CN109907038A - 一种无动物源成分牛冻精稀释液 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种无动物源成分牛冻精稀释液，其中冷冻液中使用了大豆蛋白或小麦低聚肽的冷冻保护剂，基础液中加入了EDTA或IDHA螯合剂。本申请还提供了所述无动物源成分牛冻精稀释液在制备牛冻精制品中和牛人工授精繁殖中的应用。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域和畜牧业人工授精技术领域，具体地，本申请提供了一种无动物源成分牛冻精稀释液，其中冷冻液中使用了大豆蛋白或小麦低聚肽的冷冻保护剂，基础液中加入了EDTA或IDHA螯合剂。
背景技术
精液冷冻保存是将精液用含特殊冷冻保护剂和营养成分等的稀释液稀释后，保存于液氮或干冰中，以达到在体外长期保存精子的目的。精液冷冻技术是现代畜牧业家畜品种保持/构建，特别是牛、羊品种保持/构建最重要的手段之一——人工授精中几乎必不可少的技术（鲜配受时间、地域、操作条件限制很大）。
精液冷冻方法/试剂最重要的指标是复苏/复温后精子活力和完整度的保持情况，为使经过冷冻后的精子能保持活力和完整，冷冻精液时需要在稀释液中加入冷冻保护剂（渗透型和非渗透型）、营养物质、盐、抗生素等成分，最常用的非渗透冷冻保护剂为卵黄，卵黄虽然有长期的使用经验和较好的保护效果，但一方面其有机成分复杂，效果不稳定且不易制成商用成品，另一方面由于其为动物源性成分，有潜在的疾病传播风险。曾有公司开发过无卵黄精子冷冻稀释液，如卡苏OPTIXcellTM，但其实践效果不如含卵黄产品（市售和自制）。
因此，本领域中有研究性能好、保存稳定的无动物源成分冻精稀释液的需求。
发明内容
申请人在新型无动物源成分冻精稀释液研究中发现大豆蛋白和小麦低聚肽可以替代卵黄作为冻精稀释液中的非渗透冷冻保护剂，辅以适当的螯合剂去除重金属离子并保持某些酶活性可以实现良好的精液冻存效果。大豆蛋白是大豆经过脱脂去糖得到的天然植物蛋白产品，小麦低聚肽则是小麦蛋白经过进一步酶处理和喷雾干燥得到的粉末状天然植物蛋白产品，这两种天然蛋白产品来源和性质稳定，成分较卵黄简单，无传染或引起疾病的风险。
一方面，本申请提供了一种无动物源成分牛冻精稀释液，包括基础液和冷冻液，其特征在于，其中：
基础液成分包括：海藻糖、葡萄糖、Tris、柠檬酸、螯合剂、青霉素、双蒸水；
冷冻液成分包括：基础液成分、非动物源性蛋白、甘油。
进一步地，所述无动物源成分牛冻精稀释液中：
每100mL基础液中的成分为：海藻糖0.5g、葡萄糖1.5g、Tris 4g、柠檬酸2g、螯合剂0.2g、青霉素5万单位、余量为双蒸水；
每100mL冷冻液中的成分为：基础液90ml、非动物源性蛋白5g、甘油4mL，余量为双蒸水。
进一步地，所述无动物源成分牛冻精稀释液按照以下方法制备：
基础液：称取所需量的海藻糖、葡萄糖、Tris、柠檬酸，加入80mL双蒸水加热溶解，冷却后加入所需量的青霉素，双蒸水补足余量；
冷冻液：取所需量的基础液，加入所需量的非动物源性蛋白和甘油，混合均匀，双蒸水补足余量。
进一步地，所述无动物源成分牛冻精稀释液中非动物源性蛋白为大豆蛋白或小麦低聚肽。
进一步地，所述无动物源成分牛冻精稀释液中螯合剂为EDTA或IDHA。
进一步地,所述无动物源成分牛冻精稀释液中非动物源性蛋白为小麦低聚肽，螯合剂为IDHA。
另一方面，本申请提供了上述无动物源成分牛冻精稀释液在制备牛冻精制品中的应用。
进一步地，所述应用，其步骤包括：
（1）精液采集和品质鉴定；
（2）向合格的精液中等温加入精液3倍体积的基础液，冷却至4℃；
（3）向步骤（2）获得的稀释液中等温加入等体积的冷冻液，平衡；
（4）吸入细管，封口，冷冻。
另一方面，本申请提供了上述无动物源成分牛冻精稀释液在牛人工授精繁殖中的应用。
本申请中的海藻糖、葡萄糖、Tris、柠檬酸、螯合剂、青霉素、双蒸水、大豆蛋白、小麦低聚肽、EDTA、IDHA等成分可以选用符合相应标准的各生产商产品。根据各生产商的大豆蛋白、小麦低聚肽产品性质的不同，配方可以做适当调整。
本申请的无动物源成分牛冻精稀释液可用于各品种牛的冻精制备和人工授精，包括但不限于安格斯牛、荷兰牛、神户肉牛、夏洛莱牛、西门塔尔牛、鲁西黄牛等。经过本领域常规技术手段的改进和验证后也有望用于羊、马、猪等家畜。
具体实施方式
主要试剂和仪器：
OPTIXcellTM无卵黄冻精稀释液，由法国卡苏公司生产；
IDHA 亚氨基二琥珀酸，由ADOB公司生产；
大豆蛋白，食品级，由陕西森弗天然制品有限公司生产；
小麦低聚肽，食品级，河南兴源化工产品有限公司生产；
青霉素钠由山东鑫聚药业有限公司生产；
海藻糖、葡萄糖、Tris、柠檬酸、螯合剂、EDTA由SIGMA或国药集团生产。
冻精封灌设备，MRSP3，由法国卡苏公司生产；
细管冷冻仪，007209，由法国卡苏公司生产；
精子分析仪以及配套软件，WLJY9000，由北京伟力新世纪科技发展有限公司生产；
其他未专门标明的非关键仪器和试剂为常规国产种类/型号。
实施例1 各种冻精稀释液的配制
按照以下配方配制各种冻精稀释液（筛选配方时使用的部分效果不佳配方未列出）：
配方1：
每100mL基础液中的成分为：海藻糖0.5g、葡萄糖1.5g、Tris 4g、柠檬酸2g、EDTA 0.2g、青霉素5万单位、余量为双蒸水；
每100mL冷冻液中的成分为：基础液90ml、大豆蛋白5g、甘油4mL，余量为双蒸水。
配方2：
每100mL基础液中的成分为：海藻糖0.5g、葡萄糖1.5g、Tris 4g、柠檬酸2g、EDTA 0.2g、青霉素5万单位、余量为双蒸水；
每100mL冷冻液中的成分为：基础液90ml、小麦低聚肽5g、甘油4mL，余量为双蒸水。
配方3：
每100mL基础液中的成分为：海藻糖0.5g、葡萄糖1.5g、Tris 4g、柠檬酸2g、IDHA 0.2g、青霉素5万单位、余量为双蒸水；
每100mL冷冻液中的成分为：基础液90ml、小麦低聚肽5g、甘油4mL，余量为双蒸水。
配方4：（基本等同于申请人之前使用的冻精稀释液配方）
每100mL基础液中的成分为：海藻糖0.5g、果糖0.5g、葡萄糖1.5g、Tris 4g、柠檬酸2g、青霉素5万单位、余量为双蒸水；
每100mL冷冻液中的成分为：基础液80ml、卵黄液10ml、甘油5mL，余量为双蒸水。
配方5：
市售卡苏公司OPTIXcellTM（具体成分未检索到，使用了脂质体抗冻剂）
配置过程为：
基础液：称取所需量的海藻糖、果糖、葡萄糖、Tris、柠檬酸，加入80mL双蒸水加热溶解，冷却后加入所需量的青霉素，双蒸水补足余量；
冷冻液：取所需量的基础液，加入所需量的大豆蛋白/小麦低聚肽/卵黄液和甘油，混合均匀，双蒸水补足余量。
其中卵黄液制备过程为：新鲜鸡蛋表面消毒处理后抽取卵黄液，加入0.04% SDS，离心，取上清，0.5微米滤膜过滤。
实施例2 取精、冷冻和解冻过程
取精对象安格斯公牛由申请人自行饲养，年龄5-6岁，健康，性欲旺盛（筛选中使用了多只公牛，实施例对比试验中所用精液来自同一只同次取精过程）。
精液使用假阴道法采集，采集后检测鲜精活力达到0.65以上，精子密度达到10亿/ml以上的良好样本可用于后续冷冻实验。
对于配方1-4：
将精液与基础液置于同一37℃水浴锅中同温度处理10min；
向精液中等温加入精液3倍体积的基础液；
将稀释后获得的稀释液与冷冻液置于同一4℃冰箱内同温度处理30min
向稀释后获得的稀释液中加入等体积的冷冻液，平衡2h；
吸入细管（0.25mL），封口，冷冻(仪器标准程序)；
将细管置于液氮中保存30日；
解冻时将细管置于37℃水浴锅中30s；
取样检测。
对于配方5：
将精液与稀释液置于同一37℃水浴锅中同温度处理10min；
向精液中等温加入精液2倍体积的稀释液；
37℃水浴锅中放置10min；
再加入与稀释过的样本等体积的稀释液；
吸入细管（0.25mL），封口，冷冻(仪器标准程序)；
将细管置于液氮中保存30日；
解冻时将细管置于37℃水浴锅中30s；
取样检测。
使用同一只公牛同次取精过程的精液制备50份样本，每种配方10个样本重复（检测结果取平均值）。
实施例3 复苏精子基本指标检测
使用前述的伟力精子分析仪以及配套软件分析总活精子数、精子复苏率、活力、平均路径速率（VAP）、曲线运动速率（VCL）、直线运动速率（VSL）、顶体完整率和畸形率（每个配方10份样本平均值，由于伟力精子分析仪原用途为人精子分析，用于牛时部分高密度或软件中出现问题样本可能出现数据混乱明显失真情况，对此类伟力精子分析仪分析结果明显有问题的样本，参考现有技术人工观察和统计）。同时取样本200微升检测复苏精子存活时间（人工监控，99%精子死亡/失活的时间）结果见下表：
使用另2只公牛同次取精过程的精液制备样本，均获得了类似的结果。
上述结果表明，配方1-3均实现了良好的精液保存效果，不亚于甚至在多个指标上优于申请人先前使用的（也是本领域常用的）卵黄稀释液以及商品稀释液。在安全性、制备便利性上明显优于申请人先前使用的卵黄稀释液，在价格上明显优于OPTIXcellTM。由于其中未使用复杂动物源成分如卵黄，可以推测经过适当的处理后其也可以实现类似OPTIXcellTM的，1年以上的保存期，使用方便。
特别地，配方3（小麦低聚肽，IDHA），在存活时间指标上实现了明显优于其他样本的性能（超过50%以上），在活力指标上也超过其他配方，给人工授精操作带来了明显的便利性，推测可能是由于完全螯合剂IDHA可生物降解的，对精子细胞的影响小于EDTA，或其对重金属元素（多有细胞毒性）等的螯合性能较高，对钙镁锌等过渡元素（多种酶活性必需）螯合性能适中引起。
Claims (9)
1.一种无动物源成分牛冻精稀释液，包括基础液和冷冻液，其特征在于，其中：
基础液成分包括：海藻糖、葡萄糖、Tris、柠檬酸、螯合剂、青霉素、双蒸水；
冷冻液成分包括：基础液成分、非动物源性蛋白、甘油。
2.根据权利要求1的无动物源成分牛冻精稀释液，其中：
每100mL基础液中的成分为：海藻糖0.5g、葡萄糖1.5g、Tris 4g、柠檬酸2g、螯合剂0.2g、青霉素5万单位、余量为双蒸水；
每100mL冷冻液中的成分为：基础液90ml、非动物源性蛋白5g、甘油4mL，余量为双蒸水。
3.根据权利要求2的无动物源成分牛冻精稀释液，其按照以下方法制备：
基础液：称取所需量的海藻糖、葡萄糖、Tris、柠檬酸，加入80mL双蒸水加热溶解，冷却后加入所需量的青霉素，双蒸水补足余量；
冷冻液：取所需量的基础液，加入所需量的非动物源性蛋白和甘油，混合均匀，双蒸水补足余量。
4.根据权利要求1-3任一项的无动物源成分牛冻精稀释液，其中非动物源性蛋白为大豆蛋白或小麦低聚肽。
5.根据权利要求1-3任一项的无动物源成分牛冻精稀释液，其中螯合剂为EDTA或IDHA。
6.根据权利要求1-3任一项的无动物源成分牛冻精稀释液，其中非动物源性蛋白为小麦低聚肽，螯合剂为IDHA。
7.根据权利要求1-6任一项的无动物源成分牛冻精稀释液在制备牛冻精制品中的应用。
8.权利要求7所述应用，其步骤包括：
（1）精液采集和品质鉴定；
（2）向合格的精液中等温加入精液3倍体积的基础液，冷却至4℃；
（3）向步骤（2）获得的稀释液中等温加入等体积的冷冻液，平衡；
（4）吸入细管，封口，冷冻。
9.根据权利要求1-6任一项的无动物源成分牛冻精稀释液在牛人工授精繁殖中的应用。
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