CN113317312B - 一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，所述稀释液制剂是将抗氧化剂加入到基础稀释液中混合制得，抗氧化剂和基础稀释液质量体积比g/L为0.03～0.15：1，每升基础稀释液含有以下质量原料：葡萄糖为15.0～50.0g、乙二胺四乙酸0.5～5.0g、茶多酚0.2～0.5g、柠檬酸钠二水合物5.0～15.0g、碳酸氢钠0.05～5.0g、氯化钾0.02～3.0g，所述抗氧化剂由质量比为0.3～0.8:2～5:1.3～2:1的芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物制得，本发明优化稀释液制剂的基本原料和用量比例，提高在常温条件下延长猪精液存活期，并且维持与受精能力相关的精子指标，为获得高品质、高产量、低成本的常温储存猪精液具有一定指导意义。

Description

一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂。
背景技术
随着人工授精辅助技术在生猪产业中的推广应用，猪精液品质的优劣是决定人工配种成败与否的关键因素之一。目前，猪精液的保存方式主要有常温保存与冷冻保存，由于猪精子头部质膜不饱和脂肪酸的含量较高，冷冻保存过程中抵抗氧化损伤的能力较弱，使解冻后精子的品质(如活率、质膜功能完整性与顶体功能完整性)大大降低继而影响生产业绩。因此，猪精液的常温保存仍为我国现如今集约化与规模化养殖场所采用的主要精液保存方式。
在如今的集约化养殖场中，猪精液常温保存的一般天数为2-3天，随着保存时间的递增，精子的品质逐渐下降，大部分的精液被弃之不用，其中最为主要的因素是由于活性氧(ROS)的存在。新鲜采集的精液中由于精浆的存在可使活性氧的含量得以维持平衡。但随着精液稀释后保存时间的增长，大量活性氧的产生导致这一机制的失衡。高比例的多不饱和脂肪酸可被精子膜中过多的活性氧氧化继而改变精子质膜的完整性。因此，补充外源性抗氧化剂可减少氧化应激对精子品质的影响。然而，目前市场上所添加的抗氧化剂一般为人工合成，如丁基羟基茴香醚，存在着一定的毒害作用；或者直接添加酶类抗氧化剂，例如过氧化氢酶，但其价格较昂贵，并且添加到稀释剂中的有效保存时间一般为1-5天，精子的有效活率只维持在40％-50％左右，降低了种用资源的有效利用率。
咖啡酸苯乙酯(CAPE)是从蜂胶中提取的主要成份。咖啡酸苯乙酯具有抗氧化，抗炎和抗微生物等生物功能。研究表明，咖啡酸苯乙酯可抑制黄嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶(NOS)活性的性质，减少对超氧化物歧化酶SOD的消耗。还可在一定程度上可增强过氧化氢酶CAT的活性，减轻过氧化氢含量对精子的影响，从而起到抗氧化作用。
专利“一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法”，申请号：202010745845.9，公开了单独将咖啡酸苯乙酯加入到基础液中能提升解冻后精液的活性，但未公开精液的存活率和存活时间欠佳。
芹菜素(apigenin)，又称芹黄素、洋芹素。是一种黄酮类化合物。在自然界广泛分布。主要存在于瑞香科、马鞭草科、卷柏科植物中，广泛分布于温热带的蔬菜和水果中，尤以芹菜中含量为高，芹菜素具有抑制致癌物质的致癌活性；作为治疗HIV和其它病毒感染的抗病毒药物；MAP激酶的抑制剂；治疗各种炎症；抗氧化剂；镇静、安神；降压。与其他黄酮类物质(槲皮素、山奈黄酮)相比具有低毒、无诱变性等特性。
香豆酸(coumalic acid)化学名称为2-吡喃酮-5-羧酸，主要分布在禾本科植物的茎干中，属于内酯类化合物。现代药理学研究表明，内酯类化合物具有广泛的药理作用，在抗血小板活化、抗肿瘤、免疫抑制等方面显示出明显的药理作用；由于可形成共振稳定的酚自由基，对香豆酸具有良好的抗氧化活性。它对过氧化氢、超氧自由基、轻自由基、过氧化亚硝基有强烈的清除作用，对单线态氧有淬灭作用。在淬灭自由基的同时，对香豆酸还能抑制产生自由基的酶，促进产生清除自由基的酶。
白花丹，多年生蔓生亚灌木状草本，高2-3m。茎细弱，基部木质，多分枝，有细棱，节上带红色，除具腺外，光滑无毛。单叶互生；叶柄基部扩大而抱茎；叶片纸质，卵圆形至卵状椭圆形，长4-10cm，宽1.5-5cm，先端尖，基部阔楔形，无毛，全缘，白花丹提取物中含有白花丹醌、β-谷甾醇等，具有抗肿瘤、抗菌、抗疟原虫、抗过敏、抗高血糖症等作用；目前，在猪精液的相关研究中，联合添加咖啡酸苯乙酯、芹菜素、香豆酸和白花丹提取物未见报道。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，来解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，稀释液制剂是将抗氧化剂加入到基础稀释液中混合制得，抗氧化剂和基础稀释液质量体积比g/L为0.03～0.15：1，每升基础稀释液含有以下质量原料：葡萄糖为15.0～50.0g、乙二胺四乙酸0.5～5.0g、茶多酚0.2～0.5g、柠檬酸钠二水合物5.0～15.0g、碳酸氢钠0.05～5.0g、氯化钾0.02～3.0g，抗氧化稀释液由抗氧化剂和水配置而成，所述抗氧化剂由芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物混合制得。
优选地，所述抗氧化剂和基础稀释液质量体积比g/L为0.03～0.12：1，所述每升基础稀释液含有以下质量原料：葡萄糖为29.5～45.0g、乙二胺四乙酸2.51～4.5g、茶多酚0.22～0.4g、柠檬酸钠二水合物7.5～12.0g、碳酸氢钠2.30～3.00g、氯化钾1.25～2.5g。
优选地，所述抗氧化剂和基础稀释液质量体积比g/L为0.06～0.12：1，所述每升基础稀释液含有以下质量原料：葡萄糖为37.5g、乙二胺四乙酸3.5g、茶多酚0.35g、柠檬酸钠二水合物10g、碳酸氢钠2.75g、氯化钾1.85g
优选地，所述抗氧化剂由质量比为0.3～0.8:2～5:1.3～2:1的芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物混合制得。
优选地，所述抗氧化剂由质量比为0.5:3:1.7:1的芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物混合制得。
优选地，所述白花丹提取物的制备方法包括以下步骤：取白花丹根茎，洗净，粉碎，先使用70v/v％乙醇溶液进行第一次醇提0.5～1h，再于80v/v％乙酸乙酯溶液进行第二次浸提1～2h，合并提取液，减压浓缩，纯化后干燥，制得白花丹提取物。
进一步的，一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、基础稀释液的配制：称取葡萄糖、乙二胺四乙酸、柠檬酸钠二水合物、碳酸氢钠、氯化钾、茶多酚，充分溶解水中，调整pH值为7.0～7.5，渗透压为200～310mOsm/L，并立即用0.10～0.32μm的有机微孔滤膜进行过滤，得到基础稀释液，放置15～25℃保存，备用；
S2、抗氧化剂的制备：按上述取芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物加热至40～50℃混合搅拌2～10min，冷却至18～20℃，再加热至50～70℃混合搅拌1～8min，得到抗氧化剂；
S3、稀释液制剂的制备：将抗氧化剂加入到双蒸水中，充分搅拌均匀，配制浓度分别为0.03mg/mL、0.06mg/mL、0.09mg/mL、0.12mg/mL、0.15mg/mL，得到抗氧化剂稀释液，添加至S1的基础稀释液中，混合，得到稀释液制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明优化稀释液制剂的基本原料和用量比例，结合采用天然的抗氧化剂(芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物)添加于释液中，调控配比，加入天然抗氧化剂加强猪精子的抗氧化能力，缓解氧化损伤，不仅无毒性作用，并且可维持与受精能力相关的精子指标(如质膜功能完整性、顶体功能完整性)，最终维持精子的受精能力，可用于精子的在常温下长效保存，保存时间可达7天以上，并且活率维持在80％左右，可实现不同地区生猪生产的需求。同时，稀释液的成本低，效果较稳定，为获得高品质、高产量、低成本的常温储存猪精液具有一定指导意义。
附图说明
图1为不同浓度的抗氧化剂在第1、3、5和7天的保存时间内对精子活率的影响示意图，其中不同的上标(a-e)表示差异显著，下同。
图2为不同浓度的抗氧化剂在1、3、5和7天的保存时间内对精子质膜完整性的影响示意图。
图3为不同浓度的抗氧化剂在1、3、5和7天的保存时间内对精子质膜完整性的影响示意图。
图4为实施例3和对比例1～3制得的稀释液制剂第1、3、5和7天的保存时间内的精子活率，纵坐标为精子存活率(％)，横坐标为保存天数。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例21
一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，用电子天平精确称取葡萄糖为50.00g、乙二胺四乙酸5.00g、茶多酚0.50g、柠檬酸钠二水合物15.00g、碳酸氢钠5.00g、氯化钾3.00g，充分溶解1L双蒸水中，调整pH值为7.5，渗透压为310mOsm/L，并立即用0.32μm的有机微孔滤膜进行过滤，得到基础稀释液，放置25℃保存，备用；
抗氧化剂的制备：取芹菜素0.8g、咖啡酸苯乙酯5g、香豆酸2g和白花丹提取物1g加热至50℃混合搅拌10min，冷却至20℃，再加热至70℃混合搅拌8min，得到抗氧化剂；
稀释液制剂的制备：取抗氧化剂0.03g加入上述1L基础稀释液中，配置成浓度为0.03mg/mL的稀释液制剂。
实施例2
一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，用电子天平精确称取葡萄糖为29.50g、乙二胺四乙酸2.51g、茶多酚0.22g、柠檬酸钠二水合物7.50g、碳酸氢钠2.30g、氯化钾1.25g，充分溶解1L双蒸水中，调整pH值为7.2，渗透压为280mOsm/L，并立即用0.25μm的有机微孔滤膜进行过滤，得到基础稀释液，放置20℃保存，备用；
抗氧化剂的制备：取芹菜素0.5g、咖啡酸苯乙酯3g、香豆酸1.7g和白花丹提取物1g加热至45℃混合搅拌6min，冷却至20℃，再加热至60℃混合搅拌5min，得到抗氧化剂；
稀释液制剂的制备：取抗氧化剂0.06g加入上述1L基础稀释液中，配置成浓度为0.06mg/mL的稀释液制剂。
实施例43
一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，用电子天平精确称取葡萄糖为45.00g、乙二胺四乙酸4.50g、茶多酚0.40g、柠檬酸钠二水合物12.00g、碳酸氢钠3.00g、氯化钾2.50g，充分溶解1L双蒸水中，调整pH值为7.2，渗透压为280mOsm/L，并立即用0.20μm的有机微孔滤膜进行过滤，得到基础稀释液，放置20℃保存，备用；
抗氧化剂的制备：取芹菜素0.5g、咖啡酸苯乙酯3g、香豆酸1.7g和白花丹提取物1g加热至45℃混合搅拌6min，冷却至20℃，再加热至60℃混合搅拌5min，得到抗氧化剂；
稀释液制剂的制备：取抗氧化剂0.09g加入上述1L基础稀释液中，配置成浓度为0.09mg/mL的稀释液制剂。
实施例4
一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，用电子天平精确称取葡萄糖为37.5g、乙二胺四乙酸3.5g、茶多酚0.35g、柠檬酸钠二水合物10g、碳酸氢钠2.75g、氯化钾1.85g，充分溶解1L双蒸水中，调整pH值为7.2，渗透压为280mOsm/L，并立即用0.20μm的有机微孔滤膜进行过滤，得到基础稀释液，放置20℃保存，备用；
抗氧化剂的制备：取芹菜素0.5g、咖啡酸苯乙酯3g、香豆酸1.7g和白花丹提取物1g加热至45℃混合搅拌6min，冷却至20℃，再加热至60℃混合搅拌5min，得到抗氧化剂；
稀释液制剂的制备：取抗氧化剂0.12g加入上述1L基础稀释液中，配置成浓度为0.012mg/mL的稀释液制剂。
实施例5
一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，用电子天平精确称取葡萄糖为37.5g、乙二胺四乙酸3.5g、茶多酚0.35g、柠檬酸钠二水合物10g、碳酸氢钠2.75g、氯化钾1.85g，充分溶解1L双蒸水中，调整pH值为7.2，渗透压为280mOsm/L，并立即用0.20μm的有机微孔滤膜进行过滤，得到基础稀释液，放置20℃保存，备用；
抗氧化剂的制备：取芹菜素0.5g、咖啡酸苯乙酯3g、香豆酸1.7g和白花丹提取物1g加热至45℃混合搅拌6min，冷却至20℃，再加热至60℃混合搅拌5min，得到抗氧化剂；
稀释液制剂的制备：取抗氧化剂0.15g加入上述1L基础稀释液中，配置成浓度为0.015mg/mL的稀释液制剂。
对比例1
本对比例与实施例2的区别在于，所述抗氧化剂为等量的咖啡酸苯乙酯。
对比例2
本对比例与实施例2的区别在于，所述抗氧化剂由等量的绿原酸、咖啡酸苯乙酯、聚乙烯吡咯烷酮制得。
对比例3
本对比例与实施例2的区别在于，所述抗氧化剂由芹菜素0.2g、咖啡酸苯乙酯1g、香豆酸1g和白花丹提取物1g制得。
对比例4
本对比例与实施例2的区别在于，一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，用电子天平精确称取葡萄糖为15.0g、乙二胺四乙酸0.5g、茶多酚0.2g、柠檬酸钠二水合物5.0g、碳酸氢钠0.05g、氯化钾0.02g，充分溶解1L双蒸水中，调整pH值为7.0，渗透压为200mOsm/L，并立即用0.10μm的有机微孔滤膜进行过滤，得到基础稀释液，放置15℃保存，备用，未加入抗氧化剂。
一、精液处理
(1)精液的采集
选取8头已达到采精标准的成年长白公猪进行样品的采集，通过手握法采集新鲜的精液，使用纱布过滤多余的胶状物质，用电子恒温集精杯将精液运回实验室进行操作。
(2)精液的加工
新鲜采集的精液首先采用红液温度计测定温度，对精液的活率、精子浓度进行检测，将达标同温的精液进行混池。使用水浴锅将温度调节至与精液同温，将稀释液放置水浴锅预热至与精液同温(±1℃)，待预热完成后将实施例1～5和对比例4制得的稀释液制剂分别缓慢加入精液中，分成六个实验组。将分装完毕的各个组放置室温静置1-2小时后放入17℃恒温冰箱。
二、精液品质评估
将6组实验组对1、3、5及7天保存时间内的精液进行活率、质膜完整性与顶体完整性指标的测定。
(1)精子活率的测定
采用全自动精子分析系统对精子的活率进行测定，将精液稀释至1×107个/mL的浓度，并放置37℃的水浴环境中加热10分钟，吸取2μl的精液与八孔微腔玻片中，通过调节不同区域进行精子计数，至少采集250个精子用作分析。
(2)质膜完整性的检测
在预先配好的低渗溶液(0.367g柠檬酸钠、0.675g的果糖，溶于50mL的纯水中，0.22μm滤膜过滤)中，取1mL于离心管，将离心管放置于37℃的恒温水浴锅中预热5分钟，取100μl精液于低渗溶液中轻轻混合均匀置于37℃恒温水浴锅30分钟，用移液枪吸取10μl精液样品置于载玻片，盖上盖玻片。放置37℃载物台上。使用400倍数的相衬显微镜观察一个样本5个随机区域，5个区域共计250个精子。
(3)顶体完整性的检测
电子天平称取0.25g考马斯亮蓝粉末，10ml冰醋酸与40ml甲醇，50ml蒸馏水混匀，4℃避光保存。取100μl的精液，用1mL的3.7％多聚甲醛溶液固定10分钟，2000转离心6分钟，用PBS离心清洗2次去上清，再加入适量PBS制成细胞悬液，取50μl精液样本滴到载玻片上，用枪头均匀涂开，染色液置于水浴锅内预热37℃避光恒温10分钟，涂片置于37℃染液中1mL染液中20-30分钟，染色涂片用蒸馏水冲洗、风干、封片，自然烘干。显微镜下观察5个不同区域共计250个精子。
(4)检测结果
如图1所示，在保存的第一天，不同浓度组之间的差异不显著(P＞0.05)，但在保存的第3天与第7天，相较于其他浓度组，当稀释液中抗氧化剂的浓度为0.06mg/mL时，精子活率显著(P＜0.05)高于其他不同浓度组。
如图2所示，当抗氧化剂的添加浓度为0.06mg/mL时，在整个保存的时间可显著性提高精子的质膜完整性(P＜0.05)，这与精子活率随着保存时间递增的结果相一致(P＜0.05)，说明抗氧化剂(0.06mg/mL)能显著提高精子的质膜完整性。
如图3所示，精子顶体完整率随时间的递增呈下降趋势，但随着保存时间的延长，0.06mg/mL浓度组相较于其他组显著提高顶体完整性(P＜0.05)。
从以上分析结果可发现，芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物的结合可显著性提高精子的活率、质膜完整性、顶体完整性。特别是当保存到第七天时，精子的活率仍可达80％，说明抗氧化剂对猪精子具有较强的保护作用。其中，稀释液中抗氧化剂的最佳添加浓度为0.06mg/mL。
三、对比实验
将最佳实施例2与对比例1～3制得的稀释液制剂进行精液品质评估，取上述采集的精液中，选取精子密度较高的部分，精液中猪精液密度为6-10亿/mL，取20ml精子，分为5组，每组4ml，分别存于实施例2与对比例1～3制得的稀释液制剂和清水中，观察分别在1d、3d、5d、7d的存活率。
如图4所示，本发明最佳的实施例2中系稀释液制剂与对比例1～3进行对比，明显可知，实施例2中第七天精子依旧保持较高的存活率，与对比例1-3比较，说明由质量比为0.5:3:1.7:1的芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物制得的抗氧化剂比单一的咖啡酸苯乙酯作为抗氧化剂效果更佳，是因为芹菜素、香豆酸和白花丹提取物中含有的成分协助咖啡酸苯乙酯抑制黄嘌呤氧化酶和一氧化氮合酶(NOS)活性的性质，减轻过氧化氢含量对精子的影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，其特征在于：所述稀释液制剂是将抗氧化剂加入到基础稀释液中混合制得，抗氧化剂和基础稀释液质量体积比g/L为0.03～0.15：1，每升基础稀释液含有以下质量原料：葡萄糖为15.0～50.0g、乙二胺四乙酸0.5～5.0g、茶多酚0.2～0.5g、柠檬酸钠二水合物5.0～15.0g、碳酸氢钠0.05～5.0g、氯化钾0.02～3.0g；
所述抗氧化剂由质量比为0.3～0.8:2～5:1.3～2:1的芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物混合制得；
所述白花丹提取物的制备方法包括以下步骤：取白花丹根茎，洗净，粉碎，先使用70v/v％乙醇溶液进行第一次醇提0.5～1h，再于80v/v％乙酸乙酯溶液进行第二次浸提1～2h，合并提取液，减压浓缩，纯化后干燥，制得白花丹提取物。
2.如权利要求1所述的一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，其特征在于：所述抗氧化剂和基础稀释液质量体积比g/L为0.06～0.12：1，所述每升基础稀释液含有以下质量原料：葡萄糖为29.5～45.0g、乙二胺四乙酸2.51～4.50g、茶多酚0.22～0.4g、柠檬酸钠二水合物7.5～12.0g、碳酸氢钠2.3～3.0g、氯化钾1.25～2.50g。
3.如权利要求1所述的一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，其特征在于：所述抗氧化剂和基础稀释液质量体积比g/L为0.06：1，所述每升基础稀释液含有以下质量原料：葡萄糖为37.5g、乙二胺四乙酸3.5g、茶多酚0.35g、柠檬酸钠二水合物10g、碳酸氢钠2.75g、氯化钾1.85g。
4.如权利要求1所述的一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂，其特征在于：所述抗氧化剂由质量比为0.5:3:1.7:1的芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物混合制得。
5.如权利要求1或2所述的一种可延长猪精液常温存活期的稀释液制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、基础稀释液的配制：称取葡萄糖、乙二胺四乙酸、柠檬酸钠二水合物、碳酸氢钠、氯化钾、茶多酚，充分溶解水中，调整pH值为7.0～7.5，渗透压为200～310mOsm/L，并立即用0.10～0.32μm的有机微孔滤膜进行过滤，得到基础稀释液，放置15～25℃保存，备用；
S2、抗氧化剂的制备：按上述取芹菜素、咖啡酸苯乙酯、香豆酸和白花丹提取物加热至40～50℃混合搅拌2～10min，冷却至18～20℃，再加热至50～70℃混合搅拌1～8min，得到抗氧化剂；
S3、稀释液制剂的制备：将抗氧化剂加入到S1备用的基础稀释液中，充分搅拌均匀，混合，得到稀释液制剂。
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