CN107372460A - 一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用 - Google Patents

一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用 Download PDF

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    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients

Abstract

本发明涉及一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用，保存液由稀释剂与稀释液组成，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白1‑6g、三羟甲基氨基甲烷5‑6g、半胱氨酸0.1‑0.15g、柠檬酸钠6‑10g、螯合剂2.4‑3g、卵黄0.17‑0.22L、海藻糖0.08‑0.12L、透明质酸钠1‑2g、氯化钾0.5‑1.1g、抗氧化剂0.5‑1mmol、杀菌剂0.1‑0.2g、左旋肉碱0.2‑1g及茶多酚0.5‑2g；应用时，每1mL猪精液中加入3‑5mL保存液，用于猪精液的常温保存。与现有技术相比，本发明中各组分相互配合，对猪精子细胞进行保护，为猪精子提供适宜的生存环境，保证猪精子细胞的正常生理活动，并有效去除多余自由基，提高猪精液的抗氧化应激能力及保存效果，保证了猪精子成活率，进而提高了母猪的配种率及养殖效益。

Description

一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用
技术领域
本发明属于猪精液保存技术领域，涉及一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用。
背景技术
猪肉占我国肉类消费总量的60％以上，猪肉生产状况直接影响人民的生活水平。目前，越来越多的肉猪通过人工授精技术进行繁殖。猪人工授精技术的应用可以减少种公猪的饲养量，降低养殖成本，并提高母猪的受胎率及产仔数，从而提高养猪业的经济效益。随着人工授精技术的广泛应用，猪精液的保存技术也不断发展起来。猪精液保存是指通过降低或抑制猪精子的新陈代谢强度，从而延长猪精子在体外存活的时间。由于猪精子本身的生理特点，导致猪精子冷冻之后存活率低，易导致人工授精后受胎率不高，且冷冻保存操作复杂，成本较高，在实际生产中存在很多问题，限制了该技术在猪精液保存中的应用。
猪精液常温保存的要求低，操作简单，受胎率高，更适合应用在养殖场和基层种公猪改良站。该技术的关键是采用良好的稀释液配方，为猪精子提供丰富的营养物质、维持恒定的渗透压及pH值等，为猪精子细胞创造一个良好的生存环境。现有的猪精液常温保存稀释剂的有效时间较短，猪精液在常温保存过程中产生的多余自由基会使猪精子细胞发生氧化应激，导致猪精子细胞受损，活力下降，甚至死亡，降低了配种率及养殖效益。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种能够提高猪精子细胞存活率的抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂、保存液及应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂，该稀释剂用于配制保存液，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白1-6g、三羟甲基氨基甲烷5-6g、半胱氨酸0.1-0.15g、柠檬酸钠6-10g、螯合剂2.4-3g、卵黄0.17-0.22L、海藻糖0.08-0.12L、透明质酸钠1-2g、氯化钾0.5-1.1g、抗氧化剂0.5-1mmol、杀菌剂0.1-0.2g、左旋肉碱0.2-1g及茶多酚0.5-2g。
作为优选的技术方案，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白2-5g、三羟甲基氨基甲烷5.2-5.8g、半胱氨酸0.11-0.14g、柠檬酸钠7-9g、螯合剂2.5-2.8g、卵黄0.19-0.21L、海藻糖0.09-0.11L、透明质酸钠1.2-1.8g、氯化钾0.7-0.9g、抗氧化剂0.6-0.8mmol、杀菌剂0.12-0.18g、左旋肉碱0.5-0.7g及茶多酚0.8-1.5g。
作为进一步优选的技术方案，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白3g、三羟甲基氨基甲烷5.5g、半胱氨酸0.12g、柠檬酸钠8g、螯合剂2.6g、卵黄0.2L、海藻糖0.1L、透明质酸钠1.5g、氯化钾0.8g、抗氧化剂0.7mmol、杀菌剂0.15g、左旋肉碱0.6g及茶多酚1.2g。
所述的螯合剂为乙二胺四乙酸。
所述的抗氧化剂为褪黑激素。
所述的杀菌剂为恩诺沙星。
一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，该保存液包括所述的稀释剂。
该保存液由稀释剂与稀释液组成。在配制保存液时，先将稀释剂中各组分按其相应含量加入至容器中，最后加入稀释液定容即可。
所述的稀释液包括磷酸缓冲盐溶液或BTS稀释液中的一种。也可选用其它猪精液保存稀释液，作为保存液的基础溶液。
作为优选的技术方案，所述的稀释液为磷酸缓冲盐溶液。磷酸缓冲盐溶液中不含有任何能量物质，仅用于为猪精子细胞提供所需的生存环境。
BTS稀释液为常规的用于猪精液冷冻保存的稀释液，每1000mL BTS稀释液按如下配方配制：葡萄糖37g、柠檬酸钠6g、氯化钾0.75g、碳酸氢钠1.25g、乙二胺四醋酸1.25g、青霉素100000单位，链霉素100mg，去离子水补足至1000mL。
一种抗氧化应激的猪精液常温保存液的应用，每1mL猪精液中加入3-5mL保存液，用于猪精液的常温保存。将猪精液用保存液稀释后，保存在保存液中，保存液能够为猪精液提供生存环境、丰富的营养物质、恒定的渗透压及pH值。
本发明中，稀释剂中各组分的主要作用如下：
牛血清白蛋白(BSA)：是牛血清中的一种球蛋白，包含607个氨基酸残基，主要起维持渗透压作用、pH缓冲作用、载体作用和营养作用。在猪精子细胞的常温保存过程中，牛血清白蛋白能够起到生理和机械保护作用。
三羟甲基氨基甲烷(Tris)：是一种有机化合物，呈弱碱性，用于DNA的稳定和储存。
半胱氨酸(Cys)：具有抗氧化作用，参与细胞的还原过程，保护细胞不受损害。
柠檬酸钠：具有缓冲作用，可作为酸度调节剂，调节猪精液的pH值，同时也是一种稳定剂，能够延长猪精子的保存时间。
乙二胺四乙酸(EDTA)：可以螯合Ca2+，抑制精子获能和顶体反应的发生，从而延长猪精子的保存时间。
卵黄：是一种营养物质，含有丰富的脂肪，包括中性脂肪、卵磷脂、胆固醇等；也含有丰富的钙、磷、铁等矿物质；同时含有丰富的蛋白质，而且是高生物价的蛋白质；还含有丰富的维生素，其中以维生素A、维生素D、维生素B最多，这些物质正是猪精液生长所需的，能够为猪精子提供良好的生长环境，且来源广泛，容易获得。
海藻糖：是一种安全、可靠的天然糖类，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，能够被分解成葡萄糖，可代替葡萄糖，提供营养物质，并且与其他糖类相比，海藻糖的血糖反应更加平稳，安全可靠。
透明质酸钠：具有高效的锁水功能和保湿作用，能够避免猪精子细胞因失水而死亡。
氯化钾：作为电解质平衡调节剂，维持电解平衡。
褪黑激素(MT)：有强大的清除自由基、抗氧化能力，能够防止猪精子细胞产生氧化损伤。
恩诺沙星：具有广谱抗菌活性，渗透性强，对革兰氏阴性菌有很强的杀灭作用，对革兰氏阳性菌也有良好的抗菌作用。
左旋肉碱：是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，能够促进脂肪酸穿过线粒体膜进行氧化供能，可促进猪精子细胞内脂肪燃烧，以提供能量，同时左旋肉碱还可促进支链氨基酸的氧化利用，改变线粒体内呼吸酶的活性，从而提高猪精子细胞有氧氧化供能的能力。
茶多酚：是茶叶中多酚类物质的总称，不仅具有较强的抗氧化作用，还具有抑菌作用，对葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等有抑制作用。此外，茶多酚还能够促进猪精子细胞对维生素C的吸收。
本发明中，牛血清白蛋白、三羟甲基氨基甲烷、半胱氨酸相互配合，对猪精子进行保护，延长猪精子的保存时间；柠檬酸钠、乙二胺四乙酸、透明质酸钠、氯化钾相互配合，为猪精子提供适宜的生存环境；卵黄、海藻糖、茶多酚、左旋肉碱相互配合，为猪精子提供充足的营养物质和能量，保证猪精子的正常生理活动；褪黑激素、恩诺沙星相互配合，清除猪精子保存过程中产生的多余自由基、细菌等不利因素，保证猪精子的稳定保存。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)稀释剂中各组分相互配合，对猪精子细胞进行保护，为猪精子提供适宜的生存环境，保证猪精子细胞的正常生理活动，并能够有效去除猪精子保存过程中产生的多余自由基，提高了猪精液的抗氧化应激能力及保存效果，保证了猪精子成活率，进而提高了母猪的配种率及养殖效益；
2)所用组分均为实验室常用物质，经济成本低，生物学效价高，具有来源广、药物残留少、副作用小的优点，安全，无刺激，且具有良好的缓冲、抗菌、抗氧化作用，便于在生产中推广应用；
3)易于混合制备，条件可控，生产成本低，性能稳定性好，具有很好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
利用过氧化氢(H2O2)处理猪精子细胞，建立氧化应激损伤细胞模型，之后研究稀释剂对猪精子细胞的保存作用以及对氧化应激导致的猪精子细胞损伤的影响，并在高倍显微镜下观察猪精液品质的各项指标，运用比色法检测猪细胞培养液中丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)含量。试验过程如下：
采用单因子设计，选择健康状况、体重接近的种公猪150头，随机分为6组，分别作为对照组及试验组1-5，预饲期7d，试验期30d。试验结束后，测定精子活率、顶体完整率、质膜完整率、精子畸形率、精子活力、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)含量等指标。
其中，各组种公猪精液分别与相应的保存液混合，进行常温保存7天。保存液包括稀释剂及稀释液，稀释液选用BTS稀释液，稀释剂按下表配制：
在高倍光学显微镜下观察各组猪精液，精液品质各项指标取其7天平均值，结果如下表所示：
指标 对照组 试验组1 试验组2 试验组3 试验组4 试验组5
精子活率 66.38 70.29 73.28 78.28 80.98 76.82
顶体完整率 59.71 61.88 63.18 65.28 68.38 66.32
质膜完整率 47.71 50.92 51.18 55.36 59.93 50.28
精子畸形率 20.57 19.01 18.37 17.73 16.28 16.99
精子活力 52.57 56.82 61.82 67.01 70.28 65.38
由上表可知，各试验组的精子活率、顶体完整率、质膜完整率、精子活力均高于对照组，而精子畸形率均低于对照组，表明猪精液常温保存稀释剂中的成分能够有效保存猪精液，保存效果好。
运用比色法检测猪细胞培养液中丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)含量，结果如下表所示：
由上表可知，对照组的MDA含量较高，而T-AOC含量很低，表明对照组中，猪精子细胞受氧化应激刺激较大。各试验组的MAD含量较低，而T-AOC含量较高，表明各试验组中，猪精液常温保存稀释剂能够减小猪精子细胞的氧化应激，猪精子细胞存活率高，猪精液品质得到保证，可用于人工授精技术，提高养殖效益。
实施例2：
一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，该保存液由稀释剂与稀释液组成，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白1g、三羟甲基氨基甲烷6g、半胱氨酸0.1g、柠檬酸钠10g、螯合剂2.4g、卵黄0.22L、海藻糖0.08L、透明质酸钠2g、氯化钾0.5g、抗氧化剂1mmol、杀菌剂0.1g、左旋肉碱1g及茶多酚0.5g。
其中，螯合剂为乙二胺四乙酸；抗氧化剂为褪黑激素；杀菌剂为恩诺沙星；稀释液为磷酸缓冲盐溶液。
应用时，每1mL猪精液中加入3mL保存液，用于猪精液的常温保存。
实施例3：
一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，该保存液由稀释剂与稀释液组成，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白6g、三羟甲基氨基甲烷5g、半胱氨酸0.15g、柠檬酸钠6g、螯合剂3g、卵黄0.17L、海藻糖0.12L、透明质酸钠1g、氯化钾1.1g、抗氧化剂0.5mmol、杀菌剂0.2g、左旋肉碱0.2g及茶多酚2g。
其中，螯合剂为乙二胺四乙酸；抗氧化剂为褪黑激素；杀菌剂为恩诺沙星；稀释液为BTS稀释液。
应用时，每1mL猪精液中加入5mL保存液，用于猪精液的常温保存。
实施例4：
一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，该保存液由稀释剂与稀释液组成，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白2g、三羟甲基氨基甲烷5.8g、半胱氨酸0.11g、柠檬酸钠9g、螯合剂2.5g、卵黄0.21L、海藻糖0.09L、透明质酸钠1.8g、氯化钾0.7g、抗氧化剂0.8mmol、杀菌剂0.12g、左旋肉碱0.7g及茶多酚0.8g。
其中，螯合剂为乙二胺四乙酸；抗氧化剂为褪黑激素；杀菌剂为恩诺沙星；稀释液为磷酸缓冲盐溶液。
应用时，每1mL猪精液中加入4mL保存液，用于猪精液的常温保存。
实施例5：
一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，该保存液由稀释剂与稀释液组成，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白5g、三羟甲基氨基甲烷5.2g、半胱氨酸0.14g、柠檬酸钠7g、螯合剂2.8g、卵黄0.19L、海藻糖0.11L、透明质酸钠1.2g、氯化钾0.9g、抗氧化剂0.6mmol、杀菌剂0.18g、左旋肉碱0.5g及茶多酚1.5g。
其中，螯合剂为乙二胺四乙酸；抗氧化剂为褪黑激素；杀菌剂为恩诺沙星；稀释液为BTS稀释液。
应用时，每1mL猪精液中加入3.5mL保存液，用于猪精液的常温保存。
实施例6：
一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，该保存液由稀释剂与稀释液组成，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白3g、三羟甲基氨基甲烷5.5g、半胱氨酸0.12g、柠檬酸钠8g、螯合剂2.6g、卵黄0.2L、海藻糖0.1L、透明质酸钠1.5g、氯化钾0.8g、抗氧化剂0.7mmol、杀菌剂0.15g、左旋肉碱0.6g及茶多酚1.2g。
其中，螯合剂为乙二胺四乙酸；抗氧化剂为褪黑激素；杀菌剂为恩诺沙星；稀释液为磷酸缓冲盐溶液。
应用时，每1mL猪精液中加入4.5mL保存液，用于猪精液的常温保存。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂，该稀释剂用于配制保存液，其特征在于，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白1-6g、三羟甲基氨基甲烷5-6g、半胱氨酸0.1-0.15g、柠檬酸钠6-10g、螯合剂2.4-3g、卵黄0.17-0.22L、海藻糖0.08-0.12L、透明质酸钠1-2g、氯化钾0.5-1.1g、抗氧化剂0.5-1mmol、杀菌剂0.1-0.2g、左旋肉碱0.2-1g及茶多酚0.5-2g。
2.根据权利要求1所述的一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂，其特征在于，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白2-5g、三羟甲基氨基甲烷5.2-5.8g、半胱氨酸0.11-0.14g、柠檬酸钠7-9g、螯合剂2.5-2.8g、卵黄0.19-0.21L、海藻糖0.09-0.11L、透明质酸钠1.2-1.8g、氯化钾0.7-0.9g、抗氧化剂0.6-0.8mmol、杀菌剂0.12-0.18g、左旋肉碱0.5-0.7g及茶多酚0.8-1.5g。
3.根据权利要求2所述的一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂，其特征在于，每1L保存液包括以下稀释剂组分及含量：牛血清白蛋白3g、三羟甲基氨基甲烷5.5g、半胱氨酸0.12g、柠檬酸钠8g、螯合剂2.6g、卵黄0.2L、海藻糖0.1L、透明质酸钠1.5g、氯化钾0.8g、抗氧化剂0.7mmol、杀菌剂0.15g、左旋肉碱0.6g及茶多酚1.2g。
4.根据权利要求1所述的一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂，其特征在于，所述的螯合剂为乙二胺四乙酸。
5.根据权利要求1所述的一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂，其特征在于，所述的抗氧化剂为褪黑激素。
6.根据权利要求1所述的一种抗氧化应激的猪精液常温保存稀释剂，其特征在于，所述的杀菌剂为恩诺沙星。
7.一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，其特征在于，该保存液包括如权利要求1至6任一项所述的稀释剂。
8.根据权利要求7所述的一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，其特征在于，该保存液由稀释剂与稀释液组成。
9.根据权利要求8所述的一种抗氧化应激的猪精液常温保存液，其特征在于，所述的稀释液包括磷酸缓冲盐溶液或BTS稀释液中的一种。
10.一种如权利要求7所述的抗氧化应激的猪精液常温保存液的应用，其特征在于，每1mL猪精液中加入3-5mL保存液，用于猪精液的常温保存。
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