KR102364057B1 - 커피부산물을 이용한 신규 미생물 동결 보호소재 활용 방법 - Google Patents

커피부산물을 이용한 신규 미생물 동결 보호소재 활용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 본 발명은 커피박(coffee residues) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제 및 이를 이용한 유산균 동결보호 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀(polyphenol)을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제 및 이를 이용한 유산균 동결보호 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 커피박 열수추출물 및 폴리페놀을 유산균의 동결보호제로 사용할 경우 경제적인 유산균 동결보호제를 공급할 수 있게 한다.

Description

커피부산물을 이용한 신규 미생물 동결 보호소재 활용 방법{METHOD FOR MICROORGANISM CRYOPROTECTANT USING COFFEE RESIDUE}
본 발명은 커피박(coffee residues) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제 및 이를 이용한 유산균 동결보호 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀(polyphenol)을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제 및 이를 이용한 유산균 동결보호 방법에 관한 것이다.
식품의 발효에는 여러가지 다양한 유산균들이 관여한다. 발효 식품의 제조시, 식품의 품질 균일화 및 품질 유지를 위해 우수한 유산균 균주를 분리 선발하여 식품 제조시 첨가할 수 있는 식품 발효용 미생물 첨가제에 대한 연구가 진행 중에 있다. 식품 발효용 미생물 첨가제를 보급하기 위해서는 미생물의 보존을 위한 제제화가 필요한데, 동결/동결건조는 대부분의 미생물을 효과적으로 장기 보존할 수 있는 방법이다. 오염방지, 저장, 수송, 경제성 등에서 동결/동결건조는 탁월한 장점을 찾을 수 있지만, 동결/동결건조 과정에서 균체의 활성과 생존율이 급격하게 감소하게 되므로 미생물 균체의 생존율을 극대화 할 수 있는 방법이 요구된다.
기존의 유산균 동결건조 분말의 제조공정은 수용성 배지 등을 사용하여 혐기적 발효장치 내에서 이루어지는 유산균 발효 생산, 원심분리 및 한외여과를 사용한 균체 회수, 그리고 급속동결 및 동결건조의 순서로 이어진다. 이러한 과정은 동결 시 얼음입자가 만들어지면서 세포의 막 구조를 손상시키고 유산균 분말이 공기, 수분, 온도조건에 민감하게 반응하기 때문에 저장 및 유통안정성과 가공안정성을 확보하기에 어려움이 있다. 이를 개선하기 위하여 유산균이 사멸하지 않고 유지될 수 있는 수단으로 당류 및 아미노산, 탈지유, 젤라틴, 구연산 등의 동결보호제를 단독 또는 조합하여 첨가한다. 동결보호제는 유산균 분말에 물리화학적 안정성을 부여함으로써 단순 동결건조된 유산균 분말에 비하여 높은 생존율을 나타낸다.
그러나, 일반적으로 사용되는 저분자 및 고분자 소재는 경제적인 부분에서 부담이 된다.
따라서, 기존 자원을 재활용하여 경제적인 유산균 동결보호 소재의 개발이 절실히 요구된다.
한국 공개특허 제10-2020-0001543호 한국 등록특허 제10-1866197호
본 발명의 목적은 커피박(coffee residues) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동결 형태의 유산균 제제 또는 동결건조 유산균 분말 제제의 제조에 있어서, 유산균 동결보호제로서 커피박(coffee residues) 열수추출물을 첨가하여 동결 또는 동결건조하는 것을 포함하는 유산균 동결보호 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀(polyphenol)을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 동결 형태의 유산균 제제 또는 동결건조 유산균 분말 제제의 제조에 있어서, 유산균 동결보호제로서 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀(polyphenol)을 첨가하여 동결 또는 동결건조하는 것을 포함하는 유산균 동결보호 방법을 제공하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 기존 자원을 재활용하여 경제적인 유산균 동결보호 소재를 찾고자 노력한 결과, 커피부산물로서 커피박 열수추출물 및 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀(polyphenol)을 유산균 동결보호제로 개발하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 커피박(coffee residues) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 커피박은 커피를 구입할 수 있는 곳에서 커피를 제조하고 남은 것을 이용하였으나, 입수 경로가 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 커피박(coffee residues)은 커피음료 추출 후 생산되는 부산물을 의미하고, 커피부산물과 혼용되어 사용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 커피박을 고압으로 열수추출한 커피박 열수추출물 내에 단당으로 갈락토오스, 만노오스 및 아라빈오스 등이 검출됨을 확인하였다.
한 구체예에서, 본 발명의 커피박 열수추출물이 유산균의 동결보호 소재로 사용될 수 있음을 확인하기 위하여 유산균에 커피박 열수추출물을 처리하여 가속실험을 진행한 결과 결과, 커피박 열수추출물을 처리하기 전보다 유산균의 생존율이 높게 유지되었다.
일 실시예에 있어서, 커피박을 열수하여 유산균의 동결보호제(cryoprotectant)로 사용될 수 있는 물질을 탐색한 결과, 커피박 열수추출물 내에 폴리페놀, 당류 및 미네랄이 검출되었다.
구체적으로 상기 폴리페놀(polyphenol)은 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 동결보호제로서 커피박 열수추출물 및 폴리페놀 외에도, 종래에 동결보호제로서 알려져 있던 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 유산균 동결보호제는 당류, 아미노산, 펩타이드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스 코르빈산, 효모 추출물, 탈지유, 트레할로스, 말토덱스트린, 콩가루 및 마늘 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 동결보호제를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 유산균 동결보호제를 적용할 수 있는 유산균의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 유산균은 김치 등의 식품으로부터 순수 분리하여 얻을 수 있으며, 이들은 유산균 배양에 적합한 시판용 배지 또는 식품 재료로부터 제조한 식물성 배지 등을 활용하여 배양할 수 있다. 본 발명에 있어서 유산균은 단독으로 또는 1종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 유산균은 Weissella 속, Lactobacillus 속, Streptococcus 속, Enterococcus 속, Bifidobacterium 속, Lactococcus 속 및 Pediococcus 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유산균일 수 있다.
상기 유산균의 농도는 제조하고자 하는 식품의 종류, 사용되는 유산균의 종류, 발효의 정도에 따라 적절히 조절될 수 있으며, 본 발명의 커피박 열수추출물 및/또는 폴리페놀의 농도는 함께 사용되는 추가의 동결보호제의 유무 등에 따라 조절될 수 있다.
본 발명은 또한 동결 형태의 유산균 제제 또는 동결건조 유산균 분말 제제의 제조에 있어서, 멸균수 내에 현탁된 유산균에 대해 동결보호제로서 커피박 열수추출물 및/또는 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀을 첨가하여 동결 또는 동결건조하는 것을 포함하는 유산균의 동결 보호 방법, 즉, 동결 형태의 유산균 제제 또는 동결건조 유산균 분말 제제의 제조에 있어서 유산균의 동결보호를 위한 커피박 열수추출물 및/또는 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀의 용도를 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 커피박 열수추출물은 멸균수에 1 x 109 내지 1 x 1011CFU/ml의 농도로 현탁되어 있는 유산균에 대해, 상기 현탁액의 부피를 기준으로 0.01 내지 10%(v/v), 또는 0.2 내지 6%(v/v)의 농도, 바람직하게는 0.5 내지 5%(v/v)로 첨가되는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 클로로겐산, 카페산 및 카페인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀은 각각 멸균수에 1 x 109 내지 1 x 1011CFU/ml의 농도로 현탁되어 있는 유산균에 대해, 상기 현탁액의 부피를 기준으로 0.01 내지 10%(v/v), 0.2 내지 6%(v/v)의 농도, 바람직하게는 0.25 내지 5%(v/v)로 첨가되는 것을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 유산균을 커피박 열수추출물 또는 말토덱스트린, 글리세롤, 트레할로오스 및 탈지유(skim milk)를 혼합하여 처리한 후 저장기간에 따른 유산균 생존율을 측정한 결과 본 발명의 커피박 열수추출물이 종래 상업적으로 이용되는 동결보호소재와 비교해서 동등한 효과와 경제적인 이점이 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 커피박 열수추출물 및 폴리페놀을 유산균의 동결보호제로 사용할 경우 경제적인 유산균 동결보호제를 공급할 수 있게 한다.
도 1은 HPLC 분석을 통한 커피박 열수추출물(CRE) 내의 주성분을 보여준다.
도 2는 커피박 열수추출물 내의 카페인, 카페산(CA) 및 클로로겐산(CGA)의 함량을 보여준다.
도 3은 본 발명의 커피박 열수추출물 처리 유무에 따른 유산균들의 가속실험 후 생존율 변화를 보여준다. A: 커피박 열수추출물 무처리, B: 커피박 열수추출물 처리.
도 4는 본 발명의 커피박 열수추출물 처리 농도에 따른 유산균의 생존율을 보여준다.
도 5는 본 발명의 폴리페놀 처리 유무에 따른 유산균 생존율을 보여준다. A: 폴리페놀 처리, B: 폴리페놀 무처리.
도 6은 본 발명의 커피박 열수추출물 처리 후 유산균의 저장기간에 따른 생존율을 보여준다. Con - 대조군(control); MD - 말토덱스트린(maltodextrin); Gly - 글리세롤(glycerol); Tre - 트레할로스(trehalose); SM - 탈지유(skim milk); CRE - 커피박 열수추출물.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 동결보호 소재 탐색
-시료: 커피박(coffee residue) - 스타벅스 부산물, 60℃에서 수분함량 5%까지 건조 후 -20℃ 보관하였다.
-시료 제조: 100g 건조 시료를 1 L 멸균수에 혼합한 후 121℃에서 15분 가압멸균하고, 4,000 rpm으로 10분간 원심분리 후 여과지(Whatman NO. 1)를 이용하여 불용물질 여과하였다. 이후 커피부산물 추출물을 동결건조 후 -20℃ 보관하였다.
1) 물질 분석
수용성 단당류 분석 (크로마토그래피 분석, REZEX RPM 컬럼) 및 불용성 단당류 분석 (가스크로마토그래피 분석, DB-225 capillary 컬럼)을 진행하였다.
페놀화합물 분석은 크로마토그래피 분석 (Shim-pack PREPODS 컬럼, SPD-M20A UV/Vis detector)으로 진행하였다.
미네랄 분석은 이온 크로마토그래피 (Capillary cation exchange 컬럼)로 분석하였다.
커피박을 열수 추출하여 유산균의 동결 보호소재(cryoprotectant)로 사용될 수 있는 물질을 탐색하였다.
그 결과, 폴리페놀(polyphenols), 당류(sugars) 및 미네랄 등이 검출되었고, 폴리페놀은 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 또는 카페인(Caffeine)이 주성분임을 확인하였다(도 1).
2) 커피부산물의 동결보호제 적용 가능성 확인
장기형 분말제제를 위한 신규 동결보호소재로서 커피부산물의 적용가능성을 탐색하였다. 커피부산물은 커피음료추출 후 생산되는 부산물로 주로 갈락토만난(galctomannan), 아라비노갈락탄(arabinogalactan), 글루코만난(glucomannan) 등의 다당류(polysaccharide)로 구성되어 있다고 알려져 있다(Choi 등, 2012).
본 발명에서도 커피부산물을 구성하는 단당 성분은 주로 만노오스(mannose; 24.8%), 갈락토오스(galactose; 12.2%) 및 글루코오스(glucose; 8.8%)로 확인되었다. 또한, 커피부산물을 고압으로 열수추출한 커피추출물의 주요 단당이 갈락토오스 (6.0%), 만노오스(5.6%) 및 아라비노스(arabinose; 2.4%) 등으로 분석되어 동결보호소재로의 개발 가능성 높다고 판단하였다(표 1).
Composition 커피박 (%) 커피박 추출물 (%)
아라비노스(Arabinose) 2.8±0.2 2.4±0.1
만노오스(Mannose) 24.8±1.1 5.6±0.3
갈락토오스(Galactose) 12.2±0.4 6.0±0.4
글루코오스(Glucose) 8.8±0.0 1.0±0.0
Total 48.6±1.6 15.0±0.8
또한, 커피박 고압열수추출물속에는 다량의 페놀화합물(총 페놀은 52.8 mg GAE/g)이 존재하였다. 폴리페놀은 동결건조과정 중 세포에 작용하는 산화스트레스를 감소시켜 미생물의 생존율을 증진시킨다고 보고된바 있다. 주요 폴리페놀로서 카페인(caffeine)이 27.3 mg/g, 클로로겐산(chlorogenic acid, CGA)이 10.2 mg/g 및 카페산(caffeic acid, CA)이 4.1 mg/g의 함량으로 구성됨을 확인하였다(도 2).
Pandey 등(2000)은 커피의 caffeine과 페놀 화합물은 냉수보다는 열수에서 고농도로 용출되는 것으로 보고하였고, 이는 고압열수추출법으로부터 높은 수준의 폴리페놀이 추출된 본 연구의 결과와 일치하였다.
실시예 2: 커피박 열수추출물의 동결보호 효과 검증 - 가속실험
커피박 열수추출물이 동결-해동 과정 동안 유산균 생존율에 미치는 영향에 대해 다른 동결보호제 비교 분석하였다.
류코노스톡 메센테로이데스 WiKim32, 락토바실러스 브레비스 YD-68 및 락토바실러스 커바투스 WiKim38 유산균을 MRS broth에 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 정치 배양하여 유산균의 농도가 109 내지 1011CFU/ml가 되도록 하였다. 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상기 유산균들을 회수한 후, 0.9% 생리식염수를 사용하여 3회 세척하였다.
이후 상기 유산균들의 농도를 각각 2 x 1010 CFU/mL로 고정하고, 상기 유산균 현탁액의 부피를 기준으로 1 mL의 유산균(2 x 1010 CFU/mL)과 5% 동결보호제와 혼합 처리하고, 처리구를 -70℃ 에서 2시간 동안 동결, 25℃에서 30분 동안 해동처리 (총 4회) 하였다.
해동된 처리구를 멸균 식염수에 희석하여 MRS agar plate 도말한 후 30℃에서 48시간 배양 후 생존율 검정하였다.
커피추출물의 보호효과를 빠르게 검정하기 위해서 유산균 3종에 대한 가속실험을 진행하였다(도 3).
무처리구의 경우 유산균의 종류과 상관없이 냉동과 해동을 반복할수록 생존율이 급격하게 감소하였다. 류코노스톡 메센테로이데스 (Leu. mesenteroides) WiKim32 균주에 커피박 열수추출물이 보호소재로 적용되었던 경우, 가속실험이 3회 진행되었음에도 불구하고 80% 이상의 생존율 나타냈으며 4회 반복에도 78.1% 수준의 높은 생존율을 유지하였다.
락토바실러스 브레비스(Lb. brevis) YD-68 균주의 경우 4회 냉해동을 반복한 후 68.5%의 생존율을 나타내었지만, 락토바실러스 커바투스(Lb. curvatus) WiKim38은 53.8% 수준의 상대적으로 낮은 생존율을 기록하였다(도 3A).
커피박 열수추출물을 처리한 경우, 냉동과 해동을 반복하여도 상기 유산균들의 생존율이 월등히 높게 유지됨을 확인하였다(도 3B).
실시예 3: 커피박 열수추출물의 농도에 따른 유산균 생존율 확인
앞서 살펴본 유산균 중에서 Leu. mesenteroides WiKim32을 이용하여 동결보호제로서 커피박 열수추출물의 농도에 따른 생존율을 확인하고자 하였다.
1 mL의 유산균(2 x 1010 CFU/mL)과 0 내지 20%(v/v) 커피박 열수추출물과 혼합 처리하고, 처리구를 -70℃ 에서 2시간 동안 동결 후 24시간 동안 동결건조하였다.
동결건조 된 처리구를 멸균 식염수에 현탁하여 MRS agar plate 도말한 후 30℃에서 48시간 배양 후 생존율 측정하였다.
동결건조 후 유산균 저장안정성 증진을 위한 커피추출물 보호소재의 최적 농도를 결정하였다. 유산균 대비 커피추출물 0.5 내지 20%(v/v)를 처리 후 Leu. mesenteroides WiKim32 균주의 생존율을 측정하였다.
동결보호소재가 적용되지 않은 무처리구는 12.2% 수준의 낮은 생존율을 나타낸 반면, 적용된 커피박 열수추출물의 농도가 높아짐에 따라 WiKim32의 생존율은 비례적으로 증가하였다. 커피박 열수추출물 0.5%(v/v)에서 48.8%의 생존율을 나타내었고 5%(v/v) 적용 시 61.2%까지 증가하였다. 그러나 커피추출물 농도가 10%(v/v) 이상으로 높아지는 경우 WiKim32의 생존율은 동결보호소재의 농도에 비례적으로 감소하였다(도 4).
실시예 4: 폴리페놀 농도에 따른 동결보호 효과 검증
유산균(Leu. mesenteroides WiKim32)을 MRS broth에 접종한 후 30℃에서 24시간 동안 정치 배양하여 유산균의 농도가 109 내지 1011CFU/ml가 되도록 하였다. 8,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상기 유산균을 회수한 후, 0.9% 생리식염수를 사용하여 3회 세척하였다.
이후 상기 유산균의 농도를 각각 2 x 1010 CFU/mL로 고정하고, 상기 유산균 현탁액의 부피를 기준으로 1 mL의 유산균(2 x 1010 CFU/mL)과 0 내지 10% 커피 열수추출물 주요성분과 혼합 처리하였다 (caffeine, chlorogenic acid, caffeic acid, arabinose, mannose, galactose).
처리구를 -70℃ 에서 2시간 동안 동결 후 24시간 동안 동결 건조하고, 동결건조 된 처리구를 멸균 식염수에 현탁하여 MRS agar plate 도말하였다. 이후 30℃에서 48시간 배양 후 생존율 측정하였다.
커피추출물의 주요성분의 농도를 0 내지 10%로 적용하여 유산균의 생존율을 측정하였다. 폴리페놀 10%(v/v) 적용구는 폴리페놀의 종류와 상관없이 유산균의 생존율이 감소하였다. 카페산 0.25%(v/v) 처리구에서 39.5%(v/v) 수준의 높은 생존율을 기록하였으며, 적용 농도가 높아질수록 생존율은 비례적으로 감소하였다(도 5A). 당류 중 만노오스의 보호효과가 아라비노스와 갈락토오스 보다 월등히 높은 수준이었고, 만노오스 5%(v/v) 처리구에서 48.5% 수준의 가장 높은 생존율을 나타내었다(도 5B).
실시예 5: 저장기간에 따른 유산균 생존율 검정
1 mL의 유산균(Leu. mesenteroides WiKim32)(2 x 1010 CFU/mL)을 5% 커피박 열수추출물 또는 5% 동결보호제와 혼합 처리하였다 (maltodextrin, glycerol, trehalose, skim milk, 커피추출물).
처리구를 -20℃ 에서 저장 (0, 28, 56일)하였다. 저장된 처리구를 멸균 식염수에 현탁 하여 MRS agar plate 도말하고, 30℃에서 48시간 배양 후 생존율 측정하였다.
커피박 열수추출물 5%(v/v)를 동결보호제로 적용한 후 저장기간에 따른 유산균의 저장안정성을 검정하였다(도 6). 동결건조 후 얻어진 유산균 분말을 -20℃에서 보관 후 기간에 따른 생존율을 측정하였다.
무처리구의 동결건조 직후 WiKim32의 생존율은 15.5%의 낮은 수준이었던 반면, 커피추출물이 적용된 실험구에서 동결건조 직후 생존율은 61.2%를 나타내었고 보관 28일 및 56일 후에도 각각 54%와 48.7%의 생존율을 유지하였다. 상업적으로 이용되는 동결보호소재와 비교해서 동등한 효과와 가격적인 장점이 예상되어 커피추출물을 활용한 동결보호소재개발이 가능할 것으로 판단되었다.

Claims (10)

  1. 커피박(coffee residues) 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제로,
    상기 유산균은 Weissella 속, Lactobacillus 속, Streptococcus 속, Enterococcus 속, Bifidobacterium 속, Lactococcus 속 및 Pediococcus 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 유산균 동결보호제.
  2. 제1항에 있어서,
    당류, 아미노산, 펩타이드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스 코르빈산, 효모 추출물, 탈지유, 트레할로스, 말토덱스트린, 콩가루 및 마늘 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 동결보호제를 추가로 포함하는 유산균 동결보호제.
  3. 삭제
  4. 동결 형태의 유산균 제제 또는 동결건조 유산균 분말 제제의 제조에 있어서, 유산균 동결보호제로서 커피박(coffee residues) 열수추출물을 첨가하여 동결 또는 동결건조하는 것을 포함하며,
    상기 유산균은 Weissella 속, Lactobacillus 속, Streptococcus 속, Enterococcus 속, Bifidobacterium 속, Lactococcus 속 및 Pediococcus 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 유산균 동결보호 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 커피박 열수추출물은 멸균수에 1 x 109 내지 1 x 1011CFU/ml의 농도로 현탁되어 있는 유산균에 대해, 상기 현탁액의 부피를 기준으로 0.01 내지 10%(v/v)로 첨가되는 것인 유산균 동결보호 방법.
  6. 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀(polyphenol)을 유효성분으로 포함하는 유산균 동결보호제로,
    상기 유산균은 Weissella 속, Lactobacillus 속, Streptococcus 속, Enterococcus 속, Bifidobacterium 속, Lactococcus 속 및 Pediococcus 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 유산균 동결보호제.
  7. 제6항에 있어서,
    당류, 아미노산, 펩타이드, 젤라틴, 글리세롤, 당알콜, 유청, 알긴산, 아스 코르빈산, 효모 추출물, 탈지유, 트레할로스, 말토덱스트린, 콩가루 및 마늘 파쇄물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 동결보호제를 추가로 포함하는 유산균 동결보호제.
  8. 삭제
  9. 동결 형태의 유산균 제제 또는 동결건조 유산균 분말 제제의 제조에 있어서, 유산균 동결보호제로서 클로로겐산(Chlorogenic acid), 카페산(Caffeic acid) 및 카페인(Caffeine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리페놀(polyphenol)을 첨가하여 동결 또는 동결건조하는 것을 포함하며,
    상기 유산균은 Weissella 속, Lactobacillus 속, Streptococcus 속, Enterococcus 속, Bifidobacterium 속, Lactococcus 속 및 Pediococcus 속으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 유산균 동결보호 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 클로로겐산, 카페산 및 카페인은 각각 멸균수에 1 x 109 내지 1 x 1011CFU/ml의 농도로 현탁되어 있는 유산균에 대해, 상기 현탁액의 부피를 기준으로 0.02 내지 6%(v/v)로 첨가되는 것인 유산균 동결보호 방법.

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