JPH0391491A - 血清アルブミンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 血清アルブミンは分子量は６９０００．等電点４．９の
、血漿タンパク質の中では量的に最も多い（５０〜６０
％）成分である。水に溶は易く、血中に現れる難溶性物
質（脂肪酸、胆汁色素、薬剤など）を結合して、これら
を運搬する役目を果たす。血漿膠質浸透圧の３／４はア
ルブミンに依存するので、組織から血管内への水分およ
び代謝産物の移動に大きく関与し、その濃度が減少する
と浮腫が発生する。アルブミンは肝細胞で合成されるこ
と、腎疾患に際して尿中に漏出しやすいこと、体タンパ
ク質の消耗を補うために利用されることから、肝硬変症
、低栄養、熱性疾患、ネフローゼなどが低アルブミン血
症を招来する代表的疾患である。これらの疾病の治療薬
として血清アルブミンは有効であり、本発明はこの血清
アルブミンの製造方法に関するものである。

（従来の技術） アルブミン製剤は現在、人血清より低温エタノール分画
法などで精製されている。

（発明が解決しようとする課題） このようにして精製されたアルブミン製剤は熱処理など
の滅菌操作を施しているが、ＡＩＤＳ。

その他ウィルス感染の危険性が、全くなくなったわけで
はない。また従来、酵素やホルモンの研究に頻用されて
いる初代肝細胞の単層培養肝細胞法については、長期に
わたる機能維持については問題点が多い。つまり、アル
ブミン等の分泌物質の生合成、分泌量が生体内のそれに
比較して非常に低値を示すからであり、また、長期間培
養するには形質転換を起こしたいわゆるガン化した肝細
胞を用いれば継代できて目的に適うが、正常の肝細胞が
本来持つ分化機能を喪失している場合が多く、機能維持
に大きな問題が残る。

（課題を解決するための手段） この問題を解決すべく、本発明者らは鋭意検討した結果
、球状培養肝細胞を用いることで、この問題を解決でき
ると考え、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、球状培養肝細胞を培養し、該細胞及び／
又は培地から血清アルブミンを精製することを特徴とす
る血清アルブミンの製造方法である。

肝細胞は、成熟動物の新鮮な肝臓から無傷の肝実質細胞
を得ればよく、その動物９手法については特に限定しな
い。例えば、動物を麻酔下に開腹し、門脈内にカニユー
レを挿入し、前かん流した後０．０５％コラゲナーゼ液
によりかん流して肝細胞を分散し、低速遠心により実質
細胞を分離することができる。

使用する培地は、通常動物細胞の初代培養に用いられて
いるものを用いれば良い。特に後の工程で精製の容易な
無血清培地を用いることが好ましい。具体的には、ウィ
リアムズＥ培地にインシュリンｌＯμｇ／ｍ１．グルカ
ゴンｌＯμｇ／ｓ　ｌ　、上皮成長因子５０ｎｇ／ｍ１
．プロラクチン２０ｍＵ／ＩＩ！、成長ホルモン１０μ
υｌ−１，銅０．１μＭ、セレニウム３μ旧亜鉛５０９
Ｍを添加した無血清培地を例示することができる。

培養容器は、基材としてポリスチレン製のものを用いて
コラーゲン等の細胞接着のための基質を塗布していない
もの、又は、強い陰性荷電を有しないものであれば良い
。具体的には、ファルコンプライマリアディッシュ（ベ
クトン＆ディッキンソン社製）等を例示することができ
る。

培養する細胞の初濃度は１０’個／ｌＩｌからｉｏ６個
／ｓｌまでの範囲が望ましい。

以上、記した培養液と培養容器を用いて肝細胞を公知の
方法で炭酸ガスインキュベーター内５％Ｃ０２９５％ａ
ｌｒの雰囲気下で培養する。この際の肝細胞は、細胞が
球状に集合して浮遊した細胞塊を生成するので、その球
状培養肝細胞を培養し、該細胞及び／又は培地から血清
アルブミンを精製すればよい。培養方法は特に限定され
ないが、例えば、前述の方法や、特願昭６３−１０５５
１９゜６３−１２７０２３に記載の方法も用いることが
できる。培養時間は、培養条件により左右されるが、約
２週間で培地から高収量の血清アルブミンを得ることが
できる。

培養上滑中の血清アルブミンの測定方法は、例えば球状
肝細胞培養中の培地を１１００Ｏｒｐ、５分間遠心した
上清をサンプルとし、沈殿した細胞は、等量の新鮮な培
地に懸濁して培養デイツシュ中に戻して用いればよい。

サンプルは、抗アルブミン血清と酵素標識抗アルブミン
血清とを用いたサンドイッチ酵素免疫測定法により測定
することができる。

球状培養肝細胞及び／又は培地から血清アルブミンを精
製する方法には特に限定は無く、例えばゲル濾過、低温
エタノール沈殿、アフィニティークロマトグラフィー等
の公知の方法を用いて精製することができる。

（発明の効果） 本発明により、球状培養肝細胞を用いた血清アルブミン
の製造が可能となった。これにより、血清を用いず、ウ
ィルス等の混入のない血清アルブミンを高い収量で製造
することができる。

（実施例） 以下、本発明を実施例にてさらに詳細に説明するがζ本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ ２００〜２５０ｇの成熟ラットをネンブタール麻酔下に
開腹し、肝臓門脈内に挿入したカニユーレよりカルシウ
ムイオンを含まないハンクス液で前かん流を行った。０
．０５％コラゲナーゼ液により６〜８分かん流を行った
。その後肝細胞は分散させ分離して５０Ｘｇ、１分間の
低速遠心を３回行って非実質細胞を除去した。ウィリア
ムズＥ培地にインシュリン１０μｇ／ｍ１．グルカゴン
１０μｇ／ｍｌ、上皮成長因子５０ｎｇ／ｍｌ、プロラ
クチン２０ｍＵ／ｍｌ、成長ホルモン１０μＵ／ｌＩ１
．銅０．１μＨ，セレニウム３μＨ１亜鉛５０９Ｍを添
加した無血清培地（以下ＨＤＭと略す）　２５ｆｌｌｌ
あたりに上記の肝細胞１．２５Ｘ　１０’個を浮遊させ
、これをプライマリアポトル（ベクトン＆ディッキンソ
ン社製）内で炭酸ガスインキュベーター中５％Ｃ０２９
５％ａｉｒの雰囲気下で培養した。培養１日後に、細胞
が球状に集合し浮遊した塊が形成されるので、これを用
いて次の実験を開始した。

実施例２ （サンプルの調製） 実施例１で培養した球状培養肝細胞を培養１週間ごとに
培地２５ｓ　Ｉすべてを遠心管にとり１１０００ｒｐ。

１分間遠心後の上清をサンプルとした。沈殿した細胞は
等量の新鮮なＨＤＭ培地に懸濁して培養ボトル中に戻し
た。

（ラットアルブミン測定プレートの作製）タンク９６ウ
エルイムノプレート（インターメッド社製）に、抗ラッ
トアルブミン抗体（カッベル社）を炭酸緩衝液’（ｐＨ
９，５）に溶解して２００ｎｇ　／ウェルになるように
分注し、３７℃で２時間静置した。ウェルに残っている
溶液を除去し、リン酸緩衝液に０．０４％ツイーン２０
を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、１
％スキムミルクを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｍを
各ウェルに加えて３７℃で２時間ブロッキング処理した
。つぎに各ウェルにサンプルを１００μｍずつ分注し３
７℃で２時間静置した。これらのウェルをＰＢＳ−Ｔで
３回洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗ラットアルブ
ミン抗体　（カッペル社製）　１００００倍希釈を１０
０μｌ／ウエルずつ分注し、３７℃で２時間静置した。

ＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、基質溶液１．２％２
，２−アジノジー（３−エチルベンズチアゾリン硫酸）
−ジアンモニウム塩および０．０１％過酸化水素（Ｈ２
Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐｉ（５，
１）を各ウェルに１００μｉずつ添加した。３０分間室
温放置し、２００ｓ＋Ｍシュウ酸緩衝液１００μｍを加
えて酵素反応を停止させた。上記プレートを各ウェルに
ついて、波長４１５ｎｆｆｉ、対照波長４９２■の吸光
度を自動マイクロタイタープレートリーダー（東ソー（
株）製、ＭＰＲ−Ａ４）で測定し、ラットアルブミン（
カッペル社製）を標準サンプルとして培地中のアルブミ
ン濃度を算出した。

（結果） 球状培養肝細胞は、培地中に培養後０〜７日で０．９３
μｇ、７〜１４日で１．６０μｇ、１４〜２１日で１．
４２μｇ　、　２１〜３１日で０．５８μｇのアルブミ
ンを分泌した。

実施例３ （培養土清中血清アルブミンの精製） （１）サンプル培養上清の調製 実施例１の方法（ＨＤＭ２５Ｉｌｌあたりに肝細胞１．
２５Ｘ　１０’個を球状培養した）で４本のプライマリ
アポトルに１４日間培養し、この培地を遠心管に集め、
１０００ｒｐｉ、１分間遠心後の上清をサンプルとした
。

（２）　ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　４Ｂ　ヘの抗ラットアルブミン抗体のカップリ
ング ０．３ｇのＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅ　４Ｂ　　（ファルマシア社製）に約１ｍｌの
イオン交換水を加えてゲルを膨潤させ、次にグラスフィ
ルター上でｉ　ｎ＋ＭＨＣＩによる洗浄とイオン交換水
による膨潤を繰り返した。

このゲルをカップリング用緩衝液（０，５ＭＮａＣ１を
含む０．１Ｍ、ｐｌ＋８．３のＮａＨＣＯｉ溶液）で洗
浄し、次にカップリング用緩衝液に抗ラットアルブミン
抗体（カッベル社）を８ｍｇ／ｍ　＋の濃度で溶解し、
１ｍｌをゲルに加え室温で２時間攪拌した。

ゲルをブロッキング試薬（１Ｍエタノールアミン、ｐ）
１８．０）に移し、室温で２時間、放置した。

ゲルをカップリング用緩衝液で洗浄し、次に酢酸緩衝液
（０，５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．１Ｍ、　ｐｌ＋４）で
洗浄し１、更にカップリング用緩衝液で洗浄した。

（３）サンプルの添加及びラットアルブミンの溶出 ゲルをカラム（内径８ｓ１１．長さ５０１）に充填し０
．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化した。（
１）で調製した培地の上清サンプル（以下、Ａとする）
約２００１１を１０ｓｌ／ｈの流速でカラムに添加した
。

３倍容量の０．５ＭのＮａＣｌを含む０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）で洗浄した後（溶出液をＢとする
）、０、１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３，０）で溶
出した（溶出液をＣとする）。

各段階での溶液Ａ−Ｃを限外濾過により１ｍｌまで濃縮
し、その中に含まれる蛋白質濃度をＩｏｖｒｙ法により
測定し、アルブミン濃度については酵素免疫測定法によ
り測定した。ただし、０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（
ｐｎａ、ｏ）での溶出画分については固形のトリスを加
えてｐＨを７．２に戻してから濃縮を行った。

この方法により精製されたアルブミン（溶出液Ｃ由来）
を電気泳動（５Ｏ８−ＰＡＧＥ）すると、分子量６８０
００の位置に単一のバンドを確認することができた。

以下に、この実施例の測定結果と回収率を示す。

抗うットアルブミ ン抗体固相化 ５ｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂ による培地中ラットアルブミ ンの溶出結果

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 球状培養肝細胞を培養し、該細胞及び／又は培地から血
   清アルブミンを精製することを特徴とする血清アルブミ
   ンの製造方法。