CN109258625A - 一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方，制得冷冻精液稀释液：每100毫升中含有：柠檬酸钠：0.9～1.2克，蔗糖：3～5克，低密度脂蛋白：6～8毫克，甘油：4～7毫升，白藜芦醇：6～8毫克，褪黑素：5～8毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素8万单位。本发明首次把低密度脂蛋白、白藜芦醇，褪黑素联合加入到精液稀释液中，并对稀释液的配制方法做了修正。实验数据表明，冷冻精液稀释液不仅提高了精液冻融后的精子活力和顶体完整率，并且提高了精浆中用来保护精子受精能力的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GR)、谷胱甘肽还原酶(GSH)的冻融后活性，并提高了精子DNA完整性，确保了此精液配方能够提高精子冻后品质。

Description

一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方

技术领域

本发明涉及农业牲畜技术领域，尤其涉及一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方。

背景技术

家畜精液冷冻成功为人工授精技术的发展产生了极其深远的影响，首先为扩大优秀种公畜的利用率和延长利用时间奠定了基础，其次为人工授精和低温生物学的发展提供了广阔的空间。由于冷冻精液在运输上比较方便，不论从时间还是从空间上，都使种公畜的配种效能得到充分发挥，加速了家畜品种改良的步伐。虽然各国都展开了对牛、猪、马、鸡等冷冻精液的研究，但是现在只有牛冷冻精液的人工授精技术广泛应用于生产实践。在家畜冷冻精液的稀释液研制方面，所有稀释液和保存环境的主要作用都是为了给精子提供足够的营养物质供精子代谢需要，防止精子迅速冷冻造成损伤，进行缓冲以防止pH的变化，维持适当的渗透压，平衡电解质，抑制细菌的生长，扩大稀释倍数以增加输精次数，并且提高精子冻后活率，提高良种家畜和精液的利用效率。

秦川牛因主产于八百里秦川而得名，肉役兼用，是我国54个牦牛品种中的佼佼者，被誉为“国之瑰宝”。近几年来，随着我国经济的发展，人民生活水平的提高，牛肉逐渐走进了千家万户，逐渐成为了普通百姓饭桌上的家常菜。可是精子品质低下，授精率低成为制约秦川牛快速扩繁的因素。所以对秦川牛精液冻后品质进行研究并提高冷冻解冻后精子品质已经成为当务之急。

为了不断提高牛的冷冻精液的冷冻效果，在过去的60多年中，国内专家一直在努力探索和寻找最适宜的冷冻保护剂，提高奶牛和肉牛冷冻精液的冷冻效果。国内外研究表明，精液经过冷冻-解冻处理后精子DNA损伤加剧，导致精子冻融后精子品质及受精率降低，这一直是困扰精子受精能力的一个问题。因此冷冻精液品质的高低成了制约奶牛、肉牛人工受精成功率的重要因素。但是在生产实践中，时常有精子冻融后活力不高，受精率低下，影响人工授精的效果。因此，根据目前的趋势，利用实验室的条件对秦川牛的精液稀释液配方进行研究，开发出新的精液稀释液，这样既可以提高精子冻融后的存活率及受精率，又加快了秦川牛的改良力度，为迅速提高秦川牛的扩繁，对于秦川牛的快速扩繁和大量饲养具有积极的作用。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方。针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种用于提高牛冷冻精液冻融后品质及受精率的新型冷冻精液稀释液配方。制得的该冷冻精液稀释液可以明显提高精子冻后活率、顶体完整率、精浆中抗氧化物酶的活力及精子DNA完整性，从而提高精子冻融后的品质及受精率。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方，制得冷冻精液稀释液：每100毫升中含有：柠檬酸钠：0.9～1.2克，蔗糖：3～5克，低密度脂蛋白：6～8毫克，甘油：4～7毫升，白藜芦醇：6～8毫克，褪黑素：5～8毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素8万单位。

优选的，制得的该冷冻精液稀释液每100毫升中含有：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，低密度脂蛋白：8毫克，甘油：6毫升，白藜芦醇：7毫克，褪黑素：5毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位。

本发明一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液的配制方法，包括下列步骤：

(1)准确称取柠檬酸钠、蔗糖、低密度脂蛋白、白藜芦醇、褪黑素和甘油，加蒸馏水至100毫升，在磁力搅拌器上充分搅拌均匀，得到混合溶液，然后放入4℃冰箱过夜；

(2)精液稀释前，在混合溶液中加入配方量的壮观霉素毫克和庆大霉素，并搅拌10分钟；

(3)用酸或碱调整精液稀释液的酸碱度在6.7～7.2之间，用0.22微米滤器对稀释液进行滤菌处理，得到冷冻精液稀释液。

本发明的有益效果在于：

本发明是一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方，与现有技术相比，本发明首次把低密度脂蛋白、白藜芦醇，褪黑素联合加入到精液稀释液中，并对稀释液的配制方法做了修正。实验数据表明，本发明的冷冻精液稀释液不仅提高了精液冻融后的精子活力和顶体完整率，并且提高了精浆中用来保护精子受精能力的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GR)、谷胱甘肽还原酶(GSH)的冻融后活性，并提高了精子DNA完整性，确保了此精液配方能够提高精子冻后品质。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明：

按照本发明的技术方案，配制100毫升的冷冻精液稀释液需要的物质为：柠檬酸钠：0.9～1.2克，蔗糖：3～5克，低密度脂蛋白：7-9毫克，甘油：4～7毫升，白藜芦醇：6～8毫克，褪黑素：5～7毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。

其最佳的冷冻精液稀释液配方为：每100毫升中含有的物质含量为：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，低密度脂蛋白：8毫克，甘油：6毫升，白藜芦醇：7毫克，褪黑素：5毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素8万单位(IU)。

其配制方法是：

1)称取配方中的原料：柠檬酸钠，蔗糖，低密度脂蛋白，甘油，白藜芦醇，褪黑素，蒸馏水。

2)将以上的柠檬酸钠，蔗糖，低密度脂蛋白，褪黑素，白藜芦醇，甘油，用蒸馏水配置成基础液，用磁力搅拌器搅拌60分钟，得到混合溶液，4℃冰箱内过夜备用。

3)精液稀释前，在混合溶液中加入配方量的庆大霉素和壮观霉素，然后在磁力搅拌器搅拌10分钟。

4)用酸或碱调整稀释液PH值为6.5～7.5，用0.22微米滤器对稀释液进行滤菌处理，得到精液稀释液。

测定本实验配制的冷冻精液稀释液与传统配方在对牛精子冻后活率、顶体完整率、精浆中抗氧化物酶活性方面的差别。其中测定的精浆抗氧化物酶主要包括过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GR)、谷胱甘肽还原酶(GSH)。

精子冻后活率、顶体完整率及精浆抗氧化物酶活性的检测方法如下：

(1)精液解冻后立即在35℃～37℃的温度下进行精子活率检查。评定时，用玻璃棒蘸取1滴精液，滴于载玻片上，加上盖玻片，使盖玻片和载玻片之间充满精液，然后置于400倍～600倍显微镜下观察。在显微镜视野中，通过对精液上、中、下三层液面精子活动情况综合观察，评定精子活率。

(2)取一滴解冻后的精液滴在干净的载玻片上，用另一载玻片呈45度，将精液抹向另一侧，制成抹片。自然风干后用1～2毫升福尔马林磷酸盐缓冲液固定15分钟，水洗干燥后用姬姆萨染色90分钟，然后除去抹片上的染液，风干后置于1000倍生物显微镜下观察300个精子，记录精子总数和顶体完整精子数。

(3)用测定酶的相关试剂盒(测定酶的试剂盒均来自南京建成生物技术公司)严格按照操作规程对精浆抗氧化物酶的活性进行测定。

(4)利用单细胞凝胶电泳技术检测精子DNA完整性。方法步骤如下：

制片：将医用胶带粘在磨毛的普通透明载玻片一端，用其围成边长约2cm的正方形框。先在该正方形框内铺上150ul 0.75％(w/v)正常溶点的琼脂糖，盖上盖玻片，室温下使胶定型。

精子裂解：在精液中加入配制的细胞裂解液，10℃放置1h，离心，弃上清液，加入含有DTT的细胞裂解液，10℃放置1h，弃上清。加入含有蛋白酶K的细胞缓冲液，45℃水浴3h。然后制作细胞凝胶混合液均匀的铺在已经制备好的凝胶盖玻片上，盖上盖玻片，放置10min，轻轻剥离盖玻片。

单细胞凝胶电泳：在水平电泳槽中加入新鲜配制的碱性电泳液(0.1mmol/L NaOH，1mmol/L Na2EDTA，PH为10)，将玻片并排放置于电泳槽中，静置20min。在20V电压下通过升降电泳液液面的高度调整电流为100mA。然后在4℃条件下电泳60min。在水平电泳槽中完成电泳后，将玻片从电泳槽中取出，然后将其浸泡于浓度为0.4mol/L酸碱度PH为7.5的Tris-Hcl溶液中，浸泡5min更换全部液体，重复3次，以清除碱和去污剂的影响。最后取出玻片，用100ml 20ug/ml的溴化乙锭(EB)染色15min盖上盖玻片后荧光显微镜下镜检。精子NDA的损伤用精子头部中心处的荧光强度与沿迁移方向的荧光强度来表示精子细胞的总长和尾长，以尾长代表精子的损伤程度，每个样本重复3次，每次计数100个精子细胞。

以下是发明人给出的一个具体试验实施例，试验选用体质健壮、性欲旺盛的成年秦川种公牛，按种公牛饲养管理要求进行饲养，其采精频率为每周3次。利用假阴道采集法采集公牛精液，精液采集后，立即在35℃～37℃下镜检。所采集的精液为乳白色或乳黄色，无异味，精子形态正常，活率达到0.7以上方可用于制作冷冻精液。

本试验设置了三个不同的冷冻精液稀释液配方及传统配方：

配方1：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克,低密度脂蛋白：8毫克，甘油：6毫升，白藜芦醇：7毫克，褪黑素：5毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。

配方2：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，低密度脂蛋白：7毫克，甘油：6毫升，褪黑素：6毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。

配方3：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，低密度脂蛋白：9毫克，甘油：6毫升，白藜芦醇：8毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。

传统配方：配制100毫升稀释液：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，蛋黄：20毫升，甘油：6毫升，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位(IU)。

严格按以上配方称取所含成分：柠檬酸钠、蔗糖、低密度脂蛋白、甘油、白藜芦醇和褪黑素，用蒸馏水定容至100毫升。在磁力搅拌器上搅动60分钟充分搅拌均匀，得到混合溶液，然后放入4℃冰箱过夜。

精液稀释前，在混合溶液中加入壮观霉素35毫克，庆大霉素8万单位(IU)，并搅拌10分钟，用酸或碱调整稀释液的酸碱度，用PH计测定稀释液PH在6.7～7.2之间，得到精液稀释液。

使用时，用0.22微米滤器对稀释液进行滤菌处理，完毕后置入37.5℃水浴锅中，然后按照常规精液制作方法即可进行冷冻精液的解冻稀释，解冻后检测精液品质，具体指标见下表：

表1不同配方冷冻精液稀释液对冻融后精子品质的影响(平均数±标准差)

注：同行数据后所标字母相异标示差异显著(P<0.05)，所标字母相同标示差异不显著(P<0.05)，下同.

表2不同配方冷冻精液稀释液对冻融后精子DNA完整性的影响(平均数±标准差)

	配方一	配方二	配方三	配方四
					G0	78.98±2.35a	76.36±2.17a	76.98±2.99a	73.51±1.03b
GI	13.23±1.85ab	12.32±1.93b	13.25±2.82ab	14.12±2.21a
					GII	7.83±0.99Bb	9.02±2.65a	9.32±1.95a	10.95±0.98A

由表1可以看出，本发明所提供的冷冻精液稀释液，在精子活率、顶体完整率、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶活力等指标均显著优于其他配方。而配方一分别比配方二或三在精子活率方面提高5.6％～11.3％，比传统配方提高11.3％。在顶体完整率方面配方一高出其他配方约3.7％～5.5％，高于传统配方6.5％。在过氧化氢酶活力方面配方一高出其它配方0.5％～10.1％，高出传统配方15.1％。在谷胱甘肽过氧化物酶的活力方面配方一高出传统配方34.4％，谷胱甘肽还原酶活力方面比传统常用配方高出16.31％。在精子DNA完整率方面，配方一比配方二高出3.4％，比配方三高出2.6％，比配方4高出7.4％并显著高于配方四。所以经过以上分析得出实施制备的冷冻精液稀释液配制的三个配方，在精子冷冻解冻过程中对精子的品质及精子DNA的完整性能起到最大保护作用，其中配方一是最佳的冷冻精液稀释液配方。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方，其特征在于：制得冷冻精液稀释液：每100毫升中含有：柠檬酸钠：0.9～1.2克，蔗糖：3～5克，低密度脂蛋白：6～8毫克，甘油：4～7毫升，白藜芦醇：6～8毫克，褪黑素：5～8毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素8万单位。

2.如权利要求1所述的用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液配方，其特征在于：制得的该冷冻精液稀释液每100毫升中含有：柠檬酸钠：1.073毫克，蔗糖：4.344毫克，低密度脂蛋白：8毫克，甘油：6毫升，白藜芦醇：7毫克，褪黑素：5毫克，壮观霉素：35毫克，庆大霉素：8万单位。

3.一种用于提高牦牛冷冻精液冻后品质的稀释液的配制方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)准确称取柠檬酸钠、蔗糖、低密度脂蛋白、白藜芦醇、褪黑素和甘油，加蒸馏水至100毫升，在磁力搅拌器上充分搅拌均匀，得到混合溶液，然后放入4℃冰箱过夜；

(2)精液稀释前，在混合溶液中加入配方量的壮观霉素毫克和庆大霉素，并搅拌10分钟；

(3)用酸或碱调整精液稀释液的酸碱度在6.7～7.2之间，用0.22微米滤器对稀释液进行滤菌处理，得到冷冻精液稀释液。