CN103651330A - 具有生物活性的动物精液保存剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种动物精液保存液及其制备方法，其中含有寡聚原花青素，起抗氧化作用，可延长精液的保存时间，保持动物精子活力。是由1000mL的普通介质和16mg寡聚原花青素混合而成，所述普通介质是由6份葡萄糖、0.37份EDTA、0.375份二水柠檬酸钠、0-0.12份碳酸氢钠、0.1份新霉素和100份蒸馏水混合而成，新霉素在精液稀释前单独添加。配方中含有寡聚原花青素，起抗氧化作用，可延长精液的保存时间，寡聚原花青素能缓减精液样本的降解，且对精子活力没有负作用，保持动物精子活力，特别是对低温保藏的精子存活率有明显的提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有生物活性的动物精液保存剂及其制备方法。
背景技术
人工授精(Artificial insemination，AI)技术与体外受精和胚胎移植技术一起极大地提高了动物的繁殖效率。与自然交配相比，以上技术具有许多优势。就家畜育种而言，以上技术能更快更广地将我们所期望的遗传特征进行传播。一头公畜的精液可以为多头母畜授精，人工授精所需的公畜仅为自然交配所需公畜数的四分之一，因而可以节省饲养成本。并且，通过人工授精可以更好地对整个种群进行控制，提高繁殖效率，便于大规模生产。
人工授精和体外受精技术的关键是维持繁殖细胞的活力。人工授精所用的精液，其处理过程因动物品种不同而异。例如，牛的精液需要较低的精子密度，精子密度适当的精液可在吸管中迅速冷冻，在贮存较长时间后也不会对精子活力产生不利影响。相反，猪的精液就不适合上述方法。猪的精液体积大，精子数量多，因而在给母猪授精前需要对精液进行稀释。使用冷冻精液对母猪进行人工授精的效果并不理想。公猪的精液在运输前需要用适当的保存液进行稀释，并冷却到约17℃。这种保存液的作用是增加精液的体积，并为精子细胞提供营养物质。精液在贮存几天后，精子活力也会显著降低。
目前，最好的具有生物活性的动物精液保存剂可以维持公猪的精子活力约3-7天。这么短的保存时间为猪的人工授精带来不少限制。有许多商品化的具有生物活性的动物精液保存剂，包括短期、中期和长期保存剂。保存剂以固体形式出售，用水稀释后使用。
各种动物的具有生物活性的动物精液保存剂中都含有适合该种动物的缓冲盐、能量物质和抗生素。典型的保存剂中至少含有一种缓冲盐(如碳酸氢钠或HEPES)和一种碳源(如葡萄糖)。另外还可能含有乙二胺四乙酸(EDTA)、牛血清蛋白，及一种或多种抗生素。在实际使用过程中，使用者需要配制出适合相应动物的保存剂。保存剂的pH值通常在6.5-7.5，6.8-7.2较为适合。细胞中蛋白质、DNA和RNA的交联导致有机生命体衰老。这种交联是自由基引起的，已经证实自由基引起生命大分子交联是导致衰老的主要原因之一。自由基是氧的不稳定存在形式，在机体正常代谢过程也会产生。化学物质、环境污染物、阳光、辐射、药物、酒精、病毒、细菌和寄生虫也会诱导机体产生大量的自由基。当机体内的自由基氧化过度时，就会损坏细胞膜和细胞组件，如胶原蛋白和弹性蛋白。
寡聚原花青素(Oligomeric Proanthocyanidins，0PCs)是从葡萄籽、葡萄皮和松树皮中提取的抗氧化物质，是一组生物黄酮类分子组成的复合物，在机体内作为自由基清除剂。0PCs的抗氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，是迄今为止发现的最好的天然抗氧化剂之一。此外，它还有防癌抗癌，防治心血管疾病，抗辐射，调节免疫力，改善人体微循环及保护皮肤等多种作用，是欧洲等国最受欢迎的植物药之一。0PCs是含双黄酮衍生物的天然多酚类化合物的总称，是由不同数量的儿茶素(Catechin)、表儿茶素(Epicatechin，EC)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin，EGC)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechin gallate，ECG)和表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)等经C4-C6或C4-C8键缩合而成。通常将聚合度较低的二～四聚体称为低聚原花青素或寡聚原花青素(OligomericProanthocyanidins，OPCs)，将五聚体及以上多聚体称为高聚原花青素或多聚原花青素(Polymeric Proanthocyanidins，PPCs)。由于键合位置及构象的不同，原花青素存在多种异构体，这给天然产物中原花青素纯组分的分离及分析带来了相当的难度。在二聚体中，已分离鉴定的就有8种结构形式，分别命名为B1～B8等等。三聚体中，也因参与构成组分的单体及其相连接碳原子位置的不同形成各种结构，并分别被命名为Cn(n＝1，2..)。在自然界中，一般二聚体分布较广，研究得也较多。绿茶中含有丰富的EGCG，含量高于松树皮和葡萄籽。葡萄籽中EGCG的含量约占总OPCs含量的15％，而绿茶中EGCG的含量约占总OPCs的50％。
各种动物的具有生物活性的动物精液保存剂中都含有适合该种动物的缓冲盐、能量物质和抗生素。典型的保存剂中至少含有一种缓冲盐(如碳酸氢钠或HEPES)和一种碳源(如葡萄糖)。另外还可能含有乙二胺四乙酸(EDTA)、牛血清蛋白，及一种或多种抗生素。但是目前的保存剂中却缺少防止精液免于自由基氧化而使活性降低的抗氧化剂成份。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种动物精液保存液及其制备方法，其中含有寡聚原花青素，起抗氧化作用，可延长精液的保存时间，保持动物精子活力。
一种具有生物活性的动物精液保存剂，是由1000mL的普通介质和16mg寡聚原花青素混合而成，所述普通介质是由6份葡萄糖、0.37份EDTA、0.375份二水柠檬酸钠、0-0.12份碳酸氢钠、0.1份新霉素和100份蒸馏水混合而成，新霉素在精液稀释前单独添加。
进一步的，所述的寡聚原花青素包括白花色苷和花青苷。
进一步的，所述的寡聚原花青素可来源于松树皮、葡萄籽、葡萄皮、越桔、酸果蔓、绿茶和红茶。
一种具有生物活性的动物精液保存剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备两种粉状介质，这两种粉状介质中至少有一种介质含有至少一种寡聚原花青素；
S2.将两种粉状介质混合在一起；
S3.将两种粉状介质的混合物用纯水稀释成溶液；
S4.将猪精液样本加入到溶液中，最好是采集后立即加入；
S5.使精液样本与溶液的渗透压相平衡，然后分成一定的体积保存，其中OPCs可缓减精液的降解，并对精子活力无负面影响，另外保存液的pH值低于7.5，渗透压约低于350m0sm。
进一步的，上述粉状介质中可至少含有两种、三种或四种寡聚原花青素。
与现有技术相比本发明的有益效果为：由于本发明提供一种动物精液保存液的配方中含有寡聚原花青素，起抗氧化作用，可延长精液的保存时间，寡聚原花青素能缓减精液样本的降解，且对精子活力没有负作用，保持动物精子活力，特别是对低温保藏的精子存活率有明显的提高。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
一种具有生物活性的动物精液保存剂，是由1000mL的普通介质和16mg寡聚原花青素混合而成，所述普通介质是由6g葡萄糖、0.37gEDTA、0.375g二水柠檬酸钠、0.12g碳酸氢钠、0.1g新霉素和100ml蒸馏水混合而成，新霉素在精液稀释前单独添加。
进一步的，所述的寡聚原花青素包括白花色苷和花青苷。
进一步的，所述的寡聚原花青素可来源于松树皮、葡萄籽、葡萄皮、越桔、酸果蔓、绿茶和红茶。
一种具有生物活性的动物精液保存剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备两种粉状介质，这两种粉状介质中至少有一种介质含有至少一种寡聚原花青素；
S2.将两种粉状介质混合在一起；
S3.将两种粉状介质的混合物用纯水稀释成溶液；
S4.将猪精液样本加入到溶液中，最好是采集后立即加入；
S5.使精液样本与溶液的渗透压相平衡，然后分成一定的体积保存，其中OPCs可缓减精液的降解，并对精子活力无负面影响，另外保存液的pH值低于7.5，渗透压约低于350m0sm。
进一步的，上述粉状介质中可至少含有两种、三种或四种寡聚原花青素。
本发明的制备过程如下：
1.试剂准备：在采集精液前，首先配制具有生物活性的动物精液保存剂的相关组分。
贝兹维尔解冻液(BTS)溶液的配制按生产商说明书进行配制。然后再根据后续处理需要加足量的其它组分。取以上溶液75mL注入100mL的用于保存精液的塑料管中。
2.精液的收集、处理和贮存：随机选择性成熟的公猪进行人工采精。每次采集精液后，用光度计(546nm滤光器)检测精液中精子的浓度。至少数10组精子的数量，然后评定这10组精子中活动精子的百分数。将每头公猪的精液分成体积相等的若干份，每份含活动精子数1*109，在36±0.1℃的温度下将上述分成等份的精液分别加入75mL精液保存液中，使得每个塑料管中的活精子浓度为4*107。精液分散到保存液中后，测定每个塑料管中的可活动精子数(精子活力)。
3.样品的保存和数据的收集：将精液样本贮存在35℃的条件下。并周期性在轻轻将塑料管中的精液混匀。在贮存的第0、1和2天，将样本轻轻混匀后取出5mL进行检测精子活力。将载玻片预热至37℃，于精子活力检测时使用。通过检测高代谢率、高自由基产量条件下精液中的精子活力来评定OPCs的作用效果，所得结果与不含OPCs的精液保存液中的精子活力相比较，以判定OPCs的作用效果。
将贝兹维尔解冻液(BTS)与葡萄籽提取物混合形成具有生物活性的动物精液保存剂，且使保存剂中葡萄籽提取物的浓度为8mg/L、16mg/L或25mg/L。在贮存的第1天和第2天检测精子活力，贮存温度为37℃。结果总结于表1。对于公猪B，在高代谢率、高自由基产量条件下，经OPCs处理后的精子活力更高。
表1
实施例2
将贝兹维尔解冻液(BTS)与葡萄籽提取物混合形成具有生物活性的动物精液保存剂，且使保存剂中葡萄籽提取物的浓度为0mg/L(对照)、60mg/L、130mg/L或250mg/L。在贮存的第0、7、15、19、28和37小时检测精子活力，贮存温度为37℃。将不同时间的精子活力合并后得平均精子活力数，结果总结于表2。在高代谢率、高自由基产量条件下，经OPCs处理后的精子活力更高。
表2
实例3
用Westendorf介质(11％乳糖、25％蛋黄)作为低温保藏保护剂，并选择葡萄籽提取物的最适浓度16mg/L。将采集的新鲜精液等分到保护剂中并离心。然后将精液在添加或不添加OPCs的条件下低温保藏。在液氮中低温保藏后，于50℃解冻15s，然后评定精子活力。所得结果列于表3，结果说明经OPCs处理后显著提高了低温保藏后精子的存活率和细胞膜的完整性。
表3
| 处理 | 样本数 | 解冻后存活率，％ | 标准误 | 顶体正常数，％ | 标准误 |
| 对照 | 116 | 76.0 | 2.2 | 76.0 | 2.2 |
| OPC16mg/L | 116 | 88.0 | 2.2 | 87.7 | 2.2 |
本发明中的具有生物活性的动物精液保存剂还适用于保存各种动物的卵细胞和胚胎，包括猪、牛、羊等。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种具有生物活性的动物精液保存剂，其特征在于：是由1000mL的普通介质和16mg寡聚原花青素混合而成，所述普通介质是由6份葡萄糖、0.37份EDTA、0.375份二水柠檬酸钠、0-0.12份碳酸氢钠、0.1份新霉素和100份蒸馏水混合而成，新霉素在精液稀释前单独添加。
2.根据权利要求1所述的具有生物活性的动物精液保存剂，其特征在于：所述的寡聚原花青素包括白花色苷和花青苷。
3.根据权利要求1或2所述的具有生物活性的动物精液保存剂，其特征在于：所述的寡聚原花青素可来源于松树皮、葡萄籽、葡萄皮、越桔、酸果蔓、绿茶和红茶。
4.一种具有生物活性的动物精液保存剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.制备两种粉状介质，这两种粉状介质中至少有一种介质含有至少一种寡聚原花青素；
S2.将两种粉状介质混合在一起；
S3.将两种粉状介质的混合物用纯水稀释成溶液；
S4.将猪精液样本加入到溶液中，最好是采集后立即加入；
S5.使精液样本与溶液的渗透压相平衡，然后分成一定的体积保存，其中OPCs可缓减精液的降解，并对精子活力无负面影响，另外保存液的pH值低于7.5，渗透压约低于350m0sm。
5.根据权利要求4所的具有生物活性的动物精液保存剂的制备方法，其特征在于：所述粉状介质中可至少含有两种、三种或四种寡聚原花青素。
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