CN114667998A - 一种绵羊精液低温保存抗氧化稀释液及其制备方法与应用 - Google Patents

一种绵羊精液低温保存抗氧化稀释液及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绵羊精液低温保存抗氧化稀释液及其制备方法与应用。本发明绵羊精液低温保存抗氧化稀释液包括含Mito‑tempo的基础液和浓度为0～16mM的谷胱甘肽，最适宜的添加量为4mM，基础液以100mL计含有如下成分：2.7g Tris，0.96g果糖，1.375g柠檬酸，15mL卵黄，214μL、17.53mM白藜芦醇，151.1μL、33.09mM槲皮素，612μL、4.90mM Mito‑tempo，双蒸水定容至100mL。本发明操作简便，应用成本低廉，效果显著，对动物不产生任何有害影响，可显著提高优良公畜的利用率，为提高绵羊低温保存精液提供了新途径，在绵羊精液保存及相关的胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。

Description

一种绵羊精液低温保存抗氧化稀释液及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于畜牧领域，尤其涉及一种绵羊精液低温保存抗氧化稀释液及其制备方法与应用。
背景技术
随着我国肉羊产业规模化、集约化发展，绵羊人工授精技术的需求也日益增加，绵羊精液的保存是人工授精的一个重要步骤，直接影响人工授精后母羊的受胎率，提高精液保存质量一直是畜牧工作者的一项重要工作。
绵羊精液的保存方法主要有常温保存、低温保存和冷冻保存三种。精液在常温下由于保存时间短(1～3天)，使得人工授精技术受到时间和空间的限制。目前，虽然绵羊精液冷冻保存技术也取得了较大进步，能实现40％～60％的精子在解冻后仍然保持活动性，但其中仅有30％左右的精子能保持快速的运动能力和相对稳定的受精能力。如果通过子宫颈输精，绵羊冻精的受胎率仍然与鲜精差距很大(低20～30％)，只能通过成本和技术门槛相对较高的腹腔镜方式输精，极大限制了冷冻精液在绵羊生产中的推广应用。低温保存是一种操作简单、保存效果相对较好的精液保存方法，与常温保存相比，克服了保存时间短的弊端，扩大了优秀种公羊精液的辐射范围；与冷冻保存相比，低温保存可降低生产成本，并且可以有效减少冷冻保存产生的冷冻损伤，提高精子活率和母羊的受胎率。在绵羊遗传改良过程中，应用精液的低温保存技术可以延长精液的保存时间，有效提高种公羊的利用率，因此绵羊低温保存技术对我国养产业的发展具有重要的意义。
精液的低温冷冻保存技术能充分利用优良种畜的遗传资源，迅速扩大畜群的良种比例；同时，此技术也是治疗哺乳动物不孕症的有效辅助手段。低温保存主要是在0～5℃温度条件下保存，精子的代谢和活动会随着温度逐渐降低而受到抑制，对营养物质的需求降低。但是，随着精液保存时间的延长，精子内活性氧自由基(ROS)会大量积累，过量的ROS会氧化损伤精子的结构和功能，进而影响精液品质。
精液稀释液能为体外保存的精子提供保护和营养，对精子的活率和受精能力有重要的影响。在稀释液中通常会添加有某些特殊作用的物质，以满足精子在体外生存的各种需要，能够达到调控稀释液的渗透压、酸碱度、抑制稀释液中的细菌滋生，改变精子生存环境，满足精子长期生存需求的目的。
绵羊精液低温保存技术还不成熟，在生产上的应用还十分有限，制约了优选种公羊的利用和人工授精技术的推广应用。因此，提高绵羊低温保存精液的品质，延长精子体外保存效果是畜牧生产和科学研究所必需的。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种能提高绵羊精液低温保存品质的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液。
本发明的再一目的在于提供上述绵羊精液低温保存抗氧化稀释液的制备方法。
本发明的另一目的在于提供上述绵羊精液低温保存抗氧化稀释液在提高绵羊精液低温保存品质中的应用。
本发明是这样实现的，一种绵羊精液低温保存抗氧化稀释液，该绵羊精液低温保存抗氧化稀释液包括含Mito-tempo的基础液和浓度为2～16mM的谷胱甘肽。
优选地，所述基础液以100mL计含有如下成分：2.7g Tris，0.96g果糖，1.375g柠檬酸，15mL卵黄，214μL、17.53mM白藜芦醇，151.1μL、33.09mM槲皮素，612μL、4.90mM Mito-tempo，双蒸水定容至100mL。
优选地，所述基础液还包括抑菌物质。
优选地，所述抑菌物质为青链霉素；其中，所述基础液以100mL计，包含10mL、100IU青链霉素。
优选地，所述谷胱甘肽的浓度为4mM。
本发明进一步公开了上述绵羊精液低温保存抗氧化稀释液的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)Mito-tempo的基础液的配置
将2.7g Tris、0.96g果糖、1.375g柠檬酸加入容量瓶中，双蒸水定容至50mL，搅拌均匀，加入10mL、100IU单位的青链霉素混合液，15mL卵黄，214μL、17.53mM白藜芦醇，151.1μL、33.09mM槲皮素，612μL、4.90mM Mito-tempo，蒸馏水定容到100mL，摇匀，得到Mito-tempo的基础液；
(2)将所述基础液倒入灭菌的小玻璃瓶中，置于4℃冰箱中冷藏保存，添加谷胱甘肽，得到谷胱甘肽浓度为2～16mM的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液。
本发明进一步公开了上述绵羊精液低温保存抗氧化稀释液在提高绵羊精液低温保存品质中的应用。
本发明克服现有技术的不足，提供一种绵羊精液低温保存抗氧化稀释液及其制备方法与应用。本发明绵羊精液低温保存抗氧化稀释液包括含Mito-tempo的基础液和浓度为0～16mM的谷胱甘肽，最适宜的添加量为4mM。
谷胱甘肽(GSH)是非酶类抗氧化系统主要物质之一，GSH在哺乳动物细胞中广泛被发现，其具有清除氧自由基、解毒、抗氧化的能力等作用，谷胱甘肽能直接与机内活性氧发生反应形成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)复合体，进一步催化降解体内过氧化氢来实现抗氧化作用。本发明经研究发现，添加适宜浓度的谷胱甘肽可有效的提高精液的低温保存的精子活率，提高精子质膜完整性、线粒体活性、顶体完整性和精子DNA完整性以及精清的总抗氧化能力。
本发明基础液中的Mito-tempo是一种针对线粒体的新型抗氧化剂，可以保护细胞在不同病理条件下免受氧化应激，此外，Mito-tempo能够穿过脂质双层并在线粒体内积累，通过消除或抑制线粒体氧自由基和脂质过氧化的产生而发挥靶向抗氧化作用，保护线粒体功能完整性和精子膜功能。
总体而言，GSH和Mito-tempo都可以减少ROS的产生，抑制脂质过氧化，防止大量ROS破坏氧化还原体系，能够有效提高低温保存后精液的品质。在含有Mito-tempo的绵羊低温保存稀释液中再添加适量的GSH可提高精清中的总抗氧化能力，同时可以提高精子质膜完整性、DNA完整性、顶体完整性和线粒体活性，有效提高精子的运动能力，进一步提高保存后的精液质量。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)现有稀释液在稀释绵羊精液并低温保存3天后，精子活力就下降到0.7以下，而本发明稀释液在稀释绵羊精液并低温保存5天后，精子活力仍然在0.8以上，能够显著提高精液低温保存后精子的活率，同时本发明绵羊精液低温保存抗氧化稀释液也可以提高精子质膜完整性、线粒体活性、顶体完整性以及精子DNA完整性，以及提高精清的总抗氧化能力，从而保证精子的受精能力；
(2)本发明操作简便，应用成本低廉，效果显著，对动物不产生任何有害影响，可显著提高优良公畜的利用率，为提高绵羊低温保存精液提供了新途径，在绵羊精液保存及相关的胚胎移植产业和胚胎工程中广泛应用，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1为本发明各实施例的稀释液对绵羊低温保存精子活率的影响图；
图2为本发明各实施例的稀释液对绵羊精清总抗氧化能力(T-AOC)的影响实验数据图；
图3为本发明各实施例的稀释液对绵羊低温保存精子质膜完整性的影响；其中，图3A为实验数据图，图3B为显微镜下拍摄图；
图4为本发明各实施例的稀释液对绵羊低温保存精子线粒体活性的影响；其中，图4A为实验数据图，图4B为显微镜下拍摄图；
图5为本发明各实施例的稀释液对绵羊低温保存精子顶体完整性的影响；图5A为实验数据图，图5B为显微镜下拍摄图；
图6为本发明各实施例的稀释液对绵羊低温保存精子DNA完整性的影响；图6A为实验数据图，图6B为显微镜下拍摄图；
图7为本发明各实施例的稀释液对绵羊低温保存精子直线运动速度VSL的影响实验数据图；
图8为本发明各实施例的稀释液对绵羊低温保存精子直线运动速度VCL的影响实验数据图；
图9为本发明各实施例的稀释液对绵羊低温保存精子平均路径速度VAP的影响实验数据图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
(1)Mito-tempo的基础液的配置
将2.7g Tris、0.96g果糖、1.375g柠檬酸加入容量瓶中，双蒸水定容至50mL，搅拌均匀，加入10mL、100IU单位的青链霉素混合液，15mL卵黄，214μL、17.53mM白藜芦醇，151.1μL、33.09mM槲皮素，612μL、4.90mM Mito-tempo，蒸馏水定容到100mL，摇匀，得到Mito-tempo的基础液；
(2)将所述基础液倒入灭菌的小玻璃瓶中，置于4℃冰箱中冷藏保存，添加谷胱甘肽，得到谷胱甘肽浓度为2mM的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液B。
实施例2～4
实施例2～4与上述实施例1基本相同，差别在于，在步骤(2)中，添加谷胱甘肽的量有所区别，并对应得到谷胱甘肽浓度为4mM的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液C、8mM的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液D、16mM的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液E。
实施例5
实施例5与上述实施例1基本相同，差别在于，在步骤(1)中，青链霉素混合液的添加为0。
对比实施例1
对比实施例1与上述实施例1基本相同，差别在于，在步骤(2)中，基础液中不添加谷胱甘肽，得到谷胱甘肽浓度为0mM的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液A。
对比实施例2
对比实施例2与上述实施例1基本相同，差别之处在于，在步骤(1)中，基础液的配置时不添加Mito-tempo，得到绵羊精液低温保存抗氧化稀释液F。
效果实施例
以上述实施例1～4、对比实施例1、对比实施例2制备得到的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液A、B、C、D、E、F为对象分别进行以下实验。
1、准备工作
利用假阴道方法采集绵羊精液，将绵羊精液分别平均分成10份，分别置于在1.5mL的离心管中，做好标记。放在离心管架上，将离心管架放在提前准备好的泡沫塑料盒中，倒入100mL的37℃温水，放入4℃冰箱中降温，保存2.5h后，在第1～5天内，每天取出适量精液并用稀释液按体积比1:7进行稀释，得到稀释绵羊精液a、b、c、d、e。
2、精子活率的检测
从冰箱里取出低温保存的绵羊精液置于37℃水浴锅中温育3min，轻摇混匀后用移液枪取20μL精液于提前预热的装有20μL稀释液的离心管内，轻摇混匀得到稀释绵羊精液，分别吸取8μL精液滴于预热好的载玻片上，覆盖盖玻片，使用计算机辅助分析系统(CASA)在400×视野下进行检测。
检测结果如图1所示，在低温保存过程中，随着时间的延长，精子活率呈不同程度的下降，其中，低温保存稀释液中添加适宜浓度的谷胱甘肽即4mM可提高低温保存的精子活率；此外，低温保存抗氧化稀释液A中由于缺少谷胱甘肽，精子活率与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低3.07％，而低温保存抗氧化稀释液F由于缺少Mito-tempo，与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低11.57％。
3、精子总抗氧化能力(T-AOC)检测
各取20uL上述稀释绵羊精液a、b、c、d、e分别在4℃、3000×g离心15min，取上清，分装于200μL离心管，放入-80℃冰箱冷冻保存，利用试剂盒检测总抗氧化能力；其中，总抗氧化试剂盒购于南京建成生物工程研究所，根据试剂盒的使用方法进行检测。
检测结果如图2所示，在低温保存过程中，随着时间的延长，精清中抗氧化能力呈不同程度的下降，其中，低温保存稀释液中添加适宜浓度的谷胱甘肽即4mM可提高低温保存的精清中抗氧化能力，低温保存抗氧化稀释液A中缺少谷胱甘肽，精清的抗氧化能力与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低11％，而低温保存抗氧化稀释液F中缺少Mito-tempo，与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低30.7％。
4、精子质膜完整性的检测
利用低渗膨胀法(HOST)检测，首先提前预热离心管和低渗溶液。各取20μL上述稀释绵羊精液a、b、c、d、e分别加入离心管中，再加入200μL低渗溶液，混匀。在37℃水浴锅中孵育30min。取20μL混合液滴在载玻片上，自然风干后400×显微镜下观察，随机选取中部及四角视野进行拍摄观察，计数400个以上精子。弯尾参照WHO制定的精子尾部肿胀标准，计算精子质膜完整率。其中，
精子质膜完整率(％)＝(精子肿胀及尾部弯曲精子数/精子总数)×100％。
结果如图3所示，图3A为实验数据图，图3B为显微镜下拍摄图。在低温保存过程时，随着保存时间的延长精子的质膜完整性均有不同程度的下降，其中低温保存稀释液中添加适宜浓度的谷胱甘肽即4mM可提高精子的质膜完整性，低温保存抗氧化稀释液A中缺少谷胱甘肽，质膜完整的精子比例与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低5.75％，而低温保存抗氧化稀释液F中缺少Mito-tempo与4mM的绵低温保存抗氧化稀释液C相比降低15.13％。
5、精子线粒体活性的检测
采用JC-1/PI双标荧光染色法检测。提前预热好离心管及稀释液，用移液枪吸取35μL精液于离心管内，加入20μL稀释液混匀，然后迅速加入2μL JC-1及8μL PI，迅速混匀，避光，37℃孵育15min，加入8μL Hancock’s solution溶液，吹打混匀后取8μL混合精液于载玻片上，压片后在400×荧光显微镜下观察，随机选取四角及中部视野，计数400个以上精子。JC-1/PI荧光染色结果为：尾部呈橙色荧光的精子为高线粒体活性精子；尾部呈绿色荧光的精子为低线粒体活性精子。计算线粒体活性高的精子数所占的比例。其中，
精子线粒体活性＝(线粒体活性高的精子数/精子总数)×100％。
检测结果如图4所示，图4A为实验数据图，图4B为显微镜下拍摄图。在低温保存过程时，随着保存时间的延长，精子的线粒体活性均有不同程度的下降，其中低温保存稀释液中添加适宜浓度的谷胱甘肽即4mM可提高精子的线粒体活性，低温保存抗氧化稀释液A中缺少谷胱甘肽，高活性线粒体的精子比例与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低10.05％，而低温保存抗氧化稀释液F中缺少Mito-tempo与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低18.49％。
6、精子顶体完整性检测
采用金霉素荧光染色法(Chlortetracycline，CTC)测定。提前预热离心管，移液枪各吸取20μL上述稀释绵羊精液a、b、c、d、e分别加入各离心管中，再加入20μL CTC染色液，迅速混匀，避光孵育3min后加入8μL 12.5％的戊二醛溶液，吹打混匀后取4μL混合精液压片，在400×荧光显微镜下观察，随机选取四角及中部视野，计数400个以上精子。
CTC荧光染色结果显示为：精子整个头部呈强烈黄绿色荧光，或顶体帽区及赤道区呈强烈黄绿色荧光，后区荧光显著变暗，均为顶体完整；精子整个头部无荧光，或精子后区黄绿色荧光强烈但顶体区无荧光，均为顶体不完整。
精子顶体完整率(％)＝(顶体完整精子数/精子总数)×100％。
检测结果如图5所示，图5A为实验数据图，图5B为显微镜下拍摄图。在低温保存过程时，随着保存时间的延长，精子的顶体完整性均有不同程度的下降，其中低温保存稀释液中添加适宜浓度的谷胱甘肽即4mM可提高精子的顶体完整性，低温保存抗氧化稀释液A中缺少谷胱甘肽，顶体完整的精子比例与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低4.69％，而低温保存抗氧化稀释液F中缺少Mito-tempo与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低10.58％。
7、精子DNA完整性检测
采用OA/EB双荧光染法测定。提前预热离心管及稀释液，用移液枪吸取65μL精液加入离心管底部，再吸取30μL稀释液混匀，迅速加入3μL OA及4μL EB，迅速混匀，避光孵育15min后加入8μL Hancock’s solution溶液，吹打混匀后取8μL混合精液压片，在400×荧光显微镜下观察，随机选取四角及中部视野，计数400个以上精子。
OA/EB双荧光染法结果为：精子头部呈绿色荧光为DNA完整，呈红色或橙色为DNA不完整。其中，
精子DNA完整率(％)＝(精子DNA完整数/精子总数)×100％。
检测结果如图6所示，图6A为实验数据图，图6B为显微镜下拍摄图。在低温保存过程时，随着保存时间的延长，精子的DNA完整性均有不同程度的下降，其中低温保存稀释液中添加适宜浓度的谷胱甘肽即4mM可提高精子的精子DNA完整性，低温保存抗氧化稀释液A中缺少谷胱甘肽，DNA完整的精子比例与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低5.34％，而低温保存抗氧化稀释液F中缺少Mito-tempo与4mM的低温保存抗氧化稀释液C相比降低13.24％。
8、精子运动参数的检测
采用精子辅助分析仪(CASA)分析。从冰箱里取出低温保存的绵羊精液置于37℃水浴锅中温育3min，轻摇混匀后用移液枪取20μL精液于提前预热的装有20μL稀释液的离心管内，用移液枪吸取10μL精液滴于预热37℃的载玻片上，轻轻覆盖盖玻片，将载玻片置于400倍显微镜下，通过每次至少随机检测5个视野，检测精子的直线运动速度(VSL)、曲线运动速率(VCL)和路径速度(VAP)。
检测结果如图7～9所示，在低温保存过程时，随着保存时间的延长，精子的运动速度均有不同程度的下降，其中低温保存稀释液中添加适宜浓度的谷胱甘肽即4mM可提高精子的精子的直线运动速度(VSL)、曲线运动速率(VCL)和路径速度(VAP)。绵羊稀释液A组缺少谷胱甘肽，精子的直线运动速度(VSL)、曲线运动速率(VCL)和路径速度(VAP)与4mM的绵羊精液稀释液C相比分别降低5.26％，8.43％和8.51％，而稀释液F组缺少Mito-tempo与4mM的绵羊精液稀释液C相比分别降低19.4％，10.66％和18.14％。。
9、综上
由以上试验结果可得，谷胱甘肽GSH是非酶类抗氧化系统主要物质之一，稀释液里添加适量GSH可弥补精液中GSH的缺失，Mito-tempo是一种针对线粒体的新型抗氧化剂，可通过降低线粒体氧化损伤保护线粒体，从而降低细胞氧化应激水平，Mito-tempo和GSH都具有清除ROS的作用，添加适宜浓度的GSH可有效的提高精液的低温保存的精子活率，提高精子质膜完整性、线粒体活性、顶体完整性和精子DNA完整性以及精清的总抗氧化能力，进一步提高低温保存后精液的品质。
本发明所提供的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液通过对所含成分的选择和配比的精确控制，相较对比例实现了更好的精液保存效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种绵羊精液低温保存抗氧化稀释液，其特征在于，该绵羊精液低温保存抗氧化稀释液包括含Mito-tempo的基础液和浓度为2～16mM的谷胱甘肽。
2.如权利要求1所述的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液，其特征在于，所述基础液以100mL计含有如下成分：2.7g Tris，0.96g果糖，1.375g柠檬酸，15mL卵黄，214μL、17.53mM白藜芦醇，151.1μL、33.09mM槲皮素，612μL、4.90mM Mito-tempo，双蒸水定容至100mL。
3.如权利要求1或2所述的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液，其特征在于，所述基础液还包括抑菌物质。
4.如权利要求3所述的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液，其特征在于，所述抑菌物质为青链霉素；其中，所述基础液以100mL计，包含10mL、100IU青链霉素。
5.如权利要求1所述的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液，其特征在于，所述谷胱甘肽的浓度为4mM。
6.权利要求1～5任一种所述绵羊精液低温保存抗氧化稀释液的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)Mito-tempo的基础液的配置
将2.7g Tris、0.96g果糖、1.375g柠檬酸加入容量瓶中，双蒸水定容至50mL，搅拌均匀，加入10mL、100IU单位的青链霉素混合液，15mL卵黄，214μL、17.53mM白藜芦醇，151.1μL、33.09mM槲皮素，612μL、4.90mM Mito-tempo，蒸馏水定容到100mL，摇匀，得到Mito-tempo的基础液；
(2)将所述基础液倒入灭菌的小玻璃瓶中，置于4℃冰箱中冷藏保存，添加谷胱甘肽，得到谷胱甘肽浓度为2～16mM的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液。
7.权利要求1～5任一项所述的绵羊精液低温保存抗氧化稀释液在提高绵羊精液低温保存品质中的应用。
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