RU2683682C1 - Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб - Google Patents
Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб Download PDFInfo
- Publication number
- RU2683682C1 RU2683682C1 RU2018126466A RU2018126466A RU2683682C1 RU 2683682 C1 RU2683682 C1 RU 2683682C1 RU 2018126466 A RU2018126466 A RU 2018126466A RU 2018126466 A RU2018126466 A RU 2018126466A RU 2683682 C1 RU2683682 C1 RU 2683682C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sturgeon
- sperm
- cryopreservation
- protective
- methanol
- Prior art date
Links
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 title claims abstract description 45
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 title claims abstract description 25
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 55
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 40
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims abstract description 20
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims abstract description 19
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims abstract description 19
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims description 11
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 abstract description 17
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 10
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 abstract description 9
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 abstract description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 238000009372 pisciculture Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 23
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 16
- 241001125075 Acipenser baerii Species 0.000 description 9
- 241000252355 Acipenser ruthenus Species 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 241000883303 Acipenser sinensis Species 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 241000883306 Huso huso Species 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000252344 Acipenser gueldenstaedtii Species 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 4
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 4
- 108010059642 isinglass Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000883347 Acipenser persicus Species 0.000 description 3
- 241000556204 Huso dauricus Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 3
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 241000252341 Acipenser stellatus Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- UGRNIAXMXRJYJE-UHFFFAOYSA-N formamide methanol propane-1,2,3-triol Chemical compound CO.C(=O)N.OCC(O)CO UGRNIAXMXRJYJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- -1 glycerol formamide acetamide Chemical compound 0.000 description 2
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000037023 motor activity Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000876433 Acipenser dabryanus Species 0.000 description 1
- 239000004606 Fillers/Extenders Substances 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000252143 Polyodon spathula Species 0.000 description 1
- 241001489542 Scaphirhynchus albus Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 239000003855 balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000000819 hypertonic solution Substances 0.000 description 1
- 229940021223 hypertonic solution Drugs 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- MFPODHWDVFPSKC-BTVCFUMJSA-N methanol;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O MFPODHWDVFPSKC-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 231100000521 sperm damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Farming Of Fish And Shellfish (AREA)
Abstract
Изобретение относится к рыбной промышленности и может использоваться при искусственном воспроизводстве осетровых рыб, а также для создания низкотемпературных генетических банков с целью сохранения биоразнообразия рыб. Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб содержит сахарозу, хлорид калия и криопротекторы метанол и формамид. Компоненты защитной среды берут в следующем соотношении, мас.%: сахароза 0,1; хлорид калия 0,08; метанол 8; формамид 0,5-1; дистиллированная вода - остальное. Изобретение позволяет повысить сохранность оплодотворяющей способности спермы при криоконсервации за счет более эффективного синергетического состава защитной среды. 3 табл.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к рыбной промышленности, а именно, к области биотехнологии аквакультуры, и может использоваться при искусственном воспроизводстве осетровых рыб, а также для создания низкотемпературных генетических банков с целью сохранения биоразнообразия рыб.
Уровень техники
Известно множество способов криоконсервации спермы осетровых рыб, в любом из которых определяющее значение для достижения успешного результата имеет используемая для разбавления спермы защитная среда. Среди исследованных защитных сред наиболее эффективными, т.е. позволяющими сохранить высокую оплодотворяющую способность криоконсервированной спермы осетровых рыб, были следующие среды: 1) водный раствор, содержащий 0,1% сахарозы, 0,08% хлорида калия и 8% метанола, который обеспечивал оплодотворение икры размороженной спермой на уровне 52-81% для сибирского осетра, 62-78% для русского осетра, 49-67% для белуги, 40-62% для стерляди, 73-83% для севрюги (Цветкова Л.И., Докина О.Б., Пронина Н.Д., Миленко В.А., Тансыкбаев А.Н. Криоконсервация спермы осетровых рыб - объектов аквакультуры // Мат-лы III Межд. научно-практ. конф. "Аквакультура осетровых рыб: достижения и перспективы", 22-25 марта 2004, Астрахань, Россия. - Астрахань, 2004. - С. 213-214; Цветкова Л.И., Докина О.Б., Пронина Н.Д., Миленко В.А. Роль низкотемпературных генных банков для развития аквакультуры. // Мат-лы докл. перв. науч.-практ. конф. «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов», Москва, ВВЦ, 1-2 ноября 2006 - М.: изд-во ВНИРО, 2006 - с.130-131); 2) водный раствор, содержащий 8,85 г/л хлорида натрия, 0,2 г/л хлорида калия, 0,4 г/л гидрокарбоната натрия и 12% диметилсульфоксида (ДМСО), обеспечил оплодотворение 84% икры размороженной спермой китайского осетра (A. Sinensis) (Liu L., Wei Q., Guo F., Zhang J., Zhang T. Cryopreservation of Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) sperm // J. Appl. Ichthyol. - 2006. - V.22. - P. 384-388; 3) защитный раствор для криоконсервации спермы китайского осетра, содержащий 20-30 ммоль/л трис-НСl, рН 8-8,5, 30-60 ммоль/л сахарозы, 2-10 ммоль/л хлорида калия и метанол (Liu L., Wei Q., Guo F., Zhu Y. Патент на изобретение CN 101084927 Technique and process for frozen-preserving Chinese sturgeon semen under super-low temperature, дата приоритета 15.02.2007); 4) модифицированный сбалансированный солевой раствор Хэнкса, дополняемый 5 или 10% метанола, обеспечил оплодотворение 91-92% икры размороженной спермой белого лопатоноса (Wayman W.R., Looney G.L., Holm R.J., Tiersch T.R. Cryopreservation of sperm from endangered pallid sturgeon // North American Journal of Fisheries Management. - 2008. - V. 28. - P. 740-744); 5) защитный раствор для криоконсервации спермы корейского осетра Acipenser dabryanus, содержащий 30-90 ммоль сахарозы, 15-45 ммоль трегалозы (микозы), 20-40 ммоль тригидроксиаминометана (триса), 0,5-2 ммоль хлорида калия, 3,2-9,8 ммоль восстановленного глутатиона и 0,08-0,2 л карбинола (метанола), остальная часть - деионизированная вода (Li Ping, Wei Qiwei, Xi Mengdan, Liu Ling, Guo Wei, Qiao Xinmei, патент № CN104054697, дата приоритета 07.07.2014 г.), обеспечила оплодотворение 45% икры; 6) водный раствор, содержащий 0,2 моль/л глюкозы и 10% метанола, обеспечивал оплодотворение 65-68% икры размороженной спермой белуги (Aramli M.S., Golshahi K., Nazari R.M., Aramli S., Banan A. Effectiveness of glucose - methanol extender for cryopreservation of Huso huso spermatozoa // Animal Reproduction Sciense. - 2015. - V. 162. - P. 37-42); 7) буферный раствор трис-HCl, рН 8, содержащий 23,4 ммоль/л сахарозы, 0,25 ммоль/л хлорида калия, 10 ммоль/л метанола и 10 ммоль/л глутамина, обеспечивал оплодотворение 90 ± 3,2% икры персидского осетра (Aramli M.S., Golshahi K., Nazari R.M., Golpour A., Aramli S. Influence of glutamine supplementation on motility and fertilization success of frozen-thawed Persian sturgeon (Acipenser persicus) sperm // Reprod. Dom. Anim. - 2016. - Doi: 10, 1111/rda.12704).
Однако применение ДМСО в качестве криопротектора и гипертоничных защитных сред на основе трис-HCl буфера признается нецелесообразным при криоконсервации спермы осетровых рыб (Mims S.D., Tsvetkova L.I., Wayman W.R., Horvath A., Urbanyi B., Gomelsky B. Cryopreservation of Sturgeon and Paddlefish Sperm. In: Cryopreservation in Aquatic Species, 2nd Edition. World Aquaculture Society, Baton Rouge, Louisiana. - 2011. P. 366-380). Избыточное содержание сахарозы в защитных растворах снижает их протективное действие, а недостаток хлорида калия не обеспечивает необходимого снижения двигательной активности клеток перед замораживанием. Кроме того, поскольку успех криоконсервации — уровень оплодотворения икры размороженной спермой - в значительной степени зависит от качества икры и нативной спермы, то формальное сравнение достигнутых процентов оплодотворения, приведенных в разных работах, является неправомерным. Имеет смысл лишь сравнение результатов криоконсервации в различных защитных средах, проведенной на одной сперме.
Наиболее близкой защитной средой того же назначения к заявляемому изобретению является водный раствор, содержащий 0,05-0,5% сахарозы, 0,01-0,15% хлорида калия, 6-12% метанола и 0,05-0,5% глицерина, применяемый в способе криоконсервации спермы осетровых рыб (патент на изобретение RU 2317703), использование которого позволяет получить оплодотворение икры криоконсервированной спермой до 92,3% для сибирского осетра, до 62,7% для русского осетра, до 82,9% для стерляди, до 60,8% для белуги, до 75% для севрюги.
Данная среда не позволяла сохранить более высокую оплодотворяющую способность криоконсервированной спермы для таких видов осетровых рыб, как русский осетр, белуга, севрюга, что требует уточнения содержания основных компонентов в защитной среде: сахарозы, хлорида калия и метанола. Использование в ней глицерина в качестве дополнительного криопротектора не оказывало значительного положительного влияния на сохранность и оплодотворяющую способность размороженной спермы.
Раскрытие сущности изобретения
Настоящее изобретение направлено на повышение сохранности оплодотворяющей способности спермы осетровых рыб при криоконсервации за счет более эффективного состава защитной среды. Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе криоконсервации спермы осетровых рыб, предусматривающем разбавление спермы перед замораживанием защитной средой, представляющей собой водный раствор сахарозы, хлорида калия и метанола, особенность заключается в том, что в защитную среду в качестве дополнительного криопротектора вводят формамид, при этом компоненты защитной среды берут в следующем соотношении, масс. %: сахароза 0,1; хлорид калия 0,08; метанол 8; формамид 0,5-1; дистиллированная вода - остальное.
Введение в защитную среду дополнительного криопротектора формамида, имеющего очень маленький размер молекул и очень высокую диэлектрическую проницаемость, способного за счет этого легко проникать через мембрану внутрь клетки и обладающего выраженными антифризными свойствами, снижает вероятность повреждения клеток из-за образования внутри их кристаллов льда, тем самым повышает протекторное действие среды.
Использование в защитной среде двух криопротекторов сходного действия (проникающих в клетку через мембрану) - метанола и формамида - позволяет уменьшить риск повреждения сперматозоидов от температурного шока благодаря синергетическому эффекту снижения температуры кристаллизации внутриклеточной жидкости. Совместное воздействие используемых криопротекторов способствует также продлению защитного действия среды за счет их разной скорости диффузии через мембрану и взаимодействию с разными структурами клетки.
Использование в защитной среде сахарозы и хлорида калия в уточненных концентрациях позволяет получить умеренно гипертонический раствор, обеспечивающий небольшое обезвоживание клеток, исключающее вероятность осмотического шока и снижающее риск внутриклеточной кристаллизации. Кроме того, указанный раствор обеспечивает снижение двигательной активности клеток перед замораживанием, что также уменьшает вероятность их повреждения.
Предлагаемый состав защитной среды предотвращает повреждение клеточных структур из-за внутриклеточной кристаллизации, что в совокупном воздействии с тем же режимом замораживания обеспечивает сохранение до 93,4% клеток (в зависимости от качества нативной спермы).
Рекомендуемое содержание компонентов защитной среды установлено в процессе многочисленных экспериментов.
Таким образом, совокупность отличительных признаков описываемой защитной среды обеспечивает достижение указанного технического результата.
Проведенный анализ уровня техники позволил установить, что не обнаружен источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения, следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию «новизна».
Дополнительный поиск известных решений показал, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку действие защитной среды указанного состава проявляет новые свойства с точки зрения воздействия на биологические объекты. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «изобретательский уровень».
Осуществление изобретения
Защитную среду для криоконсервации спермы осетровых рыб готовят непосредственно перед применением, растворяя в дистиллированной воде в соответствующих концентрациях, масс. %: сахарозу 0,1; хлорид калия 0,08; метанол 8; формамид 0,5 - 1; дистиллированная вода - остальное.
В остальном способ криоконсервации осуществляют как описано в патенте на изобретение RU 2 317 703.
Сущность изобретения иллюстрируется примерами:
Пример 1.
В лаборатории криобиологии ВНИИ пресноводного рыбного хозяйства проводились опыты по криоконсервации спермы сибирских осетров и стерляди разного качества, полученной на Конаковском заводе по осетроводству, с использованием различных составов защитных сред. Эффективность криоконсервации оценивали по оплодотворению икры размороженной спермой, проводимому в лабораторных условиях на чашках Петри. Зависимость результатов оплодотворения икры размороженной спермой от состава защитной среды представлена в табл. 1.
Таблица 1. Зависимость результатов оплодотворения икры осетровых рыб размороженной спермой от состава защитной среды
| № опыта | Вид рыбы | Содержание криопротекторов в основе защитной среды, % (Основа среды: водный раствор 0,1% сахарозы, 0,08% хлорида калия) |
Оплодотворение икры размороженной спермой | |||
| метанол | глицерин | формамид | средний % оплодотворения |
% от контроля | ||
| 1 | сибирский осетр | 8 | - | - | 16,6 | 18,2 |
| 8 | 0,7 | - | 77,6 | 85,3 | ||
| 8 | - | 0,7 | 91,4 | 100,4 | ||
| 2 | стерлядь | 8 | - | - | 22,7 | 31,3 |
| 8 | 0,7 | - | 14,3 | 19,7 | ||
| 8 | - | 0,7 | 54,7 | 75,4 | ||
| - | - | 8 | 0 | 0 | ||
| продолжение Таблицы 1 | ||||||
| № опыта | Вид рыбы | Содержание криопротекторов в основе защитной среды, % (Основа среды: водный раствор 0,1% сахарозы, 0,08% хлорида калия) |
Оплодотворение икры размороженной спермой | |||
| метанол | глицерин | формамид | средний % оплодотворения |
% от контроля | ||
| 3 | сибирский осетр | 8 | - | - | 29,2 | 70,4 |
| 8 | 0,7 | - | 26,4 | 63,6 | ||
| 8 | - | 0,7 | 38,7 | 93,3 | ||
| 4 | сибирский осетр | 8 | - | - | 69,3 | - |
| 8 | 0,7 | - | 70,8 | - | ||
| 8 | - | 0,7 | 83,4 | - | ||
| 8 | - | 1,5 | 75,0 | - | ||
| 5 | сибирский осетр | 8 | - | - | 83,1 | - |
| 8 | 0,7 | - | 85,4 | - | ||
| 8 | - | 0,7 | 90,1 | - | ||
| 8 | - | 0,5 | 93,4 | - | ||
| 8 | - | 1 | 92,4 | - | ||
| 8 | 0,7 | 0,7 | 84,9 | - | ||
| 6 | сибирский осетр | 8 | - | - | 25,2 | 73,0 |
| 8 | - | 0,5 | 38,8 | 112,5 | ||
| 8 | - | 0,7 | 40,8 | 118,3 | ||
| 8 | - | 1 | 38,6 | 111,9 | ||
| 8 | - | 2 | 32,6 | 94,5 | ||
| 6 | - | 2 | 9,5 | 27,5 | ||
| - | - | 15 | 0 | 0 | ||
| 7 | стерлядь | 8 | - | - | 31,2 | - |
| 8 | 0,7 | - | 21,2 | - | ||
| 8 | - | 0,7 | 47,4 | - | ||
Во всех опытах, где качественный и количественный состав защитной среды соответствовал рекомендуемому в заявляемом изобретении содержанию компонентов, уровень оплодотворения икры криоконсервированной спермой был высоким, иногда даже превышал уровень оплодотворения свежей спермой в контроле, что свидетельствует о высокой эффективности применяемой защитной среды, позволяющей сохранять жизнеспособность и высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов.
Опыты №№2, 3, 6, 7 показывают, что преимущество заявляемой среды проявлялось и при криоконсервации спермы невысокого качества.
Пример 2.
В лаборатории криобиологии ВНИИ пресноводного рыбного хозяйства с целью формирования коллекции криобанка проводилась криоконсервация спермы разных видов осетровых рыб, полученной на Конаковском заводе по осетроводству, с использованием различных составов защитных сред. Проверку оплодотворяющей способности образцов спермы проводили в лабораторных условиях на чашках Петри. Результаты проверки в зависимости от составов защитных сред представлены в табл. 2.
Таблица 2. Качество образцов криоконсервированной спермы осетровых рыб, заложенных на хранение в криобанк
| № самца | Вид рыбы | Содержание дополнительных криопротекторов в основе защитной среды, % (Основа среды: водный раствор 0,1% сахарозы, 0,08% хлорида калия, 8% метанола) |
Оплодотворение икры размороженной спермой | |||
| глицерин | формамид | ацетамид | средний % оплодотворения |
% от контроля | ||
| 1 | стерлядь | - | 0,7 | - | 60,9 | 88,0 |
| 2 | 0,7 | - | - | 28,6 | 32,7 | |
| 3 | - | 0,7 | - | 68,9 | 86,1 | |
| 4 | - | - | 0,7 | 37,2 | 47,3 | |
| 5 | 0,7 | - | - | 41,0 | 51,7 | |
| - | 0,7 | - | 60,0 | 75,7 | ||
| 6 | - | - | 0,7 | 45,0 | 57,0 | |
| 7 | 0,7 | - | - | 28,2 | 40,9 | |
| - | 0,7 | - | 40,0 | 58,0 | ||
| 8 | - | 0,7 | - | 62,2 | 88,1 | |
| 9 | - | 0,7 | - | 38,7 | - | |
| - | - | 0,7 | 25,5 | - | ||
| 0,7 | 0,7 | - | 29,4 | - | ||
| 10 | - | 0,7 | - | 32,6 | - | |
| продолжение Таблицы 2 | ||||||
| № самца | Вид рыбы | Содержание дополнительных криопротекторов в основе защитной среды, % (Основа среды: водный раствор 0,1% сахарозы, 0,08% хлорида калия, 8% метанола) |
Оплодотворение икры размороженной спермой | |||
| глицерин | формамид | ацетамид | средний % оплодотворения |
% от контроля | ||
| 10 | стерлядь | - | - | 0,7 | 29,8 | - |
| 0,7 | 0,7 | - | 27,1 | - | ||
| 11 | - | 0,7 | - | 34,1 | 78,4 | |
| - | - | 0,7 | 30,9 | 71,0 | ||
| 12 | - | 0,7 | - | 36,0 | 93,8 | |
| - | - | 0,7 | 31,9 | 83,1 | ||
| 13 | - | 0,7 | - | 90,5 | 99,9 | |
| 14 | - | 0,7 | - | 85,1 | 93,1 | |
| 1 | сибирский осетр | - | 0,7 | - | 81,0 | 99,8 |
| 2 | - | 0,7 | - | 75,0 | 83,6 | |
| - | - | 0,7 | 69,8 | 77,8 | ||
| 0,7 | 0,7 | - | 25,0 | 27,9 | ||
| 3 | - | - | - | 33,8 | 72,4 | |
| 0,7 | - | - | 37,4 | 80,1 | ||
| - | 0,7 | - | 48,3 | 103,4 | ||
| - | - | 0,7 | 46,7 | 100,0 | ||
| 4 | - | - | - | 36,2 | 83,6 | |
| - | 0,7 | - | 39,7 | 91,7 | ||
| - | - | 0,7 | 34,2 | 79,0 | ||
| 5 | - | - | - | 42,8 | 97,7 | |
| 0,7 | - | - | 39,9 | 91,1 | ||
| - | 0,7 | - | 51,0 | 116,4 | ||
| - | - | 0,7 | 41,1 | 93,8 | ||
| 1 | Русский осетр | - | 0,7 | - | 43,4 | 160,1 |
Приведенные данные свидетельствуют о том, что для каждого вида осетровых рыб замораживание спермы в заявляемой защитной среде обеспечивало сохранение ее оплодотворяющей способности на уровне нативной спермы в контроле и было в среднем на 20-50% выше по сравнению с другими использованными средами.
Пример 3.
На рыбозаводе «БиоАкустик» проводился опыт по промышленному получению гибрида стерлядь х калуга с использованием спермы калуги, криоконсервированной в заявляемой среде в лаборатории криобиологии ВНИИ пресноводного рыбного хозяйства. Результаты оплодотворения промышленных партий икры в зависимости от количества размороженной спермы представлены в табл. 3.
Таблица 3. Зависимость результатов оплодотворения икры стерляди от количества размороженной спермы калуги
| Вариант опыта | Количество икры, г | Количество спермы, мл | Количество активатора (воды), мл | Разбавление спермы активатором | Оплодотворение икры размороженной спермой, % |
| 1 | 300 | 9 | 600 | 1 : 70 | 74,7 |
| 2 | 300 | 12 | 600 | 1 : 50 | 83,4 |
| 3 | 300 | 15 | 600 | 1 : 40 | 87,0 |
Близкие значения процентов оплодотворения икры, полученные во всех вариантах опыта, указывают на высокое качество криоконсервированной спермы, обусловленное применением заявляемой среды.
Приведенные примеры иллюстрируют высокую эффективность криоконсервации спермы осетровых рыб в заявляемой защитной среде, обеспечивающей выживаемость и высокую оплодотворяющую способность сперматозоидов.
Таким образом, изложенные выше сведения свидетельствуют о выполнении при использовании заявленного изобретения следующей совокупности условий:
- защитная среда для криоконсервации спермы рыб по заявленному изобретению предназначена для использования в промышленности, в частности, для криоконсервации спермы осетровых рыб, компоненты которой, в указанных концентрациях, в совокупности с известным способом криоконсервации обеспечивают выживаемость и высокую оплодотворяющую способность размороженных сперматозоидов;
- для заявленной защитной среды в том виде, как она охарактеризована в независимом пункте изложенной формулы изобретения, подтверждена возможность ее применения с помощью описанных в заявке средств и методов.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию «промышленная применимость».
Claims (2)
- Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб, содержащая сахарозу, хлорид калия и метанол, отличающаяся тем, что в защитную среду вводят формамид в качестве дополнительного криопротектора, при этом исходные компоненты защитной среды берут в следующем соотношении, мас. %:
-
сахароза 0,1 хлорид калия 0,08 метанол 8 формамид 0,5-1 дистиллированная вода остальное
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018126466A RU2683682C1 (ru) | 2018-07-18 | 2018-07-18 | Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018126466A RU2683682C1 (ru) | 2018-07-18 | 2018-07-18 | Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2683682C1 true RU2683682C1 (ru) | 2019-04-01 |
Family
ID=66089634
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018126466A RU2683682C1 (ru) | 2018-07-18 | 2018-07-18 | Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2683682C1 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112655701A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-16 | 西南大学 | 一种施氏鲟精子冷冻保存液及保存方法 |
| CN112772630A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-11 | 西南大学 | 一种施氏鲟精子低温保存稀释液及其制备方法 |
| RU2811679C1 (ru) * | 2023-03-13 | 2024-01-15 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Волгоградский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВО Волгоградский ГАУ) | Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU591164A1 (ru) * | 1976-02-02 | 1978-02-05 | Институт Проблем Криобиологии И Криомедицины Ан Украинской Сср | Способ консервировани спермы рыб |
| US20060078872A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Atsushi Taguchi | Cell-preservation liquid |
| RU2317703C1 (ru) * | 2006-06-02 | 2008-02-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства" (ФГУП "ВНИИПРХ") | Способ криоконсервирования спермы осетровых рыб |
| WO2018067747A1 (en) * | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Smokey Tech, Llc | Systems and methods for natural cryoprotectants for preservation of cells |
-
2018
- 2018-07-18 RU RU2018126466A patent/RU2683682C1/ru active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU591164A1 (ru) * | 1976-02-02 | 1978-02-05 | Институт Проблем Криобиологии И Криомедицины Ан Украинской Сср | Способ консервировани спермы рыб |
| US20060078872A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Atsushi Taguchi | Cell-preservation liquid |
| RU2317703C1 (ru) * | 2006-06-02 | 2008-02-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Всероссийский научно-исследовательский институт пресноводного рыбного хозяйства" (ФГУП "ВНИИПРХ") | Способ криоконсервирования спермы осетровых рыб |
| WO2018067747A1 (en) * | 2016-10-04 | 2018-04-12 | Smokey Tech, Llc | Systems and methods for natural cryoprotectants for preservation of cells |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112655701A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-04-16 | 西南大学 | 一种施氏鲟精子冷冻保存液及保存方法 |
| CN112772630A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-05-11 | 西南大学 | 一种施氏鲟精子低温保存稀释液及其制备方法 |
| RU2811679C1 (ru) * | 2023-03-13 | 2024-01-15 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Волгоградский государственный аграрный университет" (ФГБОУ ВО Волгоградский ГАУ) | Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Blanco et al. | Comparative cryopreservation of avian spermatozoa: Effects of freezing and thawing rates on turkey and sandhill crane sperm cryosurvival | |
| Thananurak et al. | Sucrose increases the quality and fertilizing ability of cryopreserved chicken sperms in contrast to raffinose | |
| RU2317703C1 (ru) | Способ криоконсервирования спермы осетровых рыб | |
| Riesco et al. | Evaluation of zebrafish (Danio rerio) PGCs viability and DNA damage using different cryopreservation protocols | |
| Ohta et al. | Cryopreservation of the sperm of the Japanese bitterling | |
| RU2683682C1 (ru) | Защитная среда для криоконсервации спермы осетровых рыб | |
| Cuevas‐Uribe et al. | Vitrification of sperm from marine fish: effect on motility and membrane integrity | |
| Judycka et al. | The effect of supplementation of a trehalose-based extender with KCl on rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) sperm freezability and post-thaw motility | |
| Prien et al. | Cryoprotectants & cryopreservation of equine semen: A review of industry cryoprotectants and the effects of cryopreservation on equine semen membranes | |
| 郭金泉 et al. | Cryopreservation of spermatozoa from rainbow trout, common carp, and marine puffer. | |
| Stoss et al. | Studies on cryopreservation of eggs from rainbow trout (Salmo gairdneri) and coho salmon (Oncorhynchus kisutch) | |
| Ahmad et al. | Trehalose as a cryoprotective agent for the sperm cells: A Mini Review | |
| Tsai et al. | Sugars as supplemental cryoprotectants for marine organisms | |
| Golshahi et al. | Disaccharide supplementation of extenders is an effective means of improving the cryopreservation of semen in sturgeon | |
| Johnston et al. | Cryopreservation of saltwater crocodile (Crocodylus porosus) spermatozoa | |
| Kutluyer et al. | Cryopreservation of goldfish (Carassius auratus) spermatozoa: Effects of extender supplemented with taurine on sperm motility and DNA damage | |
| Tian et al. | Cryopreservation of spotted halibut (Verasper variegatus) sperm | |
| Hussain et al. | Quantification of damage at different stages of cryopreservation of endangered North American bison (Bison bison) semen and the effects of extender and freeze rate on post-thaw sperm quality | |
| Namula et al. | Effects of Tris (hydroxymethyl) aminomethane on the quality of frozen-thawed boar spermatozoa | |
| Kim et al. | Rapid freezing without cooling equilibration in canine sperm | |
| Nurman et al. | The effect of sucrose on sperm quality of Osphronemus goramy two days post-cryopreservation | |
| ES2788741T3 (es) | Uso de savia de árbol para conservar líneas celulares espermáticas | |
| CN112352777A (zh) | 一种精子冻存液及其在中华乌塘鳢精子冷冻保存中的应用 | |
| Li et al. | Cryopreservation of embryos of humpback grouper (Cromileptes altivelis) using combinations of non-permeating cryoprotectants | |
| Babiak et al. | Suitable methods for cryopreservation of semen from Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus L. |