CN114982744A - 一种脐带干细胞储存液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脐带干细胞储存液及其制备方法，本发明的脐带干细胞储存液储存液包括聚肽‑g‑海藻糖、脯氨酸、半乳糖、1,2‑丙二醇和胎牛血清蛋白；脯氨酸具有低温保护作用，可以稳定细胞膜、蛋白质、核酸等生物活性物质，细胞内脯氨酸的存在可以增强细胞冻存的存活率，即在结冰过程中，细胞内脯氨酸的存在可减弱渗透压变化带来的破坏作用；聚肽‑g‑海藻糖具有膜扰动活性，与细胞膜相互作用可在细胞膜局部形成微孔，提高了细胞中脯氨酸载入量。聚肽‑g‑海藻糖与脯氨酸、半乳糖搭配，在降温冷冻过程时，脯氨酸可以在细胞内外更有效地防止冰晶损伤，提高细胞冷冻的存活率，半乳糖的存在能够更大程度地改善上述作用，进一步改善冷冻效果。
Description
技术领域
本发明涉及本发明涉及细胞储存领域，具体涉及一种脐带干细胞储存液及其制备方法。
背景技术
脐带干细胞功能较多，应用广泛，主要是进行细胞移植治疗，亦可作为一种理想的靶细胞用于基因治疗，同时在生物组织工程和免疫治疗中也有一定的应用。近些年人脐带干细胞被大量应用于实验和临床研究中，已有大量研究揭示了它在心血管、神经系统、运动系统、消化系统、自身免疫病、血液系统、泌尿系统、眼科、骨科等系统疾病的诊断和治疗上的应用价值。因此，人脐带干细胞储存具有重要意义。
目前，多采用二甲亚砜(10％)和胎牛血清蛋白(90％)的冻存液冷冻保存干细胞，但是，这些冷冻剂中高浓度冷冻剂的细胞毒性作用，如二甲亚砜不利于细胞的恢复。也有人研究通过1，2-丙二醇、甘油替换二甲亚砜作为冷冻液，但是冷冻效果尚且不如二甲亚砜。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种脐带干细胞储存液及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种脐带干细胞储存液，所述储存液包括聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为(2％～4％)：(98％～96％)；
所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.1～1mg/mL；
所述脯氨酸的浓度为0.15～0.3mol/L；
所述半乳糖的质量浓度为1w/v％～3w/v％；
所述聚肽-g-海藻糖的化学结构如式Ⅰ所示；
其中，n为25到40之间的整数；x，y，z均为大于0的整数，y≥z。
脯氨酸具有低温保护作用，可以稳定细胞膜、蛋白质、核酸等生物活性物质，细胞内脯氨酸的存在可以增强细胞冻存的存活率，即在结冰过程中，细胞内脯氨酸的存在可减弱渗透压变化带来的破坏作用。但脯氨酸很难穿过细胞膜到细胞内。本发明通过合成的聚肽-g-海藻糖，聚肽-g-海藻糖具有膜扰动活性，与细胞膜相互作用可在细胞膜局部形成微孔，提高了细胞中脯氨酸载入量。聚肽-g-海藻糖与脯氨酸、半乳糖搭配，在降温冷冻过程时，脯氨酸可以在细胞内外更有效地防止冰晶损伤，提高细胞冷冻的存活率，半乳糖的存在能够更大程度地改善上述作用，进一步改善冷冻效果。
优选地，5≤x≤10，10≤z≤20。
优选地，所述聚肽-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚谷氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、碳酸氢钠水溶液(0.4wt％-0.45wt％)搅拌25～40分钟得到反应体系A；加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐于20～30℃搅拌反应48～96小时；浓缩后透析袋规格Mw800～1500水透析48～96小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯；
(2)将Nε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐、碳酸氢钠水溶液(0.4wt％-0.45wt％)搅拌25～40分钟，逐滴加入聚谷氨酸酸接枝苯丙氨酸甲酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的混合水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；浓缩后透析袋规格Mw1200～1800水透析48～96小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸；
(3)将羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
、N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中搅拌25～40分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为1800Da～2200Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖；羧基化海藻糖的分子结构为：
(4)脱去苄氧羰基、酯基，还原羧基保护的聚肽-g-海藻糖，得到聚肽-g-海藻糖。
上述提供了聚肽-g-海藻糖的一种制备方法，合成流程如图1所示。通过将负电性的谷氨酸、正电性的赖氨酸、疏水性的苯丙氨酸制备聚肽后聚合羧基化海藻糖，有利于增强与细胞膜的扰动作用。改善脐带干细胞储存液的冷冻存活率，降低毒性。
作为本领域技术人员，可以采用以下方法制备羧基化海藻糖：
(a)在三口烧瓶中15～25mg/mL海藻糖无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，放入75～85℃加热，通氮气，磁子搅拌；
(b)加入40～60mg/mL丁二酸酐无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，加入三乙胺混合；海藻糖与丁二酸酐的质量比为(3.5～4):1
(c)三口瓶密封，75～85℃下反应12h；
(d)反应结束后减压蒸馏出DMF，浓缩溶液后用过量乙醚沉淀产物；
(e)再次用少量无水DMF溶解沉淀产物后用过量乙醚沉淀纯化，将沉淀物不高于50℃干燥，得到乳白色泡沫状固体，即为羧基化海藻糖。
作为本领域技术人员，可以明白选择L-苯丙氨酸甲酯、Nε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐作为原料，作用在于保护氨基酸上的羧基基团，控制反应过程中羧基、氨基聚合的位置和连接方式。在制备得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖后，可以脱去苄氧羰基、酯基，还原羧基保护的聚肽-g-海藻糖，得到聚肽-g-海藻糖。还原羧基的方法为：加入氢氧化钠乙醇溶液(5wt％)，在室温条件下搅拌反应过夜，脱去苄氧羰基，还原羧基基团。
优选地，所述步骤(1)中聚谷氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：(5～10)：(5～10)。
通过研究发现，步骤(1)中聚谷氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：(5～10)：(5～10)时，脐带干细胞储存液的冷冻存活率更高。
优选地，所述步骤(2)中Nε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、聚天冬氨酸接枝苯丙氨酸甲酯的摩尔比为(20～35)：(20～35)：1。
优选地，所述步骤(3)中，羧基化海藻糖、聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(10～20)：1：(10～20)：(10～20)。
通过研究发现，步骤(3)中，羧基化海藻糖、聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(10～20)：1：(10～20)：(10～20)时，聚肽-g-海藻糖对细胞膜的扰动作用更强，且不会损伤细胞膜，脐带干细胞储存液的冷冻存活率更高。
优选地，所述所述步骤(3)中，羧基化海藻糖、聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸和摩尔比为(15～18)：1。
通过研究发现，步骤(3)中，羧基化海藻糖、聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸和摩尔比为(15～18)：1时，聚肽-g-海藻糖对细胞膜的扰动作用更强，且不会损伤细胞膜，脐带干细胞储存液的冷冻存活率更高。
优选地，所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.5～0.8mg/mL。
通过研究发现，脐带干细胞储存液中聚肽-g-海藻糖的浓度为0.5～0.8mg/mL时，聚肽-g-海藻糖对细胞膜的扰动作用更强，且不会损伤细胞膜，脐带干细胞储存液的冷冻存活率更高。
本发明还提供上述任一所述脐带干细胞储存液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(Ⅰ)制备聚肽-g-海藻糖；
所述聚肽-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚谷氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、碳酸氢钠水溶液(0.4wt％-0.45wt％)搅拌25～40分钟得到反应体系A；加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐于20～30℃搅拌反应48～96小时；浓缩后透析袋规格Mw800～1500水透析48～96小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯；
(2)将Nε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐、碳酸氢钠水溶液(0.4wt％-0.45wt％)搅拌25～40分钟，逐滴加入聚谷氨酸酸接枝苯丙氨酸甲酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的混合水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；浓缩后透析袋规格Mw1200～1800水透析48～96小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸；
(3)将羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
、N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中搅拌25～40分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为1800Da～2200Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖；羧基化海藻糖的分子结构为：
(4)脱去苄氧羰基、酯基，还原羧基保护的聚肽-g-海藻糖，得到聚肽-g-海藻糖；
(Ⅱ)将聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白按比例混合。
优选地，将1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白按照体积比配置混合液，将聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、半乳糖按照浓度加入混合液中混匀。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种脐带干细胞储存液及其制备方法，本发明的脐带干细胞储存液中脯氨酸具有低温保护作用，可以稳定细胞膜、蛋白质、核酸等生物活性物质，细胞内脯氨酸的存在可以增强细胞冻存的存活率，即在结冰过程中，细胞内脯氨酸的存在可减弱渗透压变化带来的破坏作用；聚肽-g-海藻糖具有膜扰动活性，与细胞膜相互作用可在细胞膜局部形成微孔，提高了细胞中脯氨酸载入量。聚肽-g-海藻糖与脯氨酸、半乳糖搭配，在降温冷冻过程时，脯氨酸可以在细胞内外更有效地防止冰晶损伤，提高细胞冷冻的存活率，半乳糖的存在能够更大程度地改善上述作用，进一步改善冷冻效果。
附图说明
图1为本发明实施例脐带干细胞储存液中聚肽-g-海藻糖合成流程图。
图2为本发明实施例脐带干细胞储存液的细胞毒性和冷冻效果实验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，所述储存液包括聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为3％：97％；
所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.5mg/mL；
所述脯氨酸的浓度为0.25mol/L；
所述半乳糖的质量浓度为2w/v％；
所述聚肽-g-海藻糖的化学结构如式Ⅰ所示；
其中，n为25到40之间的整数；x，y，z均为大于0的整数，y≥z。
本实施例中聚肽-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)在装有磁力搅拌子的250mL单口烧瓶中，将10mmol聚谷氨酸(平均分子量3500)、80mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、100mL碳酸氢钠水溶液(0.42wt％)搅拌30分钟得到反应体系A；加入80mmolL-苯丙氨酸甲酯盐酸盐(L-Phe)于2522℃搅拌反应72小时；浓缩后透析袋规格Mw1000水透析72小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯；
(2)将250mmolNε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐(Cbz-L-Lys)、70mL碳酸氢钠水溶液(0.42wt％)搅拌30分钟，逐滴加入步骤(1)得到的全部聚谷氨酸酸接枝苯丙氨酸甲酯和250mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的混合水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；浓缩后透析袋规格Mw1500水透析72小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸；
(3)将150mmol羧基化海藻糖(Tre-COOH)、150mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、150mmolN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于70mL水中搅拌30分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入步骤(2)得到的全部聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸的水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为2000Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖；羧基化海藻糖的分子结构为：
(4)加入氢氧化钠乙醇溶液(5wt％,30m L)于2522℃搅拌8小时，脱去苄氧羰基、酯基，还原羧基保护的聚肽-g-海藻糖，得到聚肽-g-海藻糖。
羧基化海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(a)在三口烧瓶中加入20mg/mL的160mL海藻糖无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，放入80℃加热，通氮气，磁子搅拌；
(b)加入20mL的50mg/mL丁二酸酐无水N,N’-二甲基乙酰胺(DMF)溶液，加入1.5mL三乙胺混合；
(c)三口瓶密封，80℃下反应12h；
(d)反应结束后减压蒸馏出DMF，浓缩溶液少于35mL后用过量乙醚沉淀产物；
(e)再次用少量无水DMF溶解沉淀产物后用过量乙醚沉淀纯化，将沉淀物不高于50℃干燥，得到乳白色泡沫状固体，即为羧基化海藻糖。
实施例2
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，本实施例与实施例1的唯一区别为：(3)将100mmol羧基化海藻糖、150mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、150mmolN-羟基琥珀酰亚胺溶于70mL水中搅拌30分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入步骤(2)得到的全部聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸的水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为2000Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖。
实施例3
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，本实施例与实施例1的唯一区别为：(3)将120mmol羧基化海藻糖、150mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、150mmolN-羟基琥珀酰亚胺溶于70mL水中搅拌30分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入步骤(2)得到的全部聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸的水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为2000Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖。
实施例4
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，本实施例与实施例1的唯一区别为：(3)将180mmol羧基化海藻糖、180mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、180mmolN-羟基琥珀酰亚胺溶于70mL水中搅拌30分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入步骤(2)得到的全部聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸的水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为2000Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖。
实施例5
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，本实施例与实施例1的唯一区别为：(3)将200mmol羧基化海藻糖、200mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、200mmolN-羟基琥珀酰亚胺溶于70mL水中搅拌30分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入步骤(2)得到的全部聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸的水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为2000Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖。
实施例6
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，本实施例与实施例1的唯一区别为：所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.1mg/mL。
实施例7
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，本实施例与实施例1的唯一区别为：所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.2mg/mL。
实施例8
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，本实施例与实施例1的唯一区别为：所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.8mg/mL。
实施例9
作为本发明实施例的一种脐带干细胞储存液，本实施例与实施例1的唯一区别为：所述聚肽-g-海藻糖的浓度为1.0mg/mL。
对比例1
作为本发明对比例的一种脐带干细胞储存液，本对比例与实施例1的唯一区别为：所述储存液包括聚肽-g-海藻糖、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为3％：97％；
所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.5mg/mL；
所述半乳糖的质量浓度为2w/v％。
对比例2
作为本发明对比例的一种脐带干细胞储存液，本对比例与实施例1的唯一区别为：所述储存液包括聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为3％：97％；
所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.5mg/mL；
所述脯氨酸的浓度为0.25mol/L。
对比例3
作为本发明对比例1的一种脐带干细胞储存液，本对比例与实施例1的唯一区别为：所述储存液包括脯氨酸、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为3％：97％；
所述脯氨酸的浓度为0.25mol/L；
所述半乳糖的质量浓度为2w/v％。
对比例4
作为本发明对比例的一种脐带干细胞储存液，本对比例与实施例1的唯一区别为：所述储存液包括聚肽、脯氨酸、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为3％：97％；
所述聚肽的浓度为0.5mg/mL；
所述脯氨酸的浓度为0.25mol/L；
所述半乳糖的质量浓度为2w/v％；
所述聚肽的结构式如式Ⅱ：
其中，n为25到40之间的整数；x，y均为大于0的整数。
本对比例中的聚肽的制备方法包括以下步骤：
(1)在装有磁力搅拌子的250mL单口烧瓶中，将10mmol聚谷氨酸(平均分子量3500)、80mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、100mL碳酸氢钠水溶液(0.42wt％)搅拌30分钟得到反应体系A；加入80mmolL-苯丙氨酸甲酯盐酸盐于2522℃搅拌反应72小时；浓缩后透析袋规格Mw1000水透析72小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯；
(2)将250mmolNε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐、70mL碳酸氢钠水溶液(0.42wt％)搅拌30分钟，逐滴加入步骤(1)得到的全部聚谷氨酸酸接枝苯丙氨酸甲酯和250mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的混合水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；浓缩后透析袋规格Mw1500水透析72小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸；
(3)加入氢氧化钠乙醇溶液(5wt％,30m L)于2522℃搅拌8小时，脱去苄氧羰基、酯基，还原羧基保护的聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸，得到聚肽。
对比例5
作为本发明对比例的一种脐带干细胞储存液，所述储存液包括聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为3％：97％；
所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.5mg/mL；
所述脯氨酸的浓度为0.25mol/L；
所述半乳糖的质量浓度为2w/v％；
所述聚肽-g-海藻糖的化学结构如式Ⅲ所示
其中，n为25到40之间的整数；x，y均为大于0的整数。
本对比例中聚肽-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)在装有磁力搅拌子的250mL单口烧瓶中，将250mmolNε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐、250mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、70mL碳酸氢钠水溶液(0.42wt％)搅拌30分钟，逐滴加入10mmol聚谷氨酸(平均分子量3500)水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；浓缩后透析袋规格Mw1500水透析72小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苄氧羰基-赖氨酸；
(2)将150mmol羧基化海藻糖、150mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、150mmolN-羟基琥珀酰亚胺溶于70mL水中搅拌30分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入步骤(1)得到的全部聚谷氨酸接枝苄氧羰基-赖氨酸的水溶液30mL，于2522℃搅拌反应72小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为2000Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖；羧基化海藻糖的分子结构为：
(3)加入氢氧化钠乙醇溶液(5wt％,30m L)于2522℃搅拌8小时，脱去苄氧羰基、酯基，还原羧基保护的聚肽-g-海藻糖，得到聚肽-g-海藻糖。
实验例
一、细胞膜扰动作用测试
(一)、细胞毒性试验
本实验采用小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞为细胞模型来评价脐带干细胞储存液的细胞毒性。采用的评价手段是Alamar Blue细胞毒性测试试剂盒。
首先两种细胞复苏后传代，用DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)全培养液(10％FBS，1％双抗)在5％CO2，37℃条件下，在培养瓶中培养24h，随后用胰蛋白酶消化处理培养的细胞，并通过低速(1000rpm)离心并收集细胞。将收集的细胞采用DMEM全培养液重悬后，在96孔板中接种细胞(1×104/孔)，并使用200μL DMEM全培养液，在5％CO2，37℃条件下培养24h；将配制好的脐带干细胞储存液与DMEM全培养液按照体积比1:1混合，使用0.22μm的滤膜过滤后加入96孔板中，置于细胞培养箱中分别孵育24h；吸除DMEM培养液，使用200μL磷酸缓冲盐溶液润洗细胞。使用DMEM全培养基避光配制10％(v/v)的AlamarBlue(AB)试剂(6.3m LDMEM细胞完全培养基，700μL AB试剂)，并根据AB试剂盒使用说明，加入孔板中(100μL/孔)，在细胞培养箱中避光培养4h；随后吸取上层液(50μL/孔)放入荧光测试酶标板中，4℃保存，使用酶标仪测定荧光强度I，测试条件为激发波长525nm，发射波长590nm。其中，不含有细胞粗存液的DMEM测试样品作为对照组，每个样品平行样3个，细胞存活率通过以下公式计算：
细胞存活率(％)＝荧光强度I样品/荧光强度空白对照×100％。
(二)、冷冻保存试验
1、实验材料：
人源脐带间充质干细胞株(HUCMSC)购自于美国Sciencell公司。
(1)细胞复苏：将保存于液氮中的脐带间充质干细胞冻存管取出，37℃恒温水浴解冻，用移液器将其转入含5ml PBS的15ml离心管中，1000rpm离心5min，弃去上清液，加入8mlMSC专用培养基，接种于10cm培养皿中，转入37℃、5％CO2的细胞培养箱培养，每间隔48h换液；
(2)细胞传代：当培养皿中细胞生长至90％融合的状态下，进行扩增传代，PBS润洗细胞，清除漂浮细胞和碎片，0.25％的胰蛋白酶消化处理，显微镜下观察，当细胞间隙增大，皱缩变圆时，用二倍于胰蛋白酶体积的培养基进行终止消化，收集悬浮细胞转移至15ml离心管中，离心处理5min，弃去上清液，培养基重悬细胞，按1：4比例进行传代培养；
(3)传代至第4代的间充质干细胞稳定性及免疫调节性最高，用于后续冷冻实验。
2、冷冻实验
将脐带间充质干细胞分别加入1mL实施例1-9、对比例1-5的冷冻液中，调整细胞浓度为5×106，3个平行样品，采用程序降温方法，在4℃保持1小时，-20℃保持1小时，降温至-80℃保存30天。
3、解冻程序
储存后的细胞样品以2℃/min的升温速率升温至-20℃，放入0℃冰水混合物中解冻20分钟，在37℃恒温培养箱解冻45分钟。
4、冷冻细胞存活率测试
冷冻保存细胞之前和之后使用流式评估细胞存活率。
流式评估细胞存活率，分析冷冻保存后的细胞存活率使用流式细胞仪。将100μl细胞等分试样重悬于添加100μg/ml培养液(DMSO(10％V)和胎牛血清蛋白(90％))。孵化后在室温下孵育3分钟，样品在流式细胞仪上运行，激光激发波长为488nm。
使用574/526nm带通滤波器收集发射。门控是对PI阴性(未处理)细胞和冷冻的细胞分别在含有150mM NaCl的100μg/ml培养液(DMSO(10％V)和胎牛血清蛋白(90％))中进行高电导率电穿孔。测量结果在获取10,000个事件时完成。获得的数据使用Attune NxT软件进行分析，其中冷冻细胞存活率通过荧光强度直方图评估。
5、实验结果如表1所示。
表1
由表1、图1可知，通过细胞毒性试验，比较实施例和对比例的结果，发现本发明的脐带干细胞储存液的细胞毒性很低。通过细胞冷冻实验结果，比较实施例和对比例可以说明，脯氨酸具有低温保护作用，可以稳定细胞膜、蛋白质、核酸等生物活性物质，细胞内脯氨酸的存在可以增强细胞冻存的存活率，即在结冰过程中，细胞内脯氨酸的存在可减弱渗透压变化带来的破坏作用。但脯氨酸的冷冻后存活率较低。本发明的脐带干细胞储存液中的聚肽-g-海藻糖具有膜扰动活性，与细胞膜相互作用可在细胞膜局部形成微孔，提高了细胞中脯氨酸载入量。聚肽-g-海藻糖与脯氨酸、半乳糖搭配，在降温冷冻过程时，脯氨酸可以在细胞内外更有效地防止冰晶损伤，提高细胞冷冻的存活率，半乳糖的存在能够更大程度地改善上述作用，进一步改善冷冻效果。通过比较实施例可知，步骤(3)中，羧基化海藻糖、聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸和摩尔比为(15～18)：1时，聚肽-g-海藻糖对细胞膜的扰动作用更强，且不会损伤细胞膜，脐带干细胞储存液的冷冻存活率更高。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种脐带干细胞储存液，其特征在于，所述储存液包括聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白；
所述储存液中各组分的比例如下：
所述1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白的体积比为(2％～4％)：(98％～96％)；
所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.1～1mg/mL；
所述脯氨酸的浓度为0.15～0.3mol/L；
所述半乳糖的质量浓度为1w/v％～3w/v％；
所述聚肽-g-海藻糖的化学结构如式Ⅰ所示；
其中，n为25到40之间的整数；x，y，z均为大于0的整数，y≥z。
2.根据权利要求1所述的脐带干细胞储存液，其特征在于，5≤x≤10，10≤z≤20。
3.根据权利要求1所述的脐带干细胞储存液，其特征在于，所述聚肽-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚谷氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、碳酸氢钠水溶液(0.4wt％-0.45wt％)搅拌25～40分钟得到反应体系A；加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐于20～30℃搅拌反应48～96小时；浓缩后透析袋规格Mw800～1500水透析48～96小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯；
(2)将Nε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐、碳酸氢钠水溶液(0.4wt％-0.45wt％)搅拌25～40分钟，逐滴加入聚谷氨酸酸接枝苯丙氨酸甲酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的混合水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；浓缩后透析袋规格Mw1200～1800水透析48～96小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸；
(3)将羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中搅拌25～40分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为1800Da～2200Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖；羧基化海藻糖的分子结构为：
(4)脱去苄氧羰基、酯基，还原羧基保护的聚肽-g-海藻糖，得到聚肽-g-海藻糖。
4.根据权利要求3所述的脐带干细胞储存液，其特征在于，所述步骤(1)中聚谷氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1：(5～10)：(5～10)。
5.根据权利要求3所述的脐带干细胞储存液，其特征在于，所述步骤(2)中Nε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、聚天冬氨酸接枝苯丙氨酸甲酯的摩尔比为(20～35)：(20～35)：1。
6.根据权利要求3所述的脐带干细胞储存液，其特征在于，所述步骤(3)中，羧基化海藻糖、聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(10～20)：1：(10～20)：(10～20)。
7.根据权利要求6所述的脐带干细胞储存液，其特征在于，所述所述步骤(3)中，羧基化海藻糖、聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸和摩尔比为(15～18)：1。
8.根据权利要求1所述的脐带干细胞储存液，其特征在于，所述聚肽-g-海藻糖的浓度为0.5～0.8mg/mL。
9.如权利要求1-8任一所述脐带干细胞储存液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(Ⅰ)制备聚肽-g-海藻糖；
所述聚肽-g-海藻糖的制备方法包括以下步骤：
(1)将聚谷氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、碳酸氢钠水溶液(0.4wt％-0.45wt％)搅拌25～40分钟得到反应体系A；加入L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐于20～30℃搅拌反应48～96小时；浓缩后透析袋规格Mw800～1500水透析48～96小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯；
(2)将Nε-苄氧羰基赖氨酸苄酯盐酸盐、碳酸氢钠水溶液(0.4wt％-0.45wt％)搅拌25～40分钟，逐滴加入聚谷氨酸酸接枝苯丙氨酸甲酯和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)的混合水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；浓缩后透析袋规格Mw1200～1800水透析48～96小时，冻干得到产物聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸；
(3)将羧基化海藻糖、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于水中搅拌25～40分钟活化得到羧基化海藻糖反应体系；加入聚谷氨酸接枝苯丙氨酸甲酯接枝苄氧羰基-赖氨酸水溶液，于20～30℃搅拌反应48～96小时；将反应后的产物透析，透析袋的规格为1800Da～2200Da，得到羧基保护的聚肽-g-海藻糖；羧基化海藻糖的分子结构为：
(4)脱去苄氧羰基、酯基，还原羧基保护的聚肽-g-海藻糖，得到聚肽-g-海藻糖；
(Ⅱ)将聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、半乳糖、1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白按比例混合。
10.根据权利要求9所述脐带干细胞储存液的制备方法，其特征在于，将1,2-丙二醇和胎牛血清蛋白按照体积比配置混合液，将聚肽-g-海藻糖、脯氨酸、半乳糖按照浓度加入混合液中混匀。
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