CN103651333B - 一种马属动物冷冻精液稀释液及其配制方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种马属动物冷冻精液稀释液及其配制方法，其中，稀释液至少包括以下原料制成的基础液：D-乳糖单水合物、前列腺素、EDTA、蜂花粉水溶液、透明质酸和鲨烷。稀释液还包括卵黄液和甘油，以及青霉素和链霉素。配制方法包括以下步骤：（1）配制蜂花粉水溶液；（2）配制基础液；（3）加入卵黄液、甘油、青霉素和/或链霉素。本发明技术方案带来的有益效果是：本发明创造性的将蜂花粉、透明质酸和鲨烷等组合后用于马属动物冷冻精液稀释液的配制，最大限度的阻止了精液冷冻过程中大冰晶的形成，避免了冰晶化对精子的损伤，显著的提高了精子冻存的存活率和顶体完整率，进一步改善了精子冷冻后的品质、提高了精子细胞的耐冻性。

Description

一种马属动物冷冻精液稀释液及其配制方法

技术领域

本发明涉及动物冷冻精液生产的技术领域，特别涉及一种马属动物冷冻精液稀释液及其配制方法。

背景技术

目前，我国马属动物的繁育主要以自然交配和人工辅助两种方式进行，但是在自然交配或人工辅助交配的情况下，一般一匹种公马只能配20-30匹母马，优秀种公马的利用率严重受限。因此，精液稀释、保存和人工授精技术的发展和应用就显得非常重要。

近年来，家畜精液稀释液的研究不断取得可喜的成果，尤其是在牛、羊等反刍动物方面。马属动物精液稀释液的研究也日渐成效，但是仍然存在诸多弊端，主要表现在精液稀释液对精子活力的保存时间短，比如常温保存时间不足24小时（活率低于0.3），低温保存时间不足96小时（活率低于0.3）；受胎率低等。

精液冷冻技术对现代畜牧业的发展有着十分重要的意义。随着现代马术运动的迅猛发展，冻精在马匹繁育工作中也发挥着越来越重要的作用。因此如何进一步改善精子冷冻后的品质、提高精子细胞的耐冻性，仍是一个值得探讨的问题。

发明内容

为了进一步改善精子冷冻后的品质、提高精子细胞的耐冻性，本发明实施例提供了一种马属动物冷冻精液稀释液及其配制方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种马属动物冷冻精液稀释液，其中，所述稀释液至少包括以下原料制成的基础液：D-乳糖单水合物、前列腺素、EDTA、蜂花粉水溶液、透明质酸和鲨烷。

其中，每100ml所述基础液中包括以下含量的原料：D-乳糖单水合物0.2~0.8g，前列腺素20~100μg，EDTA 0.1~0.3g，蜂花粉水溶液10~90ml，透明质酸0.5~1.5 g，鲨烷0.1~ 0.8ml。

其中，所述稀释液还进一步包括卵黄液和甘油，所述卵黄液的体积分数为2.5%~7.5%，所述甘油的体积分数为2.5%~7.5%。

其中，所述稀释液还进一步包括青霉素和链霉素，所述青霉素的量为1000单位/ml，所述链霉素的量为1000μg/ml。

其中，所述蜂花粉水溶液的配制方法为：将10~30g蜂花粉，用液氮浸泡3-10分钟，过滤取出，加入35~200ml（优选为40~150ml）双蒸水，超声处理10~30分钟，离心5~20分钟取上清，所得上清液过5000D分子筛即得所述蜂花粉水溶液。

其中，所述超声的频率为15~25kHz；所述离心的转速为600~1200g/min。

为了更好的实现上述发明目的，本发明又进一步提供了上述马属动物冷冻精液稀释液的配制方法，其中，所述配制方法包括以下步骤：

（1）将10~30g蜂花粉，用液氮浸泡3-10分钟，过滤取出，加入35~200ml（优选为40~150ml）双蒸水，超声处理10~30分钟，离心5~20分钟取上清，所得上清液过5000D分子筛即得所述蜂花粉水溶液；

（2）按所述含量量取D-乳糖单水合物、前列腺素、EDTA、透明质酸和鲨烷放入无菌烧杯中，按所述含量加入所述步骤（1）的所述蜂花粉水溶液，加入双蒸水进行溶解、定容，调PH值至6.0~7.2之间并用0.22微米滤器过滤除菌即得所述基础液。

其中，所述配制方法还包括以下步骤：

（3）在所述基础液中，加入卵黄液、甘油、青霉素和链霉素中的任意一种、两种、三种或四种，即得所述稀释液；所述基础液占所述稀释液的体积比为85%-100%、所述卵黄液占所述稀释液的体积比为2.5~7.5%、所述甘油占所述稀释液的体积比为2.5~7.5%、所述青霉素的添加量为1000单位/ml和/或所述链霉素的添加量为1000μg/ml。

其中，所述步骤（1）中，所述超声的频率为15~25kHz；所述离心的转速为600~1200g/min。

其中，所述步骤（2）中，调节PH值时，按照常规PH调节方法：使用7.5%的碳酸氢钠和1mol/L的盐酸进行PH值的调节即可。

其中，所述步骤（3）中，所述基础液占所述稀释液的体积比为90%-95%。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明创造性的将蜂花粉、透明质酸和鲨烷等组合后用于马属动物冷冻精液稀释液的配制，最大限度的阻止了精液冷冻过程中大冰晶的形成，避免了冰晶化对精子的损伤，显著的提高了精子冻存的存活率和顶体完整率，进一步改善了精子冷冻后的品质、提高了精子细胞的耐冻性。

花粉是有花植物雄蕊中的雄性生殖细胞，它不仅携带着生命的遗传信息而且包含着孕育新生命所必需的全部营养物质，是植物传宗接代的根本热能的源泉。蜂花粉来源于大自然，是蜜蜂从显花植物（蜜源植物和花粉源植物）花蕊内采集的花粉粒，并加入了特殊的腺体分泌物(花蜜和唾液)混合而成。蜂花粉的主要成分有：蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素、活性酶、黄酮类化合物、脂类、核酸、芸苔素、植酸等。

研究表明精子的冷休克可能与精子膜脂类双分子层的组成有关，磷脂的脂肪酸组成和含量决定精子质膜的稳定性，同时胆固醇含量也是影响膜流动性的重要因素。大部分哺乳动物所含不饱和脂肪酸占全部脂肪酸的60%以上，由于这种特有的脂质成分排列成双层结构，赋予脂膜更强的流动性，使精子质膜能更好的抵御冰晶化的伤害。精子质膜作为一种动态膜，在冷冻过程中亦要不断与胞外进行物质交换以维持精子细胞内外平衡。蜂花粉富含大量的蛋白质、40%的糖类、多种不饱和脂肪酸以及十余种呈游离状态的氨基酸。精子能聚集多种天然氧化剂参与脂类的代谢，这在一定程度上可能增加了精子中多聚不饱和脂肪酸的含量，改变了精子细胞膜中磷脂和胆固醇的比例，赋予脂膜更强的流动性。糖类的羟基可能与精子膜磷脂的磷酸根结合，置换细胞周围的水分子，能有效阻碍冷冻过程中大冰晶的形成，避免了冰晶化对精子的损伤。此外精子冷冻过程伴随着脂类过氧化反应，冷冻处理过程中发生的脂类物质氧化损伤程度与精子冷冻效果有密切关系。精子在冷冻过程中产生大量活性氧（ROS），能破坏精子的细胞骨架，使细胞内DNA流失，最终导致精子的受精能力降低。蜂花粉作为一种天然维生素的浓缩物，包括丰富的B族维生素和维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等。此外蜂花粉还含有铁、锌、钙、镁、钾等十多种无机盐和硒、锰等三十多种微量元素及超氧化歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等18种酶类，还含有核酸及某些延缓衰老的激素、生长素、抗菌素等。维生素类能显著改善精子活率，而维生素E和硒等成分是一种强抗氧化剂，能抑制脂类的过氧化反应，延长细胞膜的生命；锰能激活超氧化歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等多种酶类，在抑制脂质反应，减轻氧自由基对精子细胞的损伤等方面起到重要作用。

透明质酸，又名玻璃酸，是一种酸性粘多糖。它是细胞保持水分的重要基础物质，具有特殊的保水作用，份量更高达其本身重量的100倍，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。它可以改善细胞营养代谢，维持细胞活力。

鲨烷是一种无色透明油状液体，无毒无味，其凝固点低，稳定性高，在-55℃仍能保持流动状态，这种特性使其能有效阻碍精液冷冻过程中大冰晶的形成，避免了冰晶化对精子的损伤。

具体实施方式

实施例1：

一种马属动物冷冻精液稀释液，稀释液包括基础液，每100ml基础液中包括以下含量的原料：D-乳糖单水合物0.3g，前列腺素40μg，EDTA 0.15g，蜂花粉水溶液30ml，透明质酸0.8 g，鲨烷0.5ml，余量为双蒸水；

稀释液中还包括体积比为7.5%的卵黄液、体积比为2.5%的甘油、1000单位/ml的青霉素和1000μg/ml的链霉素。

其配制方法包括以下步骤：

（1）将20g蜂花粉，用液氮浸泡5分钟，过滤取出，加入60ml双蒸水，20kHz超声处理20分钟，800g/min离心10分钟取上清，所得上清液过5000D分子筛得蜂花粉水溶液；

（2）将D-乳糖单水合物0.3g，前列腺素40μg，EDTA 0.15g，透明质酸0.8 g，鲨烷0.5ml，加适量双蒸水溶解后，向所得溶液中加步骤（1）的蜂花粉水溶液30ml，用双蒸水进行定容至100ml，使用7.5%的碳酸氢钠和1mol/L的盐酸调PH值至6.8并用0.22微米滤器过滤除菌即得基础液；

（3）在基础液中，加入卵黄液、甘油、青霉素和链霉素，即得稀释液；基础液占稀释液的体积比为90%、卵黄液占稀释液的体积比为7.5%、甘油占稀释液的体积比为2.5%、青霉素的添加量为1000单位/ml和链霉素的添加量为1000μg/ml。

实施例2：

一种马属动物冷冻精液稀释液，稀释液包括基础液，每100ml基础液中包括以下含量的原料：D-乳糖单水合物0.5g，前列腺素70μg，EDTA 0.25g，蜂花粉水溶液60ml，透明质酸1.1 g，鲨烷0.7ml，余量为双蒸水；

稀释液中还包括体积比为5%的卵黄液、体积比为3%的甘油、1000单位/ml的青霉素和1000μg/ml的链霉素。

其配制方法包括以下步骤：

（1）将30g蜂花粉，用液氮浸泡8分钟，过滤取出，加入120ml双蒸水，25kHz超声处理25分钟，1000g/min离心15分钟取上清，所得上清液过5000D分子筛得蜂花粉水溶液；

（2）将D-乳糖单水合物0.5g，前列腺素70μg，EDTA 0.25g，透明质酸1.1 g，鲨烷0.7ml，加适量双蒸水溶解后，向所得溶液中加步骤（1）的蜂花粉水溶液60ml，用双蒸水进行定容至100ml，使用7.5%的碳酸氢钠和1mol/L的盐酸调PH值至6.5并用0.22微米滤器过滤除菌即得基础液；

（3）在基础液中，加入卵黄液、甘油、青霉素和链霉素，即得稀释液；基础液占稀释液的体积比为92%、卵黄液占稀释液的体积比为5%、甘油占稀释液的体积比为3%、青霉素的添加量为1000单位/ml和链霉素的添加量为1000μg/ml。

对比试验：

使用传统的稀释液乳糖-卵黄-甘油稀释液（对照组1）、乳糖-EDTA-柠檬酸钠-卵黄-甘油稀释液（对照组2）和蔗糖-卵黄-甘油稀释液（对照组3），与实施例1的稀释液（实施例组1）和实施例2的稀释液（实施例组2）分别冷冻保存马的精液。按常规方法进行精液的冷冻及解冻，观察解冻后精子活力及顶体完整率，结果如表1所示。

表1 不同配方冷冻精液稀释液对冻融后精子品质的影响（平均数±标准差）

由表1的数据可知，在冷冻保存的条件下，与传统精液稀释液相比，利用本发明的马属动物精液稀释液保存的精子活率及顶体完整率明显较高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种马属动物冷冻精液稀释液，其特征在于，所述稀释液至少包括以下原料制成的基础液：D-乳糖单水合物、前列腺素、EDTA、蜂花粉水溶液、透明质酸和鲨烷；每100ml所述基础液中包括以下含量的原料：D-乳糖单水合物0.2~0.8g，前列腺素20~100μg，EDTA 0.1~0.3g，蜂花粉水溶液10~90ml，透明质酸0.5~1.5 g，鲨烷0.1~ 0.8ml；

所述蜂花粉水溶液的配制方法为：将10~30g蜂花粉，用液氮浸泡3-10分钟，过滤取出，加入35~200ml双蒸水，超声处理10~30分钟，离心5~20分钟取上清，所得上清液过5000D分子筛即得所述蜂花粉水溶液；

所述超声的频率为15~25kHz；所述离心的转速为600~1200r/min。

2.根据权利要求1所述的稀释液，其特征在于，所述稀释液还进一步包括卵黄液和甘油，所述卵黄液的体积分数为2.5%~7.5%，所述甘油的体积分数为2.5%~7.5%。

3.根据权利要求1或2任意一项所述的稀释液，其特征在于，所述稀释液还进一步包括青霉素和链霉素，所述青霉素的量为1000单位/ml，所述链霉素的量为1000μg/ml。

4.一种权利要求1所述的马属动物冷冻精液稀释液的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括以下步骤：

（1）将10~30g蜂花粉，用液氮浸泡3-10分钟，过滤取出，加入35~200ml双蒸水，超声处理10~30分钟，离心5~20分钟取上清，所得上清液过5000D分子筛得所述蜂花粉水溶液；

（2）按所述含量量取D-乳糖单水合物、前列腺素、EDTA、透明质酸和鲨烷放入无菌烧杯中，按所述含量加入所述步骤（1）的所述蜂花粉水溶液，加入双蒸水进行溶解、定容，调PH值至6.0~7.2之间并用0.22微米滤器过滤除菌即得所述基础液。

5.根据权利要求4所述的配制方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述超声的频率为15~25kHz；所述离心的转速为600~1200r/min。

6.根据权利要求4或5所述的配制方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述基础液占所述稀释液的体积比为90%-95%。

7.一种权利要求2或3所述的马属动物冷冻精液稀释液的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括以下步骤：

（1）将10~30g蜂花粉，用液氮浸泡3-10分钟，过滤取出，加入35~200ml双蒸水，超声处理10~30分钟，离心5~20分钟取上清，所得上清液过5000D分子筛得所述蜂花粉水溶液；

（2）按所述含量量取D-乳糖单水合物、前列腺素、EDTA、透明质酸和鲨烷放入无菌烧杯中，按所述含量加入所述步骤（1）的所述蜂花粉水溶液，加入双蒸水进行溶解、定容，调PH值至6.0~7.2之间并用0.22微米滤器过滤除菌即得所述基础液；

（3）在所述基础液中，加入卵黄液、甘油、青霉素和链霉素中的任意一种、两种、三种或四种，即得所述稀释液；所述基础液占所述稀释液的体积比为85%-100%、所述卵黄液占所述稀释液的体积比为2.5~7.5%、所述甘油占所述稀释液的体积比为2.5~7.5%、所述青霉素的添加量为1000单位/ml和/或所述链霉素的添加量为1000μg/ml。

8.根据权利要求7所述的配制方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述超声的频率为15~25kHz；所述离心的转速为600~1200r/min。

9.根据权利要求7或8所述的配制方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述基础液占所述稀释液的体积比为90%-95%。