CN108684656A - 一种牛冻精稀释液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于牛冻精生产技术领域，具体涉及一种牛冻精稀释液及其制备方法,每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％卵黄，终浓度为5％的甘油，终浓度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为0.01％—1％的透明质酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水；将透明质酸加入冻精液中可以有效避免精子在保存期的能量消耗，并改善牛冻精液的质量。实验表明，通过应用本发明所述的牛冻精稀释液稀释冷冻保存的牛精液，解冻后精子活力≥38％。

Description

一种牛冻精稀释液及其制备方法

技术领域

本发明属于牛冻精生产技术领域，具体涉及一种牛冻精稀释液及其制备方 法。

背景技术

我国自上世纪七十年代开展牛冷冻精液生产，迄今已有四十年历史。大型 牛场同期处理后，每一位输精员要负责上千头母牛输精，都会选择将冻精一次 性解冻，从第一头到最后一头需要3-5个小时，精子在解冻后的存活时间十分 重要。精子在解冻后的存活时间与精子自身的能量高低和解冻后的活力密切相 关，精子自身能量的高低与种牛的体质相关，而精子解冻后的活力受稀释液内 成分的影响较大，目前市面上的冻精稀释液普遍存在精子存活时间短的问题。

透明质酸是一种酸性粘多糖，1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等 首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质 在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调 节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸 具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想 的天然保湿因子(Natural moisturizing factor，NMF)例如：2％的纯透明质 酸水溶液能牢固地保持98％水分。透明质酸是一种大分子难溶的物质，透明质 酸水溶液是一种非牛顿型流体，有着良好的粘弹性和流变形。

由于透明质酸具有良好的保水性、粘弹性和流变性，本申请的发明人尝试 将其加入冻精稀释液中，以期解决精子在解冻后存活时间短的问题。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足之处，本发明的目的就在于提供一种牛冻精 稀释液及其制备方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种牛冻精稀释液，每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml 的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为 5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％(体积百分数，下同)卵黄，终浓 度为5％的甘油，终浓度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为 0.01％—1％的透明质酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水。

上述牛冻精稀释液的制备方法，包括如下步骤(以1000ml稀释液为例)：

步骤(1)：配置0.01％—1％透明质酸水溶液

将800ml量的灭菌水置于锥形瓶中，将终浓度为0.01％—1％的透明质酸加 入灭菌水中，将锥形瓶置于水浴中加热溶解；

步骤(2)：向步骤(1)水浴溶解后的透明质酸水溶液中加入终浓度为 5mMol/ml-15mMol/ml的肉碱，并搅拌均匀；

步骤(3)：向步骤(3)所得的溶液中加入终浓度为0.024g/ml的Tris，终 浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，摇匀后，1000ml定容， 在4℃保存，待用；

步骤(4)：在使用稀释液前半小时，向步骤(3)所制得的溶液中加入终 浓度为5％的霉素及终浓度为5％的链霉素，搅匀后，得到牛冻精稀释液。

优选地，上述牛冻精稀释液的制备方法，步骤(1)中所述的水浴溶解的 水浴温度为37℃，水浴时间为2小时。

与现有技术相比较，本发明所述的牛冻精稀释液及其制备方法，具有如下 创新点：

(1)首次将透明质酸作为精子活力抑制剂成功应用于牛精液冷冻保存： 本发明针对目前牛冻精稀释液常存在解冻后牛精子活力不足的问题，将透明质 酸应用于牛精液的冷冻保存研究中。将透明质酸加入牛冻精稀释液中，在使用 时透明质酸包覆在精子周围，在精子周围形成膜结构，而且透明质酸具有良好 的粘弹性和流变性，使整个精子的活动能力降低，使精子内蕴含的能量不受消 耗，一旦精子进入输卵管，精子表面包覆的透明质酸被输卵管内的环境液降解 后，精子恢复其原有的运动状态，精子内蕴含的能量被重新释放，将透明质酸 加入冻精液中可以有效避免精子在保存期的能量消耗，并改善牛冻精液的质 量。实验表明，通过应用本发明所述的牛冻精稀释液稀释冷冻保存的牛精液， 解冻后精子活力≥38％。

(2)本发明中使用的透明质酸来源广、成本低廉、纯度高、化学稳定性 好，制成的冻精稀释液安全可靠，成本低廉。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式 对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

一种牛冻精稀释液，每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml 的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为 5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％卵黄，终浓度为5％的甘油，终浓 度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为0.01％—1％的透明质 酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水。

上述牛冻精稀释液的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)：配置0.01％—1％透明质酸水溶液

将800ml量的灭菌水置于锥形瓶中，将终浓度为0.01％—1％的透明质酸加 入灭菌水中，将锥形瓶置于水浴中加热溶解；

步骤(2)：向步骤(1)水浴溶解后的透明质酸水溶液中加入终浓度为 5mMol/ml-15mMol/ml的肉碱，并搅拌均匀；

步骤(3)：向步骤(3)所得的溶液中加入终浓度为0.024g/ml的Tris，终 浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，摇匀后，1000ml定容， 在4℃保存，待用；

步骤(4)：在使用稀释液前半小时，向步骤(3)所制得的溶液中加入终 浓度为5％的霉素及终浓度为5％的链霉素，搅匀后，得到牛冻精稀释液。制得 的牛冻精稀释液置于37℃水浴锅中保温直至鲜精加完稀释液。

具体地，上述牛冻精稀释液的制备方法，步骤(1)中所述的水浴溶解的 水浴温度为37℃，水浴时间为2小时。

实施例1的步骤(1)中，透明质酸不易溶解，搅拌溶解的方法会使大分 子物质低分子化，破坏其分子结构，影响透明质酸的使用效果。本发明采用加 热溶解的方法对其进行溶解，在加热溶解的过程中，不对溶解液搅拌，有效的 解决了透明质酸低分子化的问题，能够有效保持透明质酸内的有效大分子物 质，进而保持透明质酸的粘弹性。

本申请所述的牛冻精稀释液中各部分的作用是：

透明质酸：是一种酸性粘多糖，透明质酸以其独特的分子结构和理化性质 在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节，调节血管壁的通透性，调 节蛋白质，水电解质扩散及运转，促进创伤愈合等。尤为重要的是，透明质酸 具有特殊的保水作用，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想 的天然保湿因子(Natural moisturizingfactor，NMF)例如：2％的纯透明质 酸水溶液能牢固地保持98％水分。透明质酸是一种大分子难溶的物质，透明质 酸水溶液是一种非牛顿型流体，有着良好的粘弹性和流变形。将透明质酸加入 牛冻精稀释液中，在使用时透明质酸包覆在精子周围，在精子周围形成膜结构， 而且透明质酸具有良好的粘弹性和流变性，使整个精子的活动能力降低，使精 子内蕴含的能量不受消耗，一旦精子进入输卵管，精子表面包覆的透明质酸被 输卵管内的环境液降解后，精子恢复其原有的运动状态，精子内蕴含的能量被 重新释放，将透明质酸加入冻精液中可以有效避免精子在保存期的能量消耗。

肉碱：保护精子膜结构

Tris：缓冲剂

柠檬酸：溶质，可能也参与糖酵解；

葡萄糖为精子代谢底物，用于给精子补充能量；

卵黄：为低温休克精子膜保护剂；

甘油：为渗透性冷冻保护剂；

青霉素和链霉素为抗生素，二者的主要作用是抑制冻精稀释液中的微生 物。

冷冻精液质量检查本试验的对比试验采用单一变量对比试验，对比例中 不含透明质酸，其他组分和含量相同。

检测一：精子活力

取少量鲜精加入适量配好的稀释液中，混匀后在相差显微镜下检测精子活 力，大于0.68时，用minitube密度仪检测原精密度，并根据原精密度添加牛 冻精稀释液，将稀释后的精液使用minitube四头灌装机灌装至0.25ml细管中， 使用minitube冷冻仪对灌装后的精液冷冻，冷冻后置于液氮中保存。

使用精液时，将精液从液氮中取出、解冻并抽取10ul混合液滴至载玻片， 使用盖玻片压片，静置30s后，放置在相差显微镜下(物镜40x目镜10x)， 按照百分制评定精子活力，每个样品重复3次，取其平均数。

检测二：精子畸形率

每个样品用姬姆撒染色法涂片两张，每张在油镜下分别数200个精子，计 算精子畸形率，计算公式如下：

精子畸形率(％)＝畸形精子数/观察到的精子总数×100

检测三：冻后废弃率

冻后废弃率(％)＝废弃精液的次数/总采精次数×100

检测四：精子存活时间

为模拟输卵管内环境(可降解透明质酸酶)，采用以下检测方法：

第一步：将实施例1和对比例分别配置的牛冻精稀释液在37℃解冻后，分 别于解冻后0小时、3小时、6小时候将吸管内的精液使用推针推至离心管内； 第二步：使用离心力为800g的离心机离心10分钟，弃上清(上清液液中含透 明质酸)，使用不含透明质酸的稀释液重悬沉淀，混匀；

第三步：使用相差显微镜检测活力

解冻后的精液放在37℃恒温箱中，定时检查精子活力，直至精子全部死亡 为止，记录精子全部死亡用时。

检测五：镜检感光度在显微镜下观察精子的清洁度、透光度。

对上述数据统计分析时，采用SPSS统计软件进行单因子方差分析，差异 显著时用LSD法进行多重比较。比较结果如下：

表1不同稀释液配方对牛冻精性能指标的影响

由表1可知，2种不同稀释液配方对种公牛精液冻后活力的影响差异显著， 冻后活力的大小顺序为实施例1＞对比例，实施例1生产的冻精的畸形率明显 低于对比例，实施例1生产的冻精的冻后废弃率明显低于对比例，实施例1生 产的冻精的存活时间明显高于对比例，实施例1生产的冻精的镜检感光度较高， 说明实施例1稀释液的均质性理想。通过本试验结果分析可知，实施例1制得 的牛精液冻后精液的各项指标均符合国标GB4143-2008中的相关规定。

以上对本发明所提供的设计方案进行了详细介绍。本文中应用了具体个例 对本发明的实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明 的方法及其核心思想。应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改 进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.一种牛冻精稀释液，其特征在于，每100ml稀释液中包含以下组分：终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，终浓度为5mMol/ml～15mMol/ml的肉碱，终浓度为15％卵黄，终浓度为5％的甘油，终浓度为10％的青霉素，终浓度为10％的链霉素，终浓度为0.01％—1％的透明质酸水溶液，余量为灭菌蒸馏水。

2.一种如权利要求1所述的牛冻精稀释液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：配置0.01％—1％透明质酸水溶液

将800ml量的灭菌水置于锥形瓶中，将终浓度为0.01％—1％的透明质酸加入灭菌水中，将锥形瓶置于水浴中加热溶解；

步骤(2)：向步骤(1)水浴溶解后的透明质酸水溶液中加入终浓度为5mMol/ml-15mMol/ml的肉碱，并搅拌均匀；

步骤(3)：向步骤(3)所得的溶液中加入终浓度为0.024g/ml的Tris，终浓度为0.013g/ml的柠檬酸，终浓度为0.01g/ml葡萄糖，摇匀后，1000ml定容，在4℃保存，待用；

步骤(4)：在使用稀释液前半小时，向步骤(3)所制得的溶液中加入终浓度为5％的霉素及终浓度为5％的链霉素，搅匀后，得到牛冻精稀释液。

3.根据权利要求2所述的牛冻精稀释液的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的水浴溶解的水浴温度为37℃，水浴时间为2小时。

4.根据权利要求2所述的牛冻精稀释液的制备方法，其特征在于，将制得的牛冻精稀释液置于37℃水浴锅中保温直至鲜精加完稀释液。