CN1943525A - 一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法及其使用的稀释液 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物生殖生理与繁殖技术领域，具体涉及一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法及其使用的稀释液。以克服现有技术存在的冷冻精液的活力和受精率低的问题。其技术方案是：在精液冷冻保存中采用除精浆步骤，该步骤为中速短时两次稀释离心法。配套使用的稀释液，内含柠檬酸钠·2H2O：1.8～2.2g；葡萄糖：2.8～3.2g；果糖：3.1～3.5g；甘油：5～7.0ml；卵黄：18～24ml；双蒸水100ml；Tris0.01g；青霉素10万单位；链霉素10万单位；pH值在6.8～7.2。

Description

一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法及其使用的稀释液
所属技术领域：
本方法属于动物生殖生理与繁殖技术领域，具体涉及一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法及其使用的稀释液。
背景技术：
目前精液的冷冻保存技术是一项较为成熟的技术，该技术已广泛应用到各种家畜和人类，但该技术还在许多方面存在着缺陷和不足，这制约着畜禽改良等工作的进一步开展。近年来的一些研究表明，哺乳动物的精浆中含有许多有害物质，这些物质对精液冷冻保存产生不利的影响。因此，如何采取有效方法除掉其有害成分保留或增加有益成分，对于促进精子顶体反应、精子获能以及提高受精率具有重要意义。针对这一问题，有人对比分析了用离心去除精浆后对精子冷冻性能的影响，以期获得高质量的精子，达到提高精子受精率的目的，在除去精浆的过程中他们多采用低速长时一次离心洗涤法(250-500转/分，15-25分钟/次，离心1次)，这种方法费时且容易对精子造成机械损伤，因此，对提高精子活力和受精率的效果并不理想。
发明内容：
本发明提供一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法及其使用的稀释液，以克服现有技术存在的冷冻精液的活力和受精率低的问题。
为克服现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：
一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法是：在精液冷冻保存中采用除精浆步骤，该步骤为中速短时两次稀释离心法。
上述除精浆步骤具体是先用生理盐水以1∶3～4的比例在30℃等温稀释，以1000转/分离心5分钟，第一次去除精浆；再用生理盐水调整到第一次稀释的量，再以1000转/分离心5分钟，第二次去除精浆。
一种提高牛羊冷冻精液受精率的稀释液，内含柠檬酸钠.2H2O：1.8～2.2g；葡萄糖：2.8～3.2g；果糖：3.1～3.5g；甘油：5～7.0ml；卵黄：18～24ml；双蒸水100ml；Tris0.01g；青霉素10万单位；链霉素10万单位；pH值在6.8～7.2。
上述方案的优选方案是：柠檬酸钠.2H2O：2.0g；葡萄糖：3.0g；果糖：3.48g；甘油：5ml；卵黄：20ml；双蒸水100ml；Tris0.01g；青霉素10万单位；链霉素10万单位，pH值在7.0。
本发明提出了除精浆方法及与之相适应的稀释液配方，其理论依据是：精浆中含有许多种对精子品质有重要影响的物质，有些是有利的成份，有些是不利的成份。其中不利的成份严重影响着冷冻精液的质量。特别是精浆中存在着许多抗生育因子，如去获能因子(DF)、人类抗生育因子，顶体稳定因子，牛精浆素，山羊卵黄凝结酶等。它们通过抑制精子获能、限制顶体反应的发生，还可能通过破坏精子膜结构而诱导顶体酶的释放。所以我们利用除精浆的方法来除去精浆中对精子品质不利的成份。除精浆的方法有几种，又以离心洗涤法成本低，操作简单而较适合生产中应用，本发明经过大量的试验研究提出了有效的冷冻精液除精浆的方法，就是中速短时两次离心洗涤法(800-1000转/分，5-8分钟/次，离心2次)。
除精浆去除不利于精子存活物质的同时，也去除了部分有利于精子存活的成分，包括提供精子营养和维持精子酸碱度的物质，所以采用除精浆方法时要对常规稀释液配方进行调整改进，以最大程度满足精子存活的环境条件。诸多研究证实稍高渗透压的环境有利于精液冷冻保存，因为高渗透环境会造成精子的部分脱水，可降低精子在冷冻时受到的损伤程度，所以用作除精浆冷冻精液的稀释液要适当提高渗透压，同时调整pH值近中性，使精子处于能维持正常代谢和活动的适宜的pH值范围。同时牛羊精液中果糖含量高，除精浆时的稀释液中就要适当增加果糖的含量，以满足精子的营养需要，另外糖也属于一种膜稳定剂，糖的含量高对精子细胞膜的保护性好，从而可以减少冷冻对精子膜的破坏。因此，我们调整了稀释液中柠檬酸钠和葡萄糖的量，又把常规的添加脱脂乳改为果糖，使新配方更加有效地降低精子在冷冻时受到的损伤。
与现有技术相比，本发明的优点是：
一、除精浆方面：改变了常规的低速长时一次离心洗涤法(250-500转/分，15-25分钟/次，离心1次)，采用中速短时两次离心洗涤法(800-1000转/分，5-8分钟/次，离心2次)，大大降低了离心对精子造成的机械损伤。
二、稀释液配方：研制出与本除精浆方法相适应的冷冻精液的稀释液配方，改变通常稀释液中柠檬酸钠和葡萄糖的量，又把常规的添加脱脂乳改为果糖，使新配方更加有效地提供精子的营养需要和降低精子在冷冻时受到的损伤。
三、在提高品质的前提下，所用时间缩短，因此降低了精子的机械损伤率，提高了精子活力和顶体完整率16％以上。
四、受精率方面：以穿卵试验表明，采用本发明处理后获得的冷冻精子，其穿卵率由一般的70.4±7.8％增加到85.1±6.2％，存在显著差异。
本方法利用改进的除精浆方法去除了精液中的某些抑制获能成分，同时除去了精浆中的许多对精子品质不利的物质，降低了精子的受损程度。通过去除精浆在一定程度上减少了稳定精子膜的成分，解除了抑制精子获能的因子，从而使体外培养的精子能在较短的时间内实现获能，这在提高精子获能效率的同时，也缩短了精子在体外环境停留的时间，进而减少了精子在体外环境中受到的不利影响，使精子的活力和受精力都有所增加。配合改进的稀释液更加提高了精子的品质，达到了有效提高精子受精率的效果。解冻后精子的穿卵率由一般的70.4±7.8％增加到85.1±6.2％，存在显著差异。通过对解冻后精子超激活运动的观察和超微结构变化也都证实了这一结果。
具体实施方式：
下面以波尔山羊为对象，通过实施例对本发明做详细描述。
一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法，包括：(一)用生理盐水以1∶3～4的比例在30℃等温稀释，以1000转/分离心5分钟，一次去除精浆，再用生理盐水调整到第一次稀释的量，再以1000转/分离心5分钟，二次去除精浆；(二)用冷冻精液稀释液调整至原精液量，再用该稀释液以1∶3～4的比例在30℃等温稀释；(三)套上棉纱套放在4℃降温，半小时后用等温的稀释液加7％甘油进行二次稀释；(四)平衡2小时，然后把平衡的精液置低温操作柜中用一体机分装成0.25ml细管，采用程控式冷冻仪冷冻并入氮保存。
实施例1：上述步骤(一)中，用生理盐水以1∶3的比例在30℃等温稀释，以1000转/分离心5分钟，一次去除精浆，再用生理盐水调整到第一次稀释的量，再以1000转/分离心5分钟，二次去除精浆。
采用的精液冷冻保存的稀释液配方为：柠檬酸钠.2H2O：1.8g；葡萄糖：3.2g；果糖：3.3g；甘油：7ml；卵黄：20ml；双蒸水100ml；Tris0.01g；青霉素10万单位；链霉素10万单位，pH值在6.9。
实施例2：用生理盐水以1∶3.5的比例在30℃等温稀释，以1000转/分离心5分钟，去除精浆，再用生理盐水调整到第一次稀释的量，再以1000转/分离心5分钟，去除精浆。
采用的精液冷冻保存的稀释液配方为：柠檬酸钠.2H2O：2.2g；葡萄糖：2.8g；果糖：3.1g；甘油：7ml；卵黄：20ml；双蒸水100ml；Tris0.01g；青霉素10万单位；链霉素10万单位，pH值在7.1。
实施例3：用生理盐水以1∶4的比例在30℃等温稀释，以1000转/分离心5分钟，去除精浆，再用生理盐水调整到第一次稀释的量，再以1000转/分离心5分钟，去除精浆。
采用的精液冷冻保存的稀释液配方为：柠檬酸钠.2H2O：2.0g；葡萄糖：3.0g；果糖：3.48g；甘油：5ml；卵黄：20ml；双蒸水100ml；Tris0.01g；青霉素10万单位；链霉素10万单位，pH值在7.0。
上述实施例中以实施例3为最佳实施例。
其中步骤(一)的操作中要注意：1.离心条件要适宜(包括转速、时间、次数)，离心时要保证精液的温度适宜，操作要快要稳，以减少精子受机械损伤。上面所说的以1000转/分离心2次，每次5分钟是大量实验后最终选定的。
采用除精浆技术配合改进的冷冻精液稀释液制作的冻精其品质有极显著的提高，精子的体外获能时间明显缩短，获能效果也有极显著提高，在很大程度上增加了精子的体外受精率。我们认为如果把本发明的除精浆方法及其稀释液应用到冷冻精液体外受精研究中，会给这一技术带来新的突破。

Claims (4)

1、一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法，其特征在于：在精液冷冻保存中采用除精浆步骤，该步骤为中速短时两次稀释离心法。
2、如权利要求1所述的一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法，其特征在于：所述除精浆步骤具体是先用生理盐水以1∶3～4的比例在30℃等温稀释，以1000转/分离心5分钟，一次去除精浆；再用生理盐水调整到第一次稀释的量，再以1000转/分离心5分钟，二次去除精浆。
3、如权利要求1所述的一种提高牛羊冷冻精液受精率的方法中使用的稀释液，其特征在于：内含柠檬酸钠.2H2O：1.8～2.2g；葡萄糖：2.8～3.2g；果糖：3.1～3.5g；甘油：5～7.0ml；卵黄：18～24ml；双蒸水100ml；Tris0.01g；青霉素10万单位；链霉素10万单位；PH值在6.8～7.2。
4、如权利要求3所述的稀释液，其特征在于：内含柠檬酸钠.2H2O：2.0g；葡萄糖：3.0g；果糖：3.48g；甘油：5ml；卵黄：20ml；双蒸水100ml；Tris0.01g；青霉素10万单位；链霉素10万单位，pH值在7.0。
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