CN114208814A - 一种猪冷冻精液稀释剂及其制备、使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪冷冻精液稀释剂，包括第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液，其中第一稀释液包括乳糖、果糖、葡萄糖、烷基葡聚糖、柠檬酸、氯化钠、三羟基甲基氨基甲烷、聚乙烯吡咯烷酮、青霉素、鲜蛋黄；第二稀释液包括果糖、蔗糖、柠檬酸钠、甘油、二甲基亚砜、乙二醇、十二烷基苯磺酸钠、链霉素、鲜蛋黄；第三稀释液包括葡萄糖、氯化钾、半胱氨酸、碳酸氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、青霉素、链霉素。将各原料分别溶于100ml双蒸水，制成三种稀释液。将本发明的稀释剂用于猪冷冻精液的生产，解冻后精子活力达85％以上，顶体完整率达85％以上，质膜完整率80％以上，线粒体活性达80％以上，畸形率10％以下。
Description
技术领域
本发明属于畜牧人工授精技术领域，具体涉及一种猪冷冻精液稀释剂及其制备、使用方法。
背景技术
随着科技不断发展，人们的生活水平在不断提高，对肉类的需求量和品质要求也越来越高。猪肉是我国需求量最高的肉类，是人们生活的必需品，猪养殖在我国畜牧业养殖中扮演着不可或缺的角色。
猪的人工授精是猪规模化养殖的一项常规技术，能够提高优秀公猪的利用率，保证商品猪的高品质，增加养殖户的经济效益。从全国市场调查结果发现，现在猪繁殖普遍用鲜精进行配种，但是鲜精储存时间短，精液质量受环境影响非常严重，使用起来非常不方便。
随着人工授精技术的广泛应用，精液的保鲜技术也在不断发展。精液体外保鲜的关键点在于减缓精子的新陈代谢强度，从而达到延长精子在体外存活时间的目的。猪冷冻精液可以将精液置于－196℃液氮中永久保存，不受该公猪死亡、采精间隔、繁殖不育的限制；可以把优良种猪的基因利用率最大化，大量减少公畜的饲养数量，降低饲养成本，且可以实现跨时空、跨区域使用，为养猪业带来巨大的经济效益。由于冷冻精液永久保存的特性，可以有效地隔离非瘟和各种病毒，可以为母猪繁殖生产提供稳定的供应保障。
但是，现有的猪冷冻精液稀释剂都需要特定的鲜精稀释剂，需要先向猪场配送稀释剂才能稀释，非常不利于猪场的非洲猪瘟防控工作，而且解冻后活力参差不齐，配种结果不尽如人意。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷，本发明提供了一种猪冷冻精液稀释剂及其制备、使用方法，可以适用各种鲜精稀释剂，且解冻后精子活力达仍然85％以上。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供一种猪冷冻精液稀释剂，包括第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液；按照质量份计，上述稀释液各原料的质量配比如下：
第一稀释液：乳糖6～8g、果糖1.5～3g、葡萄糖1～2g、烷基葡聚糖0.02～0.04g、柠檬酸0.5～0.8g、氯化钠0.16～0.3g、三羟基甲基氨基甲烷0.2～0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.03～0.05g、青霉素40u～60u、鲜蛋黄18～22g，采用100ml双蒸水溶解制得；
第二稀释液：果糖6～10g、蔗糖0.5～0.8g、柠檬酸钠0.5～1g、甘油2.7～4.4g、二甲基亚砜0.4～0.7g、乙二醇0.1～0.3g、十二烷基苯磺酸钠0.05～0.08g、链霉素80u～100u、鲜蛋黄18～22g，采用100ml双蒸水溶解制得；
第三稀释液：葡萄糖2.5～3.8g、氯化钾0.03～0.06g、半胱氨酸0.025～0.05g、碳酸氢钠0.5～0.75g、柠檬酸0.2～0.5g、乙二胺四乙酸二钠0.035～0.055g、青霉素80u～100u、链霉素80u～100u，采用100ml双蒸水溶解制得。
作为本发明的进一步改进，所述鲜蛋黄为鸡蛋黄，且需经过55～60℃、30min的灭菌处理。
按照本发明的第二个方面，提供一种猪冷冻精液稀释剂的制备方法，按照如下步骤进行：
取乳糖6～8g、果糖1.5～3g、葡萄糖1～2g、烷基葡聚糖0.02～0.04g、柠檬酸0.5～0.8g、氯化钠0.16～0.3g、三羟基甲基氨基甲烷0.2～0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.03～0.05g、青霉素40u～60u以及鲜蛋黄18～22g，溶于100ml双蒸水中，制备得到第一稀释液，放置室温备用；
取果糖6～10g、蔗糖0.5～0.8g、柠檬酸钠0.5～1g、甘油2.7～4.4g、二甲基亚砜0.4～0.7g、乙二醇0.1～0.3g、12烷基苯磺酸钠0.05～0.08g、链霉素80u～100u以及鲜蛋黄18～22g，溶于100ml双蒸水中，制备得到第二稀释液，放置室温备用；
葡萄糖2.5～3.8g、氯化钾0.03～0.06g、半胱氨酸0.025～0.05g、碳酸氢钠0.5～0.75g、柠檬酸0.2～0.5g、乙二胺四乙酸二钠0.035～0.055g、青霉素80u～100u、链霉素80u～100u，溶于100ml双蒸水中，制备得到第三稀释液，放置室温备用。
作为本发明的进一步改进，所述第一稀释液、第二稀释液和第三稀释液均需调pH值稳定至6～7，并移至恒温箱备用。
作为本发明的进一步改进，所述双蒸水的温度为30～36℃；
作为本发明的进一步改进，所述鲜蛋黄为鸡蛋黄，且需经过55～60℃、30min的灭菌处理。
按照本发明的第三个方面，提供一种根据所述的猪冷冻精液稀释剂的使用方法，按照如下步骤进行：
S1：采用猪鲜精稀释剂将猪精液1:1等体积稀释，在第一温度恒温培养箱中平衡30～50分钟，移至第二温度恒温培养箱中，控制其温度在1.5～2h降温至第二温度；
S2：将步骤S1中得到的稀释精液离心，弃去上清液，加入第一稀释液，使得最终0.5ml精液中含精子为5亿，混匀后将精液降温至第三温度；
S3：将步骤S2中得到精液中加入第二稀释液，最终1ml精液中含精子为5亿；
S4：采用灌装机将步骤S3得到精液灌装到细管中，并放入冷冻仪中进行冷冻，控制温度在10分钟内降至第四温度以下，然后迅速投入液氮保存；
S5：将第三稀释液置于30℃～36℃恒温水浴锅，将保存在液氮里面的冻精细管进行解冻，解冻后将精液加入恒温好的所述第三稀释液中，精液根据最终配种所需浓度为40ml第三稀释液中含精子10亿进行添加。
作为本发明的进一步改进，所述第一温度为30℃～36℃，所述第二温度为16℃～18℃，所述第三温度为5℃～7℃，所述第四温度为－150℃。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明的猪冷冻精液稀释剂，糖类多样化，几种糖类配合使用能为精子提供充足的能量，相比其它猪冻精不用配备单独的鲜精稀释粉，可以适应各种类型的鲜精稀释粉。使用甘油、二甲基亚砜、己二醇、聚乙烯吡咯烷酮四种冷冻保护剂，可以充分保护精子的顶体、线粒体完整性，有效避免精子畸形，提高精子配种率，解冻后精液活力优于其它猪冻精。十二烷基苯磺酸钠起到与卵黄中油脂充分溶解的作用，利于精子运动。氯化钾调节细胞渗透压，柠檬酸调节溶液pH值，乙二胺四乙酸二钠避免了水分子与精子在冷冻过程中形成结晶，使精子不会被超低温破坏结构。将青霉素和链霉素联合使用，通过阻碍细菌细胞壁的合成，可以有效抑制微生物生长。
将本发明的稀释剂用于猪冷冻精液的生产，解冻后精子活力达85％以上，顶体完整率达85％以上，质膜完整率80以上，线粒体活性达80％以上，畸形率10％以下。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的猪冷冻精液稀释剂，包括第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液；按照质量份计，上述稀释液各原料的质量配比及制备方法如下：
第一稀释液：乳糖6～8g、果糖1.5～3g、葡萄糖1～2g、烷基葡聚糖0.02～0.04g、柠檬酸0.5～0.8g、氯化钠0.16～0.3g、三羟基甲基氨基甲烷0.2～0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.03～0.05g、青霉素40u～60u、鲜蛋黄18～22g，采用100ml双蒸水溶解制得，降至室温，调pH值稳定至6～7，移至恒温箱备用；
第二稀释液：果糖6～10g、蔗糖0.5～0.8g、柠檬酸钠0.5～1g、甘油2.7～4.4g、二甲基亚砜0.4～0.7g、乙二醇0.1～0.3g、十二烷基苯磺酸钠0.05～0.08g、链霉素80u～100u、鲜蛋黄18～22g，采用100ml双蒸水溶解制得，降至室温，调pH值稳定至6～7，移至恒温箱备用；
第三稀释液：葡萄糖2.5～3.8g、氯化钾0.03～0.06g、半胱氨酸0.025～0.05g、碳酸氢钠0.5～0.75g、柠檬酸0.2～0.5g、乙二胺四乙酸二钠0.035～0.055g、青霉素80u～100u、链霉素80u～100u，采用100ml双蒸水溶解制得，降至室温后调pH值稳定至6～7，移至恒温箱备用；
其中，鲜蛋黄为鸡蛋黄，且经过55～60℃、30min的灭菌处理。
上述配方中，糖类多样化，几种糖类配合使用能为精子提供充足的能量，相比其它猪冻精不用配备单独的鲜精稀释粉，可以适应各种类型的鲜精稀释粉。使用甘油、二甲基亚砜、己二醇、聚乙烯吡咯烷酮四种冷冻保护剂，可以充分保护精子的顶体、线粒体完整性，有效避免精子畸形，提高精子配种率，解冻后精液活力优于其它猪冻精。12烷基苯磺酸钠起到与卵黄中油脂充分溶解的作用，利于精子运动。氯化钾调节细胞渗透压，柠檬酸调节溶液pH值，乙二胺四乙酸二钠避免了水分子与精子在冷冻过程中形成结晶，使精子不会被超低温破坏结构。将青霉素和链霉素联合使用，通过阻碍细菌细胞壁的合成，可以有效抑制微生物生长。
进一步地，本发明的猪冷冻精液稀释剂的使用方法，包括如下步骤：
S1：采用猪鲜精稀释剂将猪精液1:1等体积稀释，在第一温度恒温培养箱中平衡30～50分钟，移至第二温度恒温培养箱中，控制其温度在1.5～2h降温至第二温度；
S2：将步骤S1中得到的稀释精液离心，弃去上清液，加入第一稀释液，使得最终0.5ml精液中含精子为5亿，混匀后将精液降温至第三温度；
S3：将步骤S2中得到精液中加入第二稀释液，最终1ml精液中含精子为5亿；
S4：将步骤S3得到精液灌装到细管中，并放入冷冻仪中进行冷冻，控制温度在10分钟内降至第四温度以下，然后迅速投入液氮保存；
S5：将第三稀释液置于30℃～36℃恒温水浴锅，将保存在液氮里面的冻精细管进行解冻，解冻后将精液加入到恒温好的所述第三稀释液中；精液根据最终配种所需浓度为40ml第三稀释液中含精子10亿进行添加。
其中，第一温度为30℃～36℃，第二温度为16℃～18℃，第三温度为5℃～7℃，第四温度为－150℃。
本发明猪冷冻精液稀释剂的使用方法中，通过阶段性的降温、供能，使猪精子安全过渡到冷冻休眠状态，解冻时稀释液再次提供能量，使精子顺利复苏。并且在第三稀释液中再次获能，使精子整体机能达到最强。
在第一温度(30℃～36℃)中恒温平衡30～50分钟，能够使经过稀释后的精子状态得到稳定；缓慢降温至第二温度(16℃～18℃)，使精子处于轻休眠状态，降低离心过程中受到的损伤；离心得到纯精子，弃去精清，净化精液中的病毒细菌；加入第一稀释剂，替代精清提供能量，并为下一步降温提供保护；再缓慢降温至第三温度(5℃～7℃)，使精子进入中度休眠状态；加入第二稀释液，为精子下一步强降温提供保护；继续降至第四温度(－150℃)，保存在液氮中，此时精子进入完全休眠状态，在此状态下可以永久保存；解冻时在16秒之内将精子提温至50℃，快速避过结冰温度，加入30℃～36℃的第三稀释液中，能够使精子再次得到能量并稳定状态。
以下为具体实施例：
实施例1
第一稀释液配制：
称取乳糖7g、果糖2g、葡萄糖1.4g、烷基葡聚糖0.035g、柠檬酸0.65g、氯化钠0.22g、三羟基甲基氨基甲烷0.35g、聚乙烯吡咯烷酮0.04g、青霉素50u、鲜蛋黄20.5g，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至6，移至恒温箱备用。
第二稀释液配制：
称取果糖7g、蔗糖0.6g、柠檬酸钠0.65g、甘油3.4g、二甲基亚砜0.55g、乙二醇0.18g、十二烷基苯磺酸钠0.06g、链霉素90u、鲜蛋黄20.5g，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至6，移至恒温箱备用。
第三稀释液配制：
称取葡萄糖3.1g、氯化钾0.04g、半胱氨酸0.03g、碳酸氢钠0.6g、柠檬酸0.35g、乙二胺四乙酸二钠0.045g、青霉素90u、链霉素90u，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至6，移至恒温箱备用。
猪冷冻精液稀释剂的使用方法如下：
(1)精液的前期处理
采集常规品质检测合格的精液，用猪鲜精稀释液1:1等体积稀释，在34℃恒温箱中平衡40min，移至17℃恒温箱中，控制其温度在1.5～2h降温至17℃；
(2)稀释液添加
将降至17℃的精液以960G的离心力离心20min，弃去上清液，根据最终所需精液浓度0.5ml精液中含精子为5亿，兑入第一稀释液，将兑好的精液降温至6℃，根据最终所需精液浓度1ml精液中含精子为5亿加入第二稀释液，用灌装机将精液灌装到细管。将精液细管放入冷冻仪中进行冷冻，控制其温度在10min内降至－150℃，然后将精液细管迅速投入液氮保存。准备好40ml的第三稀释液置于36℃恒温水浴锅，将保存在液氮里面的冻精细管投入到50℃的水中进行解冻，保持14～16秒，将精液细管取出后用干毛巾包裹并擦净，用剪刀将细管的封口端剪开，用杵子将精液从细管中顶出，使精液流进恒温好的第三稀释液中，精液根据最终配种所需浓度为40ml第三稀释液中含精子10亿进行添加。
解冻后精子活力达88％，顶体完整率达93％，质膜完整率87％，线粒体活性83％，畸形率8％。
实施例2
第一稀释液配制：
称取乳糖6g、果糖1.5g、葡萄糖1.2g、烷基葡聚糖0.02g、柠檬酸0.5g、氯化钠0.16g、三羟基甲基氨基甲烷0.2g、聚乙烯吡咯烷酮0.03g、青霉素40u、鲜蛋黄19g，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至7，移至恒温箱备用
第二稀释液配制：
称取果糖6g、蔗糖0.5g、柠檬酸钠0.5g、甘油2.9g、二甲基亚砜0.4g、乙二醇0.1g、十二烷基苯磺酸钠0.05g、链霉素80u、鲜蛋黄19g，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至7，移至恒温箱备用。
第三稀释液配制：
称取葡萄糖2.5g、氯化钾0.03g、半胱氨酸0.025g、碳酸氢钠0.5g、柠檬酸0.2g、乙二胺四乙酸二钠0.035g、青霉素80u、链霉素80u，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至7，移至恒温箱备用。
猪冷冻精液稀释剂的使用方法如下：
(1)精液的前期处理
采集常规品质检测合格的精液，用种猪鲜精稀释液1:1等体积稀释，在30℃恒温箱中平衡50min，移至16℃恒温箱中，控制其温度在1.5～2h降温至16℃；
(2)稀释液添加
将降至16℃的精液以960G的离心力离心20min，弃去上清液，根据最终所需精液浓度0.5ml精液中含精子为5亿，兑入第一稀释液，将兑好的精液降温至5℃，根据最终所需精液浓度1ml精液中含精子为5亿加入第二稀释液，用灌装机将精液灌装到细管。将精液细管放入冷冻仪中进行冷冻，控制其温度在10min降至－150℃，然后将精液细管迅速投入液氮保存。准备好40ml的第三稀释液置于30℃恒温水浴锅，将保存在液氮里面的冻精细管投入到50℃的水中进行解冻，保持14～16秒，将精液细管取出后用干毛巾包裹并擦净，用剪刀将细管的封口端剪开，用杵子将精液从细管中顶出，使精液流进恒温好的第三稀释液中，精液根据最终配种所需浓度为40ml第三稀释液中含精子10亿进行添加。
解冻后精子活力达91％，顶体完整率达90％，质膜完整率84％，线粒体活性81％，畸形率10％。
实施例3
第一稀释液配制：
称取乳糖8g、果糖2.5g、葡萄糖1.9g、烷基葡聚糖0.04g、柠檬酸0.75g、氯化钠0.28g、三羟基甲基氨基甲烷0.45g、聚乙烯吡咯烷酮0.05g、青霉素60u、鲜蛋黄21.5g，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至6，移至恒温箱备用。
第二稀释液配制：
称取果糖9g、蔗糖0.8g、柠檬酸钠0.85g、甘油4.2g、二甲基亚砜0.65g、乙二醇0.25g、十二烷基苯磺酸钠0.07g、链霉素100u、鲜蛋黄22g，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至6，移至恒温箱备用。
第三稀释液配制：
称取葡萄糖3.8g、氯化钾0.06g、半胱氨酸0.05g、碳酸氢钠0.7g、柠檬酸0.45g、乙二胺四乙酸二钠0.055g、青霉素100u、链霉素100u，将上述原料溶于100ml双蒸水中，降至室温，调pH值稳定至6，移至恒温箱备用。
猪冷冻精液稀释剂的使用方法如下：
(1)精液的前期处理
采集常规品质检测合格的精液，用种猪鲜精稀释液1:1等体积稀释，在36℃恒温箱中平衡30min，移至18℃恒温箱中，控制其温度在1.5～2h降温至18℃；
(2)稀释液添加
将降至18℃的精液以960G的离心力离心20min，弃去上清液，根据最终所需精液浓度0.5ml精液中含精子为5亿，兑入第一稀释液，将兑好的精液降温至7℃，根据最终所需精液浓度1ml精液中含精子为5亿加入第二稀释液，用灌装机将精液灌装到细管。将精液细管放入冷冻仪中进行冷冻，控制其温度在10min降至－150℃，然后将精液细管迅速投入液氮保存。准备好40ml的第三稀释液置于34℃恒温水浴锅，将保存在液氮里面的冻精细管投入到50℃的水中进行解冻，保持14～16秒，将精液细管取出后用干毛巾包裹并擦净，用剪刀将细管的封口端剪开，用杵子将精液从细管中顶出，使精液流进恒温好的第三稀释液中，精液根据最终配种所需浓度为40ml第三稀释液中含精子10亿进行添加。
解冻后精子活力达86％，顶体完整率达89％，质膜完整率83％，线粒体活性80％，畸形率10％。
需要说明的是，本发明解冻后精子活力采用精液分析仪测得，顶体完整率采用瑞氏染色法测得，质膜完整率采用PI染色测得，线粒体活性采用Rh123染色测得，畸形率采用瑞氏染色法测得。
应用例
将实施例1的冷冻精液应用到配种实验中，选择500头发情正常且无生产疾病的母猪进行冻精配种实验(其中初产母猪150头和经产母猪350头)，初产母猪准胎率为90％，经产母猪准胎率达93％。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种猪冷冻精液稀释剂，其特征在于，包括第一稀释液、第二稀释液、第三稀释液；按照质量份计，上述稀释液各原料的质量配比如下：
第一稀释液：乳糖6～8g、果糖1.5～3g、葡萄糖1～2g、烷基葡聚糖0.02～0.04g、柠檬酸0.5～0.8g、氯化钠0.16～0.3g、三羟基甲基氨基甲烷0.2～0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.03～0.05g、青霉素40u～60u、鲜蛋黄18～22g，采用100ml双蒸水溶解制得；
第二稀释液：果糖6～10g、蔗糖0.5～0.8g、柠檬酸钠0.5～1g、甘油2.7～4.4g、二甲基亚砜0.4～0.7g、乙二醇0.1～0.3g、十二烷基苯磺酸钠0.05～0.08g、链霉素80u～100u、鲜蛋黄18～22g，采用100ml双蒸水溶解制得；
第三稀释液：葡萄糖2.5～3.8g、氯化钾0.03～0.06g、半胱氨酸0.025～0.05g、碳酸氢钠0.5～0.75g、柠檬酸0.2～0.5g、乙二胺四乙酸二钠0.035～0.055g、青霉素80u～100u、链霉素80u～100u，采用100ml双蒸水溶解制得。
2.根据权利要求1所述的猪冷冻精液稀释剂，其特征在于，所述鲜蛋黄为鸡蛋黄，且需经过55～60℃、30min的灭菌处理。
3.一种猪冷冻精液稀释剂的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
取乳糖6～8g、果糖1.5～3g、葡萄糖1～2g、烷基葡聚糖0.02～0.04g、柠檬酸0.5～0.8g、氯化钠0.16～0.3g、三羟基甲基氨基甲烷0.2～0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.03～0.05g、青霉素40u～60u以及鲜蛋黄18～22g，溶于100ml双蒸水中，制备得到第一稀释液，放置室温备用；
取果糖6～10g、蔗糖0.5～0.8g、柠檬酸钠0.5～1g、甘油2.7～4.4g、二甲基亚砜0.4～0.7g、乙二醇0.1～0.3g、十二烷基苯磺酸钠0.05～0.08g、链霉素80u～100u以及鲜蛋黄18～22g，溶于100ml双蒸水中，制备得到第二稀释液，放置室温备用；
葡萄糖2.5～3.8g、氯化钾0.03～0.06g、半胱氨酸0.025～0.05g、碳酸氢钠0.5～0.75g、柠檬酸0.2～0.5g、乙二胺四乙酸二钠0.035～0.055g、青霉素80u～100u、链霉素80u～100u，溶于100ml双蒸水中，制备得到第三稀释液，放置室温备用。
4.根据权利要求3所述的猪冷冻精液稀释剂的制备方法，其特征在于，所述第一稀释液、第二稀释液和第三稀释液均需调pH值稳定至6～7，并移至恒温箱备用。
5.根据权利要求3所述的猪冷冻精液稀释剂的制备方法，其特征在于，所述双蒸水的温度为30～36℃；
6.根据权利要求3所述的猪冷冻精液稀释剂的制备方法，其特征在于，所述鲜蛋黄为鸡蛋黄，且需经过55～60℃、30min的灭菌处理。
7.一种根据权利要求1-6任一项所述的猪冷冻精液稀释剂的使用方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
S1：采用猪鲜精稀释剂将猪精液1:1等体积稀释，在第一温度恒温培养箱中平衡30～50分钟，移至第二温度恒温培养箱中，控制其温度在1.5～2h降温至第二温度；
S2：将步骤S1中得到的稀释精液离心，弃去上清液，加入第一稀释液，使得最终0.5ml精液中含精子为5亿，混匀后将精液降温至第三温度；
S3：将步骤S2中得到精液中加入第二稀释液，最终1ml精液中含精子为5亿；
S4：采用灌装机将步骤S3得到精液灌装到细管中，并放入冷冻仪中进行冷冻，控制温度在10分钟内降至第四温度以下，然后迅速投入液氮保存；
S5：将第三稀释液置于30℃～36℃恒温水浴锅，将保存在液氮里面的冻精细管进行解冻，解冻后将精液加入到恒温好的所述第三稀释液中，精液根据最终配种所需浓度为40ml第三稀释液中含精子10亿进行添加。
8.根据权利要求7所述的猪冷冻精液稀释剂的使用方法，其特征在于，所述第一温度为30℃～36℃，所述第二温度为16℃～18℃，所述第三温度为5℃～7℃，所述第四温度为－150℃。
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