CN116235845A - 一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法 - Google Patents

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韩兵社
蔡心清
黄柯嘉
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Abstract

本发明公开了一种斑马鱼卵母细胞冷冻保存技术，包括稀释液配制、抗冻液配制、卵母细胞收集、卵母细胞平衡、卵母细胞分装、降温程序、升温解冻程序、存活率检测等。本发明采用甲醇、二甲基亚砜、蔗糖和褪黑素的复合配方，实现了更好的保存效果，冷冻保存斑马鱼卵母细胞24h后复苏，存活率达到70％以上。本发明通过利用褪黑素的抗氧化效果，降低了过程中ROS对卵母细胞的损伤，改善了解冻后卵母细胞的质量。

Description

一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及生物材料/组织冷冻保存领域，尤其是一种卵母细胞冷冻保存技术。
背景技术
生物配子的冷冻保存技术在上世纪50年代首次取得成功以来，经过几十年的发展，目前在人类医疗领域、动植物优良遗传育种的保存以及野生濒危物种的种质保存等方面都发挥着重要的作用。自1978年第一个试管婴儿诞生以来，试管受精已成为人类医疗系统的一个重要领域,现在这项技术已经被广泛的应用于临床。除了临床上的应用，低温冻存技术还被广泛应用于畜牧业与养殖业，主要包括改善孵化场的孵卵管理(例如修改后代的生产季节)，保存通过遗传改良工作得到的优良品系等。另外，这项技术还被用来帮助存在生殖困难的物种繁衍后代。
然而，尽管在哺乳动物的研究中，卵母细胞的冷冻保存已经取得了巨大的成功，但在鱼类中，卵母细胞的低温冻存很少有成功的案例，或是实验的结果难以重复。自然界的鱼类有25000到30000种，是脊椎动物最大的一类，具有极高的生物多样性。这种多样性使鱼类配子在形态和其他生物学特征上表现出显著的差异，这导致在冻存过程中细胞的体积变化、冰晶形成、冷冻保护剂毒性等或多或少都存在一定的种间特异性，这对包括卵母细胞在内的鱼类配子的冷冻保存研究带来了一定的困难。另外，由于鱼类卵母细胞体积大，存在绒毛膜，对冷冻保护剂渗透性低以及冷敏感性高等特点，鱼类卵母细胞的冷冻保存受到了严重的限制。因此，鱼类卵母细胞的冻存仍处在实验阶段，离水产养殖应用还有一定距离。
在低温冷冻过程中，ROS的产生是造成细胞损伤的重要因素，如何降低ROS对卵母细胞的损伤是冷冻保存技术优化的方向之一。在哺乳动物冷冻保存的研究中，一些抗氧化剂，例如褪黑素、谷胱甘肽、甜菜碱等被发现对于哺乳动物细胞在冷冻保存后的存活率有一定改善，但是目前这些试剂在鱼类配子的冻存研究中还很少被应用。
发明内容
本申请提供了一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其目的在于，使用抗氧化剂保护卵母细胞在冷冻与体外培养阶段受到的损伤，提高冻存后斑马鱼卵母细胞的存活率和卵母细胞保存质量。
本申请是通过以下技术方案实现的：
一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，包括稀释液配制、抗冻液配制、卵母细胞收集、卵母细胞平衡、卵母细胞分装、降温程序、升温解冻程序、存活率检测，具体步骤如下：
(1)稀释液配制：将培养基稀释，并低温保存；
(2)抗冻液、平衡液配制：取2份步骤(1)的稀释液，分别制作抗冻液、平衡液；
(3)卵母细胞收集：解剖斑马鱼雌鱼，取出卵巢组织，用解剖镊将粘连在一起的卵母细胞逐个分离开；
(4)卵母细胞平衡与分装：将分离好的卵母细胞转移到平衡液中，先静置，然后转移到抗冻液中，分装到冻存管内；
(5)降温程序：将步骤(4)的冻存管迅速插入液氮中；
(6)升温解冻程序：将卵母细胞从液氮中取出，并解冻，随后，将卵母细胞先平衡，再用培养基洗涤；
(7)存活率检测：使用台盼蓝染色法检测卵母细胞存活率。
作为优选实施例，所述步骤(1)的具体做法为：稀释液90％ L-15配制：使用ddH2O将L-15培养基稀释至90％浓度，放于4℃保存；
作为优选实施例，所述步骤(2)的具体做法为：抗冻液、平衡液配制：取上述稀释液，添加1.5M甲醇，5.5M二甲基亚砜，0.5M蔗糖和10-3M褪黑素作为抗冻液；另取上述稀释液，添加1.5M甲醇，2.75M二甲基亚砜，作为平衡液；
作为优选实施例，所述步骤(3)的具体做法为：卵母细胞收集：解剖成年斑马鱼雌鱼，取出卵巢组织，在90％ L-15溶液中用解剖镊将粘连在一起的卵母细胞逐个分离开；
作为优选实施例，所述步骤(4)的具体做法为：卵母细胞平衡与分装：将分离好的卵母细胞转移到平衡液中，静置15min，然后转移到抗冻液中，分装到冻存管内，每管50枚左右。
作为优选实施例，所述步骤(5)的具体做法为：降温程序：将冻存管迅速插入液氮中。
作为优选实施例，所述步骤(6)的具体做法为：升温解冻程序：将卵母细胞从液氮中取出，并在28℃的水浴中解冻1min，随后，将卵母细胞在1M蔗糖溶液中平衡1min，再转移到0.5M蔗糖溶液平衡持续3min，最后转移到0.25M蔗糖溶液，平衡5min，平衡后的卵母细胞用90％L-15培养基洗涤三次。
作为优选实施例，所述步骤(7)中的台盼蓝染色法具体为：使用4％台盼蓝染液浸泡卵母细胞2min，用PBS溶液清洗，解剖镜下观察，未被染上蓝色的为存活细胞。
有益效果：
(1)本方案采用有机溶剂、糖类和抗氧化剂的复合配方，实现了更好的保存效果，冷冻保存斑马鱼卵母细胞24h后复苏，存活率达到70％；
(2)本方案添加了适量的褪黑素作为抗氧化剂，降低了卵母细胞在冻存中的氧化损伤，提高了冻存后线粒体的质量。
附图说明
图1为添加不同浓度褪黑素冻存斑马鱼卵母细胞台盼蓝染色结果示意图。
图2为冻存斑马鱼卵母细胞琥珀酸脱氢酶检测结果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
使用本斑马鱼卵母细胞冷冻保存技术，保存斑马鱼卵母细胞300枚，并检测存活情况，具体如下：
(1)稀释液90％ L-15配制：使用ddH2O将L-15培养基稀释至90％浓度，放于4℃保存；
(2)抗冻液、平衡液配制：取上述稀释液，添加1.5M甲醇，5.5M二甲基亚砜，0.5M蔗糖和10-3M褪黑素作为抗冻液；另取上述稀释液，添加1.5M甲醇，2.75M二甲基亚砜，作为平衡液；
(3)卵母细胞收集：解剖成年斑马鱼雌鱼，取出卵巢组织，在90％ L-15溶液中用解剖镊将粘连在一起的卵母细胞逐个分离开；
(4)卵母细胞平衡与分装：将分离好的卵母细胞转移到平衡液中，静置15min，然后转移到抗冻液中，分装到冻存管内，每管50枚左右。
(5)降温程序：将冻存管迅速插入液氮中。
(6)升温解冻程序：24h后，将卵母细胞从液氮中取出，并在28℃的水浴中解冻1min。随后，将卵母细胞在1M蔗糖溶液中平衡1min，再转移到0.5M蔗糖溶液平衡持续3min，最后转移到0.25M蔗糖溶液，平衡5min。平衡后的卵母细胞用90％L-15培养基洗涤三次。
(7)存活率检测：使用台盼蓝染色法检测卵母细胞存活率，最终存活率为80.2％。
在该实施例中，我们通过此玻璃化卵母细胞冷冻方法，成功冻存斑马鱼卵母细胞24h，冻存后的存活率达到80％以上。
实施例2：
使用本斑马鱼卵母细胞冷冻保存技术，保存斑马鱼卵母细胞150枚，并在解冻后进行体外培育，具体如下：
(1)稀释液90％ L-15配制：使用ddH2O将L-15培养基稀释至90％浓度，放于4℃保存；
(2)抗冻液、平衡液配制：取上述稀释液，添加1.5M甲醇，5.5M二甲基亚砜，0.5M蔗糖和10-3M褪黑素作为抗冻液；另取上述稀释液，添加1.5M甲醇，2.75M二甲基亚砜，作为平衡液；
(3)卵母细胞收集：解剖成年斑马鱼雌鱼，取出卵巢组织，在90％ L-15溶液中用解剖镊将粘连在一起的卵母细胞逐个分离开；
(4)卵母细胞平衡与分装：将分离好的卵母细胞转移到平衡液中，静置15min，然后转移到抗冻液中，分装到冻存管内，每管50枚左右。
(5)降温程序：将冻存管迅速插入液氮中。
(6)升温解冻程序：24h后将卵母细胞从液氮中取出，并在28°C的水浴中解冻1min。随后，将卵母细胞在1M蔗糖溶液中平衡1min，再转移到0.5M蔗糖溶液平衡持续3min，最后转移到0.25M蔗糖溶液，平衡5min。平衡后的卵母细胞用90％L-15培养基洗涤三次。
(7)将卵母细胞转移到含有0.5％ BSA和10-3褪黑素的90％ L-15中，28℃培养2h，检测存活率，存活率可达到40％以上。
在该实施例中，我们通过此玻璃化卵母细胞冷冻保存方法，成功冻存斑马鱼卵母细胞24h，解冻后经过体外复苏，存活率能达到40％以上。
以上两个实施例说明，该玻璃化冷冻保存卵母细胞的方法，在斑马鱼卵母细胞冷冻保存的实践中有很好的效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其特征在于，包括稀释液配制、抗冻液配制、卵母细胞收集、卵母细胞平衡、卵母细胞分装、降温程序、升温解冻程序、存活率检测，具体步骤如下：
(1)稀释液配制：将培养基稀释，并低温保存；
(2)抗冻液、平衡液配制：取2份步骤(1)的稀释液，分别制作抗冻液、平衡液；
(3)卵母细胞收集：解剖斑马鱼雌鱼，取出卵巢组织，用解剖镊将粘连在一起的卵母细胞逐个分离开；
(4)卵母细胞平衡与分装：将分离好的卵母细胞转移到平衡液中，先静置，然后转移到抗冻液中，分装到冻存管内；
(5)降温程序：将步骤(4)的冻存管迅速插入液氮中；
(6)升温解冻程序：将卵母细胞从液氮中取出，并解冻，随后，将卵母细胞先平衡，再用培养基洗涤；
(7)存活率检测：使用台盼蓝染色法检测卵母细胞存活率。
2.根据权利要1所述的一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)的具体做法为：稀释液90％L-15配制：使用ddH2O将L-15培养基稀释至90％浓度，放于4℃保存。
3.根据权利要1所述的一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体做法为：抗冻液、平衡液配制：取上述稀释液，添加1.5M甲醇，5.5M二甲基亚砜，0.5M蔗糖和10-3M褪黑素作为抗冻液；另取上述稀释液，添加1.5M甲醇，2.75M二甲基亚砜，作为平衡液。
4.根据权利要1所述的一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)的具体做法为：卵母细胞收集：解剖成年斑马鱼雌鱼，取出卵巢组织，在90％L-15溶液中用解剖镊将粘连在一起的卵母细胞逐个分离开。
5.根据权利要1所述的一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其特征在于，所述步骤(4)的具体做法为：卵母细胞平衡与分装：将分离好的卵母细胞转移到平衡液中，静置15min，然后转移到抗冻液中，分装到冻存管内，每管50枚左右。
6.根据权利要1所述的一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其特征在于，所述步骤(5)的具体做法为：降温程序：将冻存管迅速插入液氮中。
7.根据权利要1所述的一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其特征在于，所述步骤(6)的具体做法为：升温解冻程序：将卵母细胞从液氮中取出，并在28℃的水浴中解冻1min，随后，将卵母细胞在1M蔗糖溶液中平衡1min，再转移到0.5M蔗糖溶液平衡持续3min，最后转移到0.25M蔗糖溶液，平衡5min，平衡后的卵母细胞用90％L-15培养基洗涤三次。
8.根据权利要1所述的一种基于玻璃化法冷冻保存斑马鱼卵母细胞的方法，其特征在于，所述步骤(7)中的台盼蓝染色法具体为：使用4％台盼蓝染液浸泡卵母细胞2min，用PBS溶液清洗，解剖镜下观察，未被染上蓝色的为存活细胞。
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