CN112514891B - 一种大熊猫乳汁冻存液及大熊猫乳汁的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大熊猫乳汁冻存液，所述冻存液的基础液是乳汁细胞培养液Low‑Glucose DMEM，并含有如下浓度的成分：天然蜂蜜1.4M，海藻糖0.7M，果糖5mM，白藜芦醇100μM。本发明还提供了一种大熊猫乳汁的保存方法。本申请中，将乳汁营养成分和细胞分开保存，在使用时将两者分别解冻并按比例混匀，能够满足大熊猫幼仔的哺乳需求。本申请为了保证大熊猫乳汁细胞的活性，采用了特殊的冷冻保护剂。通过本发明的新型细胞冻存液，细胞解冻后活力为90.27％，完全满足上述实际生产需求。

Description

一种大熊猫乳汁冻存液及大熊猫乳汁的保存方法

技术领域

本发明涉及一种冻存液及动物乳汁的保存方法，具体涉及一种大熊猫乳汁冻存液及大熊猫乳汁的保存方法。

背景技术

大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)为我国特有的珍稀动物，亦是世界自然保护的旗舰物种。提高大熊猫繁殖与育幼成功率一直是圈养大熊猫保护工作的重点，也是研究的难点。大熊猫幼仔均为早产出生，其后期发育完全依赖于母乳喂养，所以母乳质量的好坏是决定幼仔能否健康存活的关键因素。大熊猫母乳成分复杂多样，生物学功能较多，不仅为幼仔的生长发育提供营养物质还具有免疫保护功能。之前的一些研究曾对圈养大熊猫母乳中的部分概略养分、乳糖、维生素、矿物元素、乳蛋白、酶活力与激素、免疫球蛋白、氨基酸、差异表达的乳清蛋白等非细胞成分及含量进行了分析测定，但除此之外，最新的研究发现，大熊猫乳汁中含有不同类型的细胞成分，对幼仔的发育有重要作用。大熊猫会有较大的概率生产双胞胎，但其产后泌乳量难以满足2仔的快速生长发育需要，多数母兽只能养好1仔，个别母兽甚至1仔也不喂养，这种情况需要进行人工辅助育幼。如何保存大熊猫乳汁尽可能维持乳汁品质对于人工育幼至关重要。

目前常规的大熊猫乳汁冷冻采用的液氮直投法，即将乳汁装入冻存管中，直接投入液氮中。后续对冻存的乳汁进行系统检测后发现，液氮直投法冻存的乳汁营养成分保存较好，但是乳汁中的细胞损失严重，仅有约6％的冻存活率，显然不利于大熊猫幼仔的健康发育，因此，从实际生产需要出发，急需建立新型大熊猫乳汁冷冻保存方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型冻存液和大熊猫乳汁冷冻保存方法，既能提高细胞冻存活率，又能保证冻后的乳汁安全性，无毒且可供幼仔食用，保证大熊猫幼仔健康发育。

本发明具体是这样实现的：

一种大熊猫乳汁冻存液，所述冻存液的基础液是乳汁细胞培养液Low-GlucoseDMEM，并含有如下浓度的成分：

天然蜂蜜1.4M，海藻糖0.7M，果糖5mM，白藜芦醇100μM。

更进一步的方案是：

所述冻存液经过过滤除菌，并保持冻存液渗透压2100±50mOsm/kg，pH＝7.5。

本发明还提供了一种大熊猫乳汁的保存方法，包括如下步骤：

步骤一、将大熊猫乳汁在630G离心10分钟，收集上清液为乳汁营养成分，装入冻存管内并投入液氮中保存；

步骤二、下层沉淀部分为乳汁细胞成分，用含有5％抗生素的PBS重悬，630G离心10分钟清洗细胞，并重复一次；通过清洗可以消除在人工采集乳汁过程中的细菌污染及一些杂物；

步骤三、按照1×10⁶～10⁷个/mL的标准调整乳汁细胞的数量，然后加入1mL大熊猫乳汁冻存液，轻柔混匀并转移至1.8mL冻存管中，将冻存管放入程序冷冻盒后放置-80℃冰箱中，24小时后转移至液氮中长期保存。

更进一步的方案是：

所述抗生素为青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)溶液。

在使用时，将细胞冻存管和乳汁冻存管取出放入37℃水浴2分钟解冻细胞和乳汁，然后用PBS清洗复苏后的细胞2遍，再将乳汁和细胞混匀后用于喂养大熊猫幼仔。在混匀的时候注意按照实际大熊猫乳汁中细胞的含量和乳汁营养成分的含量比例进行科学配比，从而获得与实际大熊猫乳汁配方比例相似的乳汁。

本申请中，将乳汁营养成分和细胞分开保存，在使用时将两者分别解冻并按比例混匀，即能够满足大熊猫幼仔的哺乳需求。这种分开保存的方式，可以针对大熊猫乳汁的特性，既能够充分保障大熊猫乳汁营养成分，又能够提高细胞的活性，从而有利于大熊猫幼仔的正常生长发育。

本申请为了保证大熊猫乳汁细胞的活性，采用了特殊的冷冻保护剂。本申请的细胞冷冻保护剂既能高效维持细胞活率，又能保证细胞安全无毒性，摒除了细胞冻存常规使用的DMSO和动物血清，消除生物安全隐患。本申请提供的新型细胞冻存液，一个非常重要的特点是采用高浓度的非渗透性冻存保护剂，由于其渗透压的大小较为合理，因此其不能进入细胞内，冷冻时促进细胞内水分外溢细胞发生皱缩，减少细胞内的冰晶形成，增加细胞膜结构的稳定性，缓解冷冻损伤，较渗透性保护剂更加安全，不会对细胞造成毒性损伤。本申请的冻存液中，天然蜂蜜是25种糖类(主要是果糖和葡萄糖)的混合物，约占其干物质的95％。除了糖的主要成分外，蜂蜜中还含有大量其他生物活性物质，如有机酸、酶、抗氧化剂和维生素等。这些独特的成分对活细胞具有多种营养、生物和药理作用，即抗菌(抗病毒、抗菌和抗真菌)、抗氧化和抗毒素、抗炎、抗突变、抗癌和免疫抑制活性。在实际使用过程中，选择无污染的天然蜂蜜即可，对于蜂蜜的种类不作要求。海藻糖是一种典型应激代谢物，能够在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，防止细胞内冰晶形成。它的保护作用既与渗透压等有关，又与细胞膜磷脂和不稳定蛋白的特异性相互作用有关，从而防止细胞因干燥和氧化应激而造成的损伤和变性。果糖是一种单糖，是常用的食品添加剂，能提高细胞过氧化物酶的活性，防止细胞质膜受到脂质过氧化，从而保持细胞膜通透性的稳定，另外还具有一定黏性，能黏附在细胞外围，形成一个微环境，减少冷冻过程中形成的冰晶，从而防止冰晶对细胞质膜完整性的破坏。白藜芦醇是一类重要的、植物来源的非黄酮类多酚化合物，其可以通过酚羟基电子反应清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)，抑制线粒体呼吸链复合酶Ⅲ活性，最终通过减少氧自由基产生和脂质过氧化、调节抗氧化相关酶活性等机制发挥其生理作用。本专利所用的冷冻保护剂对细胞无任何毒害影响，保证乳汁细胞的生物安全性，可直接将冻后复苏的细胞与乳汁混合喂养大熊猫幼仔，促进大熊猫幼仔的健康发育。

本研究通过试验不同保护剂成分和浓度组合，最终摸索到最佳配比，通过本发明的新型细胞冻存液，细胞解冻后活力为90.27％，完全满足上述实际生产需求。且保存时间基本不受限制，可以长期进行保存。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

为了研究出一种合适的大熊猫乳汁冻存液，发明人进行了大量细致的研究。

由于目前常规的10％DMSO+20％血清的方式对于保持细胞活率具有较好的优势，经过发明人的研究发现，其细胞解冻后的活率可以达到96.32％(见分组研究结果表中的分组1)。本申请之所以不采用这种冻存液，是因为其中DMSO具有一定的毒性，在解冻后不能够直接喂养大熊猫，因此不具有实际应用效果。

发明人经过长期大量的研究，采用了多种不同的组合方式，最终进行了多次试验，具体详见分组研究结果表中的分组2-分组17，其中冻存液采用的基础液都是是乳汁细胞培养液Low-Glucose DMEM。

另外，需要说明的是，分组研究结果表中的细胞活率数据，都是按照具体实施例2的步骤处理后获得的数据。在放入液氮中保存后，分别取液氮保存7天的，保存14天的，保存30天的和保存90天的细胞冻存管取出放入37℃水浴2分钟解冻细胞，检测细胞活率，并取平均值得到的。而且研究发现，不同保存天数的细胞活率基本相同，说明能够长期进行保存。细胞活率的检测方法为本领域常规方法，比如可以采用常规的细胞染色的方法等，此处不再赘述。

分组研究结果表

其中，分组17的配方，保存后的细胞活率达到90.27％，远超直接冷冻保存的大熊猫乳汁中仅6％左右的细胞活率。且在细胞活率达到90.27％的情况下，可以有效避免冷冻造成的乳汁有效活性成分的丢失，确保大熊猫幼仔的营养。

通过上述研究，最终认为分组17的配方是最佳的大熊猫乳汁冻存液的配方。也即：冻存液的基础液是乳汁细胞培养液Low-Glucose DMEM，并含有如下浓度的成分：天然蜂蜜1.4M，海藻糖0.7M，果糖5mM，白藜芦醇100μM。

其中，经过研究，分组17的冻存液经过过滤除菌，并保持冻存液渗透压2100±50mOsm/kg，pH＝7.5。

实施例二

本实施例还提供了一种大熊猫乳汁的保存方法，包括如下步骤：

步骤一、将大熊猫乳汁在630G离心10分钟，收集上清液为乳汁营养成分，装入冻存管内并投入液氮中保存；

步骤二、下层沉淀部分为乳汁细胞成分，用含有5％抗生素即青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)溶液的PBS重悬，630G离心10分钟清洗细胞，并重复一次；通过清洗可以消除在人工采集乳汁过程中的细菌污染及一些杂物；

步骤三、按照1×10⁶～10⁷个/mL的标准调整乳汁细胞的数量，然后加入1mL分组17的大熊猫乳汁冻存液，轻柔混匀并转移至1.8mL冻存管中，此时冻存管中乳汁细胞的数量在1×10⁶～10⁷个之前，将冻存管放入程序冷冻盒后放置-80℃冰箱中，24小时后转移至液氮中长期保存。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims (2)

1.一种大熊猫乳汁的保存方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一、将大熊猫乳汁在630G离心10分钟，收集上清液为乳汁营养成分，装入冻存管内并投入液氮中保存；

步骤二、下层沉淀部分为乳汁细胞成分，用含有5％抗生素的PBS重悬，630G离心10分钟清洗细胞，并重复一次；

步骤三、按照1×10⁶～10⁷个/mL的标准调整乳汁细胞的数量，然后加入1mL大熊猫乳汁冻存液，轻柔混匀并转移至1.8mL冻存管中，将冻存管放入程序冷冻盒后放置-80℃冰箱中，24小时后转移至液氮中长期保存；

所述大熊猫乳汁冻存液的基础液是乳汁细胞培养液Low-Glucose DMEM，并含有如下浓度的成分：

天然蜂蜜1.4M，海藻糖0.7M，果糖5mM，白藜芦醇100μM；

大熊猫乳汁冻存液经过过滤除菌，并保持冻存液渗透压2100±50mOsm/kg，pH＝7.5。

2.根据权利要求1所述大熊猫乳汁的保存方法，其特征在于：

所述抗生素为青霉素-链霉素溶液。