérica da invenção e pode não mostrar explicitamente como cada
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51/58 característica ou elemento pode, na verdade, ser representativa de uma função mais ampla ou de uma grande variedade de elementos alternativos ou equivalentes. Mais uma vez, estes são implicitamente incluídos nesta apresentação. Onde a invenção é descrita em terminologia orientada por dispositivo, cada elemento do dispositivo executa implicitamente uma função. As reivindicações do aparelho podem não somente ser incluídas para o dispositivo descrito, mas também método ou reivindicações de processo podem ser incluídos para tratar as funções da invenção e cada elemento executa. Nem a descrição nem a terminologia destina-se a limitar o escopo das reivindicações que serão incluídas em qualquer pedido de patente subsequente.
[0148] Deve-se entender também que uma variedade de mudanças pode ser feita sem fugir da essência da invenção. Tais mudanças são também implicitamente incluídas na descrição. Elas ainda caem dentro do escopo desta invenção. Uma ampla descrição que abrange tanto a(s) modalidade(s) explícita mostrada, a grande variedade de modalidades alternativas implícitas e os métodos ou processos amplos e similares são abrangidos por esta descrição e podem ser baseados quando estirando as reivindicações para qualquer aplicação de patente subsequente. Deve ser entendido que tais mudanças de linguagem e reivindicações mais amplas ou mais detalhadas podem ser realizadas em uma data posterior (tal como por qualquer prazo requerido) ou no caso em que o requerente procura subsequentemente um depósito de patente com base neste depósito. Com este entendimento, o leitor deve estar ciente de que esta descrição deve ser usada deve-se entender que o suporte de qualquer pedido de patente depositado subsequentemente que possa buscar o exame de um amplo espectro base de reivindicações como considerada dentro da direita do requerente e pode ser projetada para produzir uma patente que cobre numerosos aspectos da invenção tanto independentemente como um sistema global.
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52/58 [0149] Além disso, cada um dos vários elementos da invenção e reivindicações também pode ser realizado em uma variedade de maneiras. Adicionalmente, quando usado ou implicado, um elemento deve ser entendido como abrangendo estruturas individuais, bem como várias estruturas que podem ou não estar fisicamente conectadas. Esta descrição deve ser entendida como abrangendo cada tal variação, sendo a mesma uma variação de uma modalidade de qualquer modalidade de aparelho, método ou configuração de processo, ou mesmo meramente uma variação de qualquer elemento destes. Particularmente, deve-se entender que a presente invenção refere-se a elementos da invenção, as palavras para cada elemento podem ser expressas por termos de aparelhos equivalentes ou termos de método-mesmo se apenas a função ou resultado é o mesmo. Tais termos equivalentes, mais amplos ou mesmo mais genéricos devem ser considerados como abrangidos na descrição de cada elemento ou ação. Tais termos podem ser substituídos quando desejado para a apresentação explícita da cobertura implicitamente ampla à qual esta invenção é intitulada. Como um exemplo, deve-se entender que todas as ações podem ser expressas como um meio para a tomada de ação ou como um elemento que causa essa ação. Similarmente, cada elemento físico apresentado deve ser compreendido como abrangendo uma descrição da ação que o elemento físico facilita. Com relação a este último aspecto, mas como um exemplo, a descrição de um extrato deve ser entendida como englobando a revelação da presente invenção ato de “extrair” - se explicitamente discutido ou não - e, inversamente, foram realizadas efetivamente a ação de “extração”, tal descrição deve ser entendida como englobando a descrição de um extrato e mesmo um meio para extração. Pretende-se que tais mudanças e termos alternativos sejam explicitamente incluídos na descrição. Além disso, cada um desses meios (quer explicitamente assim descrito ou não) deve ser entendido como abrangendo todos os elementos que podem desempenhar a função dada, e
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53/58 todas as descrições de elementos que realizam uma função descrita devem ser entendidas como um exemplo não limitante de meios para a realização dessa função.
[0150] Quaisquer patentes, publicações, ou outras referências mencionadas neste pedido de patente são aqui incorporadas por referência. Qualquer caso de prioridade (s) reivindicado por este pedido é aqui anexado e incorporado por referência. Além disso, quanto a cada termo usado, devese entender que, a não ser que especificado a utilização deste pedido é inconsistente com interpretação de suporte ampla, as definições comuns do dicionário devem ser entendidas como incorporadas para cada termo e todas as definições, termos alternativos, e sinônimos tais como contidos no Random House Webster’s Unabrudged Dictionary, Segunda edição, são aqui incorporados por referência. Finalmente, todas as referências listadas em qualquer lista de referências, incluindo aquelas listadas abaixo, ou outra declaração de informações arquivada com o pedido de patente e aqui incorporada por referência, no entanto, de acordo com cada um dos acima, até o ponto em que tais informações ou declarações incorporadas por referência podem ser consideradas inconsistentes com o patenteamento desta invenção(s) tais declarações não devem ser consideradas como feitas pelo requerente(s).
PATENTES US
Número da Patente Código ‘Kind’ Data de emissão Requerente
6495532 Bl 17/12/2002 Bathurst et al.
7960098 B2 14/06/2011 Roy et al.
9603355 B2 28/03/2017 Matsumura et al.
8420307 B2 16/04/2013 Ostermeier et al.
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54/58
8202558 B2 19/06/2012 Herickhoff et al.
7622143 B2 24/11/2009 Herickhoff et al.
PUBLICAÇÕES US
Número da Patente Código ‘Kind’ Data de publicação Requerente
20110086336 Al 14/04/2011 Herickhoff et al.
LITERATURA NÃO-PATENTARIA
ELLIOTT, Gloria D., Shangping Wang, Barry J. Fuller, ELSEVIER, Cryoprotectants: A review of the actions and applications of cryoprotective solutes that modulate cell recovery from ultra-low temperatures, Cryobiology 76:74-91, www.elseyier;coiii/locM 18 de abril de 2017, 18 páginas
BARNES, David and Gordon Sato, Methods for Growth of Cultured Cells in Serum-Free Medium, Analytical Biochemistry 102, 255-270, 17 de outubro de 1979, 16 páginas
LIU, Jie, Cigdem Tanrikut, Diane L. Wright, Gloria Y. Lee, Mehmet Toner, John D. Biggers, Thomas L. Toth, ELSEVIER, Cryopreservation of human spermatozoa with minimal non-permeable cryoprotectant, Cryobiology 72: 162-167, www.elsevier.com/locate/ycryo, 4 de Agosto de 2016, 6 páginas
SIEME, Harald, Harriêtte Oldenhof, Willem F. Wolkers, Mode of action of cryoprotectants for sperm preservation, ELSEVIER Animal Reproduction Science 169:2-5, www,elseyier.com/lpcalp/anireprpsci, 3 de fevereiro de 2016, 4 páginas
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55/58 [0151] Assim, a requerente deve ser entendida como tendo suporte para a reivindicação e fazer uma declaração de invenção a pelo menos: i) cada um dos dispositivos crioprotetor como aqui descrito e descrito, ii) os métodos relacionados apresentados e descritos, iii) variações similares, equivalentes e mesmo implícitas de cada um destes dispositivos e métodos, iv) aqueles projetos alternativos que realizam cada uma das funções mostradas são descritas e divulgadas, v) aqueles projetos alternativos e métodos que realizam cada uma das funções mostradas como estão implícitas para realizar aquela que é apresentada e descrita, vi) cada característica, componente, e etapa mostradas como invenções separadas e independentes, vii) as aplicações melhoradas pelos vários sistemas ou componentes apresentados, viii) os produtos resultantes produzidos por tais sistemas ou componentes, ix) cada sistema, método e elemento mostrado ou descrito como agora aplicado a qualquer campo ou dispositivos específicos mencionados, x) métodos e aparelhos substancialmente conforme descrito anteriormente e com referência a qualquer um dos exemplos anexos, xi) um aparelho para a realização dos métodos aqui descritos compreendendo meios para a realização das etapas, xii) as várias combinações e permutações de cada um dos elementos apresentados, xiii) cada reivindicação ou conceito potencialmente dependente como uma dependência de cada uma das reivindicações independentes ou conceitos apresentados, e xiv) todas as invenções aqui descritas.
[0152] Com relação às reivindicações se a seguir ou posteriormente apresentada para exame, deve ser entendido que por razões práticas e de modo a evitar grande expansão da carga de exame, o requerente pode, em qualquer momento, apresentar apenas reivindicações iniciais ou talvez apenas reivindicações iniciais com apenas dependências iniciais. O escritório e quaisquer terceiros pessoas interessadas no escopo potencial desta ou aplicações subsequentes devem entender que reivindicações mais amplas
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56/58 podem ser apresentadas em uma data posterior neste caso, em um caso reivindicando o benefício deste caso, ou em qualquer continuação a despeito de quaisquer emendas preliminares, outras emendas, linguagem de reivindicação ou argumentos apresentados, assim, por toda a pendência de qualquer caso, não há intenção de ganhar qualquer matéria em questão potencial. Deve ser entendido que se ou quando reivindicações mais amplas são apresentadas, isto pode exigir que qualquer técnica anterior relevante que possa ter sido considerada em qualquer momento anterior possa precisar ser revisitada uma vez que é possível que a extensão em que quaisquer emendas, linguagem de reivindicação, ou argumentos apresentados neste ou qualquer aplicação subsequente são considerados como feitos para evitar tal técnica anterior, tais razões podem ser eliminadas pelas reivindicações apresentadas posteriormente ou semelhantes. O examinador e qualquer pessoa interessada de outra forma na cobertura de potencial existente ou posterior, ou considerando-se, em qualquer momento, qualquer possibilidade de uma indicação de renúncia ou segurança de cobertura potencial, deve-se perceber que não se pretende que nenhum surgido ou renúncia sempre exista ou qualquer aplicação subsequente. Limitações tais como surgiram em Hakim v. Cannon Avent Group, PLC, 479 F.3d 1313 (Fed. Cir 2007), ou semelhantes, não se destinam a isto ou qualquer matéria relacionada subsequente. Além disso, deve-se entender que o suporte existe para o grau requerido sob as novas leis de matéria - incluindo, mas não se limitando a, Artigo de Convenção de Patente Europeu 123 (2) e a Lei de Patentes dos Estados Unidos 35 USC 132 ou outras tais leis-para permitir a adição de qualquer uma das várias dependências ou outros elementos apresentados sob uma reivindicação independente ou conceito como dependências ou elementos sob qualquer outra reivindicação ou conceito independente. Na estiragem de quaisquer reivindicações em qualquer momento, seja neste pedido ou em qualquer aplicação subsequente, deve-se entender também que
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57/58 o requerente destina a capturar tão pleno e amplo escopo de cobertura como legalmente disponível. Até o ponto em que são feitos substitutos insubstanciais, até o ponto em que o requerente não tenha, de fato, qualquer reivindicação de modo a abranger literalmente qualquer modalidade particular, e até o ponto de outra forma aplicável, a requerente não deve ser entendida como tendo em qualquer forma pretendida ou realmente abandonando tal cobertura como a requerente simplesmente pode não ter sido capaz de antecipar todas as eventualidades; alguém versado na técnica, não deve ser razoavelmente esperado ter-se de acordo com uma reivindicação que venha a compreender, literalmente, tais modalidades alternativas.
[0153] Além disso, se ou quando usado, o uso da frase transicional compreendendo é usado para manter as reivindicações de extremidade aberta aqui, de acordo com a interpretação tradicional de reivindicação. Assim, a menos que o contexto exija de outra forma, deve-se entender que o termo compreende ou variações tais como compreendido ou compreendendo , destinam-se a implicar a inclusão de um elemento ou etapa ou grupo de elementos ou etapas declarados, mas não a exclusão de qualquer outro elemento ou etapa ou grupo de elementos ou etapas. Tais termos devem ser interpretados em sua forma mais expansiva de modo a fornecer ao requerente a cobertura mais ampla legalmente permissível. O uso da frase ou qualquer outra reivindicação é usado como suporte para qualquer reivindicação a ser dependente de qualquer outra reivindicação, tal como uma outra reivindicação dependente, uma outra reivindicação independente, uma reivindicação previamente listada, uma reivindicação apresentada a seguir, e semelhantes. Como um exemplo de clarificação, se uma reivindicação foi dependente de acordo com a reivindicação 20 ou qualquer outra reivindicação ou similar, pode ser reutilizável de acordo com a reivindicação 1, reivindicação 15, ou mesmo reivindicação 25 (se for
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58/58 existir) se desejado e ainda cair com a descrição. Deve-se entender que esta frase também proporciona suporte para qualquer combinação de elementos nas reivindicações e mesmo incorpora qualquer base sensorial apropriada para certas combinações de reivindicação, tal como com combinações de método, aparelho, processo, e as reivindicações semelhantes.
[0154] Finalmente, quaisquer reivindicações apresentadas a qualquer momento são aqui incorporadas por referência como parte desta descrição da invenção, e o requerente reivindica expressamente a direita para usar toda ou uma parte desse conteúdo incorporado de tais reivindicações como descrição adicional para suportar qualquer uma ou todas as reivindicações ou qualquer elemento ou componente do mesmo, e o requerente ainda expressamente reserva a direita para mover qualquer porção ou todo o conteúdo incorporado de tais reivindicações ou qualquer elemento ou componente da descrição nas reivindicações ou vice-versa conforme necessário para definir a matéria para a qual a proteção é buscada por este pedido ou por qualquer continuação subsequente, divisão, ou aplicação de continuação-em-parte, ou para a obtenção de qualquer benefício de, redução em taxas de acordo com, ou de acordo com as leis de patente, regras, ou regulamentos de qualquer país ou tratado, e tal conteúdo incorporado por referência deve sobreviver durante toda a pendência deste pedido, incluindo qualquer continuação subsequente, divisão, ou aplicação de continuação-emparte, ou qualquer regeração ou extensão sobre a mesma.

Claims (48)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Crioprotetor derivado de planta para congelar células e tecidos caracterizado por compreender:
    - um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos; e
    - um agente osmótico adicional.
  2. 2. Crioprotetor derivado de planta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda uma razão percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito crioprotetor derivado de planta selecionado a partir de um grupo consistindo em:
    - cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
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    - cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
    - cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
  3. 3. Crioprotetor derivado de planta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito agente osmótico adicional compreender menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão de criopreservação da célula.
  4. 4. Crioprotetor derivado de planta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito agente osmótico adicional compreender glicerol.
  5. 5. Crioprotetor derivado de planta, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito agente osmótico adicional ser selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, sorbitol, ciclo-hexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritrotol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, monoacetato de glicerila, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno glicol, N-óxido de
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    3/14 piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
  6. 6. Crioprotetor derivado de planta, de acordo com A reivindicação 1, caracterizado por o dito extrato de planta compreender:
    - pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalentepor grama de dito extrato; e
    - pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 porcento em volume do dito extrato.
  7. 7. Crioprotetor derivado de planta, de acordo com A reivindicação 6, caracterizado por o dito extrato de planta compreender pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato.
  8. 8. Crioprotetor derivado de planta, de acordo com A reivindicação 1, caracterizado por o agente crioprotetor derivado de planta ser capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou ditas células entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol).
  9. 9. Método para congelar células e tecidos melhorado caracterizado por compreender as etapas de:
    - fornecer tecidos ou células;
    - criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
    - adicionar um crioprotetor derivado de planta aos ditos tecidos ou células; e
    - congelar os ditos tecidos ou células;
    em que o dito crioprotetor derivado de planta compreende:
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    - um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos; e um agente osmótico adicional.
  10. 10. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender ainda uma etapa de diluição da dita suspensão dos ditos tecidos ou das ditas células.
  11. 11. Método para congelar células e tecidos melhorado de acordo com a reivindicação 9 e caracterizado por compreender ainda uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito agente crioprotetor derivado de planta selecionado a partir de um grupo consistindo em:
    - cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
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    - cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
    - cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional
  12. 12. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o dito agente osmótico adicional compreender menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula.
  13. 13. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o dito agente osmótico adicional compreender glicerol.
  14. 14. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o dito agente osmótico adicional ser selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclo-hexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno glicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito
    Petição 870190032062, de 03/04/2019, pág. 147/305
    6/14 de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
  15. 15. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o dito extrato de planta compreender:
    - pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalentepor grama de dito extrato; e
    - pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato.
  16. 16. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por o dito extrato de planta compreender pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato.
  17. 17. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a dita etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células compreender uma etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células a menos de -4 graus Celsius.
  18. 18. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a dita etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células ser selecionada a partir de um grupo que consiste em congelamento de taxa controlada, vitrificação, congelamento ultra-rápido, congelamento ultra-rápido utilizando um sistema micro-capilar, vitrificação ultra-rápida, rastreamento de líquido, congeladores programáveis lentos e reprofusão, duas etapas.
  19. 19. Método para congelar células e tecidos melhorado de acordo com a reivindicação 9 e caracterizado por compreender ainda uma etapa de:
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    7/14 descongelar ditos tecidos ou células congeladas; e utilizar o dito tecido congelado ou das células sem a lavagem do dito crioprotetor dos ditos tecidos e células.
  20. 20. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por os ditos tecidos ou células serem selecionados a partir de um grupo consistindo em células reprodutivas, células de esperma, oócitos, embriões e células tronco embrionárias.
  21. 21. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por compreender ainda uma etapa de criar uma pressão osmótica da dita suspensão para entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol) antes da etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células.
  22. 22. Sistema para congelar de tecidos ou células compreendendo um crioprotetor para congelamento de tecidos ou células, caracterizado por o dito crioprotetor ser capaz de criar uma pressão osmótica de um ambiente que circunda os ditos tecidos ou células t as ditas células entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmol).
  23. 23. Sistema para congelar de tecidos e células, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o dito crioprotetor compreender um meio quimicamente definido.
  24. 24. Sistema para congelar de tecidos e células, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o dito crioprotetor compreender um extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado a partir de um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos
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  25. 25. Sistema para congelar de tecidos e células de acordo com A reivindicação 22, caracterizado por a dita composição criogênica compreender ainda um agente osmótico adicional.
  26. 26. Sistema para congelar de tecidos e células, de acordo com a reivindicação 25 e caracterizado por compreender ainda uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito crioprotetor selecionado a partir de um grupo consistindo em:
    - cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional; e
    - cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
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  27. 27. Sistema para congelar de tecidos e células de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o dito agente osmótico adicional compreender menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula.
  28. 28. Sistema para congelar de tecidos e células de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o dito agente osmótico adicional compreender glicerol.
  29. 29. Sistema para congelar de tecidos e células de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o dito agente osmótico adicional ser selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, albumina de alanina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, sorbitol, ciclo-hexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno glicol, N-óxido de piridina, farinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, trietileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
  30. 30. Sistema para congelar de tecidos e células de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por o dito extrato de planta compreender:
    - pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalentepor grama de dito extrato; e
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    - pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato.
  31. 31. Sistema para congelar de tecidos e células, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por o dito extrato de planta compreender pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato.
  32. 32. Método para congelar células e tecidos melhorado caracterizado por compreender as etapas de:
    - fornecer tecidos ou células;
    - criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
    - criar uma pressão osmótica da dita suspensão para entre cerca de 550 e 900 mOsm (miliosmoles) com um crioprotetor; e
    - congelar as ditas células.
  33. 33. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o dito crioprotetor compreender um meio quimicamente definido.
  34. 34. Método para congelar células e tecidos melhorado de acordo com a reivindicação 32 e caracterizado por compreender ainda uma etapa de diluir a dita suspensão dos ditos tecidos ou das ditas células.
  35. 35. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o dito crioprotetor compreender extrato de planta produzido a partir de uma planta compreendendo um gênero selecionado dentre um grupo consistindo em: Hippophae, Vitis, Prunus, Punica, Vaccinium, Prunus, Prunus, Rubus, Euterpe, Glycine, Lycium, Carya, Rosacea, Litchi, Amelanchier, Olea, e qualquer combinação dos mesmos.
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  36. 36. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a dita composição criogênica compreender ainda um agente osmótico adicional.
  37. 37. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por compreender ainda uma proporção percentual do dito extrato de planta para o dito agente osmótico adicional no dito crioprotetor selecionado a partir de um grupo consistindo em:
    - cerca de 50% de extrato de planta a cerca de 50% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 55% de extrato de planta a cerca de 45% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 60% de extrato de planta a cerca de 40% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 65% de extrato de planta a cerca de 35% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 70% de extrato de planta a cerca de 30% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 75% de extrato de planta a cerca de 25% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 80% de extrato de planta a cerca de 20% de agente osmótico adicional;
    -cerca de 85% de extrato de planta a cerca de 15% de agente osmótico adicional;
    - cerca de 90% de extrato de planta a cerca de 10% de agente osmótico adicional;
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    - cerca de 95% de extrato de planta a cerca de 5% de agente osmótico adicional.
  38. 38. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o dito agente osmótico adicional compreender menos do que cerca de 7% v/v em um tecido de concentração final ou suspensão criopreservação da célula.
  39. 39. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o dito agente osmótico adicional compreender glicerol.
  40. 40. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o dito agente osmótico adicional ser selecionado a partir de um grupo consistindo em acetamida, agaroses, alginatos, alanina albumina, acetato de amônio, betaína, butanodiol, sulfato de condroitina, clorofórmio, colina, ciclo-hexanodiol, dextrano, dietileno glicol, dimetil acetamida, dimetil formamida, sulfóxido de dimetila, eritol, etanol, etileno glicol, éter monometílico, ficoll, formamida, galactose, glicose, glutamina, glicerol, glicerofosfato, glicerilmonoacetato, glicina, amido de hidroxietila, inositol, lactose, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio, maltose, manitol, manose, metanol, metoxipropanodiol, metil acetamida, metil formamida, metil ureia, metil glicose, metil glicerol, proteínas do leite, peptonas, fenol, pluronicpolios, polietileno glicol, polivinilpirrolidona, prolina, propanodiol, propileno glicol, N-óxido de piridina, fafinose, ribose, serina, proteínas de soro, brometo de sódio, cloreto de sódio, iodeto de sódio, nitrato de sódio, nitrito de sódio, sulfato de sódio, sorbitol, sacarose, trealose, Metileno glicol, acetato de trimetilamina, ureia, valina e xilose.
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  41. 41. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o dito extrato de planta compreender:
    - pelo menos um antioxidante que proporciona pelo menos 90 pmol de Trolox equivalentepor grama de dito extrato; e
    - pelo menos um ácido graxo de pelo menos 3 por cento em volume do dito extrato.
  42. 42. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por o dito extrato de planta compreender pelo menos um composto polifenólico que fornece pelo menos 210 mg de equivalentes de ácido gálico por 100 gramas de dito extrato.
  43. 43. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por a dita etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células compreender uma etapa de congelamento dos ditos tecidos ou células a menos de -4 graus Celsius.
  44. 44. Método para congelar células e tecidos melhorado, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por os ditos tecidos ou células serem selecionados a partir de um grupo consistindo em células reprodutivas, células de esperma, oócitos, embriões e células tronco embrionárias.
  45. 45. Método para congelar células melhorado de acordo com a reivindicação 9 ou 32 e caracterizado por compreender ainda uma etapa de encapsular o dito crioprotetor em pelo menos um tipo de lipossoma.
  46. 46. Método para congelar células e tecidos melhorado caracterizado por compreender as etapas de:
    - fornecer tecidos ou células;
    - criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
    Petição 870190032062, de 03/04/2019, pág. 155/305
    14/14
    - criar uma pressão osmótica da dita suspensão a menos do que cerca de 5000 mOsm (miliosmoles) com um crioprotetor; e
    - congelar as ditas células.
  47. 47. Método para congelar células e tecidos melhorado caracterizado por compreender as etapas de:
    - fornecer tecidos ou células;
    - criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
    - fornecer um desequilíbrio de pressão osmótica da dita suspensão entre cerca de 3 a cerca de 7 vezes a pressão osmótica dos ditos tecidos ou células com um crioprotetor; e
    - congelar os ditos tecidos ou células.
  48. 48. Método para congelar células e tecidos melhorado caracterizado por compreender as etapas de:
    - fornecer tecidos ou células;
    - criar uma suspensão de ditos tecidos ou células;
    - fornecer um desequilíbrio de pressão osmótica da dita suspensão entre menos do que cerca de 4 a menos do que cerca de 8 vezes a pressão osmótica dos ditos tecidos ou células com um crioprotetor; e
    - congelar os ditos tecidos ou células.
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