CN114736855B - 一种干细胞外泌体高纯度提取方法 - Google Patents

一种干细胞外泌体高纯度提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干细胞外泌体高纯度提取方法，包括以下步骤：(1)收集外泌体原液；(2)外泌体稳定：将步骤(1)获得的外泌体原液与PEG混合后，使得PEG的浓度在1.6％至2.5％之间，孵育1～3h,获得稳定的外泌体交联体系；(3)外泌体保护：在步骤(2)中获得的外泌体交联体系中，加入蔗糖溶液使的体系中蔗糖浓度在10％至15％，获得外泌体超速离心体系；(4)富集提纯：将步骤(3)中获得的外泌体一次或反复多次超速离心进行富集，获得提纯的外泌体沉淀。本发明采用PEG交联成网状，附着外泌体；通过加入蔗糖溶液进行外泌体保护，避免了外泌体在超速离心过程中遭到地破坏，从而稳定外泌体、提高外泌体提取物的纯度。

Description

一种干细胞外泌体高纯度提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种干细胞外泌体高纯度提取方法。
背景技术
干细胞是来自于胚胎、胎儿或成人体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能产生组成机体组织、器官的已特化的细胞，同时还能分化为祖细胞。干细胞在生命科学的细胞修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景，对于发育研究、基因功能研究有着重要意义，同时可作为疾病基因治疗的载体、作为药物筛选平台等等。研究表明，干细胞的外泌体，包括重要的调控信号，例如miRNA，具有调节细胞节律如免疫、细胞周期的重要功能。
人脐带间充质干细胞(HUC-MSCs)是典型的成体干细胞之一；与其他来源的干细胞相比，它们具有免疫原性低、易于体外扩增、无创性获取和伦理获取等优点。因此，HUC-MSCs是一种很有前途的细胞治疗用干细胞来源。早期研究显示人脐带间充质干细胞参与许多重要的生物学功能，如归巢、转分化和免疫调节。最近的研究表明，MSCs的旁分泌作用通过外泌体(分泌外囊泡)在细胞修复和再生中起到了重要作用。
作为一种囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)，外泌体(Exosomes)其大小为30-150nm，具有双层膜结构和茶托状形态，含有丰富的内含物(包括核酸、蛋白和脂质等)，参与细胞间的分子传递。外泌体广泛存在于细胞培养上清以及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁等，同时也存在于组织样本中，如脐带组织、肌肉组织、脂肪组织、胎盘组织、脑组织。
目前,分离外泌体最常用的提取方法为超速离心法、色谱法、以及密度梯度离心法。其中，密度梯度离心效率过低、色谱法成本太高，二者都难以大规模生产。超速离心法是最有希望的工业化适合大规模生产的外泌体提取方法。然而，超速离心法得到的外泌体的量还较少，纯度也不高。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种干细胞外泌体高纯度提取方法，其目的在于通过采用PEG交联网状结构稳定外泌体，并采用蔗糖溶液进行外泌体保护，可承受更多次、更高效的超速离心进行外泌体提纯，从而获得更高纯度、质量更稳定的干细胞外泌体，由此解决现有的超速离心发提纯外泌体纯度不高、外泌体遭到超速离心破坏导致稳定性不佳的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种干细胞外泌体高纯度提取方法，其包括以下步骤：
(1)收集外泌体原液；
(2)外泌体稳定：将步骤(1)获得的外泌体原液与PEG混合后，使得PEG的浓度在1.6％至2.5％之间，孵育1～3h,获得稳定的外泌体交联体系；
(3)外泌体保护：在步骤(2)中获得的外泌体交联体系中，加入蔗糖溶液使的体系中蔗糖浓度在10％至15％，获得外泌体超速离心体系；
(4)富集提纯：将步骤(3)中获得的外泌体一次或反复多次超速离心进行富集，获得提纯的外泌体沉淀。
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其还包括以下步骤：
(5)清洗保存：将步骤(4)中获得的提纯的外泌体沉淀，采用海藻糖或PBS清洗并重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体保存。
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其采用海藻糖重悬。
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其步骤(5)所述清洗条件：110000g，2-6℃离心1-2h；重悬条件：2000g，4℃离心10-20min。
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其步骤(1)具体为：收集干细胞培养液上清，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液，优选在相对离心力200g～300g下离心8-10分钟去除细胞碎片。
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其步骤(2)控制孵育温度在2～6℃，使得PEG分子交联成网状结构。
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其步骤(2)所述PEG溶液浓度在5％至10％，
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其步骤(2)所述PEG分子量在4000到6000。
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其步骤(3)所述蔗糖溶液浓度在30％至50％。
优选地，所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其步骤(4)所述超速离心条件2-6℃、110000g低温离心1-2h。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明采用PEG交联成网状，附着外泌体；通过加入蔗糖溶液进行外泌体保护，在此基础之上进行超速离心富集并提纯外泌体，尽可能地避免了外泌体在超速离心过程中遭到地破坏，从而稳定外泌体、减少超速离心的机械损伤导致外泌体破裂带来的碎片，提高外泌体提取物的纯度。
该方法还可用于大规模生产的外泌体分离，以及从其他细胞类型中分离超纯囊泡，用于下游蛋白质和RNA分析。此外，这种从人脐带间充质干细胞中分离外泌体的方法保证了使用高纯度的膜结合外泌体进行进一步的临床前和临床研究及应用。
附图说明
图1BCA法测定外泌体总蛋白浓度标准曲线；
图2是实施例培养的初代人脐带间充质干细胞形态图；其中图A为初代人脐带间充质干细胞复种后培养第7天时的细胞状态图表达细胞，表达细胞从脐带爬出，生长良好；图B属于初代人脐带间充质干细胞复种后培养第14天时的细胞状态图，初代人脐带间充质干细胞形态图复种后培养第14天时的细胞状态图，表达细胞生长好也长的比较快；
图3是实施例培养的P2代脐带间充质干细胞形态图；其中图A为P2代脐带间充质干细胞培养24h时的细胞状态图；图B为P2代脐带间充质干细胞培养3天的细胞状态图；图C为P2代脐带间充质干细胞培养6天的细胞状态图，显示P2代脐带间充质干细胞生长状态良好；
图4是P2代脐带间充质干细胞表面标志物CD90的流式细胞鉴定图；
图5是P2代脐带间充质干细胞表面标志物CD34的流式细胞鉴定图；
图6是实施例培养的P2代到P5代脐带间充质干细胞外泌体电镜照片；其中图A是P2代脐带间充质干细胞外泌体电镜照片，图B是P5代脐带间充质干细胞外泌体电镜照片；
图7是实施例及对比提取的外泌体总RNA(A260/A280)的纯度。
图8是实施例外泌体蛋白CD63表达水平鉴定凝胶电泳WB照片；
图9是分别采用PBS和海藻糖进行外泌体重悬在4℃保存后的蛋白水平。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明提供的干细胞外泌体高纯度提取方法，包括以下步骤：
(1)收集外泌体原液：收集干细胞培养液上清，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液；例如收集细胞融合度为85％～95％的人脐带间充质干细胞培养液上清；在相对离心力200g～300g下离心8-10分钟去除细胞碎片；
(2)外泌体稳定：将步骤(1)获得的外泌体原液与PEG按照体积比1:0.5～1混合后，使得PEG的浓度在1.6％至2.5％之间，孵育1～3h，控制孵育温度在2～6℃，使得PEG分子交联成网状结构，外泌体附着于其上，获得稳定的外泌体交联体系；PEG溶液在此浓度及孵育温度下有良好的交联性能；所述PEG溶液浓度在5％至10％，优选所述PEG分子量在4000到6000；
(3)外泌体保护：在步骤(2)中获得的外泌体交联体系中，加入蔗糖溶液使的体系中蔗糖浓度在10％至15％，用作缓冲液以保护超速离心过程中对外泌体产生的机械损伤，获得外泌体超速离心体系；所述蔗糖溶液浓度在30％至50％；
(4)富集提纯：将步骤(3)中获得的外泌体一次或反复多次超速离心进行富集，获得提纯的外泌体沉淀，其中：
超速离心条件2-6℃、110000g低温离心1-2h；
(5)清洗保存：将步骤(4)中获得的提纯的外泌体沉淀，采用海藻糖或PBS清洗并重悬，优选采用海藻糖重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体保存；短期保存置于2-8℃，一周保存置于-80℃。
清洗条件：110000g，2-6℃离心1-2h；
重悬条件：2000g，4℃离心10-20min。
本发明基于蔗糖的密度和缓冲特性，建立了一种改良的一步PEG基溶与蔗糖缓冲超速离心法分离外泌体，并与普通超速离心法进行了比较，以获得更高的产率、更高的外泌体完整性和蛋白质纯度。对分离出的外泌体的大小、形态、产量和表面标记蛋白表达进行了表征。此方法不同于先前发表的通过30％蔗糖密度超速离心进一步纯化超速离心法分离的预富集外泌体的方法。假设当使用蔗糖缓冲超速离心进行第二步处理时，超速离心法的低产量外显体将进一步减少。
以下为实施例：
干细胞外泌体具有特定的大小量级，以及类似的提取方法，实施例及对比例中皆以人脐带间充质干细胞为例，脐带间充质干细胞的外泌体原液按照如下方法获取：
1)人脐带间充质干细胞的培养
在无菌条件下，将10～15cm脐带组织剪为脐带组织碎块，生理盐清洗两遍，清洗时先用止血钳夹紧固定脐带扎线位置，另一止血钳从固定位置外开始顺着脐带清洗到另一端，测量脐带长度记录，采集并取2ml脐带保存液送支原体，内毒素检测。洗涤脐带后，移入新培养基中，移入加有过滤的75％医用酒精培养中，浸没整根脐带，浸泡2min,消毒处理后，移入加有生理盐水的培养血中，再重复清洗2-3次，将脐带剪切为2cm～3cm组织块，去除脐动脉和脐静脉，剥离脐带胶质，然后再将剥离脐带胶质的组织块剪碎成1mm3～3mm3并放入加有5-10ml生理盐水中的培养血中。将得到的胶体转移至50ml离心管，并加生理盐水定容至45ml,在840g离心6分钟。每瓶先加入4ml完全培养基再将1-2mm3组织匀T75培养瓶，。平置培养瓶使组织尽量均匀分布于整个低面并放到饱和水份37℃、5％CO2的培养箱中培养。
培养到第5天之后，每隔3天进行全量换液，等P0代脐带间充质干细胞融合度为85％～90％时，进行p1的传代，持续传代操作，获得二次贴壁细胞的P2代到P5代，检测结果如表1所示。镜检结构如图2、图3所示。
表1脐带间充质干细胞传代培养结果
其中每一代通过SDA平板法、支原体液体培养法、鲎试剂检测法分别检测各培养上清中的细菌、支原体、细菌内毒素，确定培养上清中细菌、支原体、细菌内毒素的含量符合行业标准之后进行下一步纯化。
2)人脐带间充质干细胞的鉴定
为了验证人脐带间充质干细胞的表面标志特征，将P2的脐带间充质干细胞进行流式检测，用PBS漂洗，离心去上清液，加入PBS重悬后分装，分别加入PE标记的鼠抗人CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105和同型对照，鉴定细胞表型，结果如图表2所示。
表2间充质干细胞流式检测结果
标志物CD90的流式细胞鉴定图如图4所示，标志物CD34的流式细胞鉴定图如图5所示。
由表2和可知本研究P2由于脐带间充质干细胞表达可以表达CD90、但不表达CD34已经符合人脐带间充质干细胞的表面标志特征。
3)脐带间充质干细胞来源的外泌体原液的制备
1-细胞融合度为85％～95％时，收集培养上清；在相对离心力300g的条件下用0.22μm滤器过滤提取的上清液，将得到上清液继续离心去除完整细胞和死细胞。
2-获得上清液继续离心去除沉淀获得上清液。
P2代与P5代脐带间充质干细胞外泌体电镜照片如图6所示。
实施例1
一种干细胞外泌体高纯度提取方法，包括以下步骤：
(1)收集外泌体原液：将获得的上清用0.22μm滤器进行微滤，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液。
(2)外泌体稳定：加入外泌体原液体积相当(1倍)的浓度为5％的PEG6000溶液与上清混合，低温孵育2h，孵育温度在4℃，获得外泌体交联体系；
(3)外泌体保护：加入蔗糖溶液用于缓冲机械力，体系中蔗糖浓度为15％，混合均匀，获得外泌体超速离心体系；
(4)富集提纯：放入超速离心机4℃、110000g低温离心2h，得到外泌体沉淀；
(5)清洗保持：将脐带间充质干细胞的外泌体用预冷的PBS清洗并放入超速离心机离心，110000g，低温离心2h，进一步去除超过140nm的囊泡，弃PBS上清,将沉淀用海藻糖溶液重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液标记后储存。
外泌体短期保存置于4℃保存即可,一周以上长期不用时置-80保存。
留取30μl重悬液用于透射电镜观察和10μl用于BCA浓度测定，其余重悬液标记浓度，分装后-80℃储存。
实施例2
一种干细胞外泌体高纯度提取方法，包括以下步骤：
(1)收集外泌体原液：将获得的上清用0.22μm滤器进行微滤，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液。
(2)外泌体稳定：加入外泌体原液体积相当(1倍)的浓度为5％的PEG6000溶液与上清混合，低温孵育1h，孵育温度在4℃，获得外泌体交联体系；
(3)外泌体保护：加入蔗糖溶液用于缓冲机械力，体系中蔗糖浓度为10％，混合均匀，获得外泌体超速离心体系；
(4)富集提纯：放入超速离心机4℃、110000g低温离心2h，得到外泌体沉淀；
(5)清洗保持：将脐带间充质干细胞的外泌体用预冷的PBS清洗并放入超速离心机离心，110000g，低温离心2h，进一步去除超过140nm的囊泡，弃PBS上清,将沉淀用海藻糖溶液重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液标记后储存。
外泌体短期保存置于2-8℃保存即可,一周以上长期不用时置-80保存。
留取30μl重悬液用于透射电镜观察和10μl用于BCA浓度测定，其余重悬液标记浓度，分装后-80℃储存。
实施例3
一种干细胞外泌体高纯度提取方法，包括以下步骤：
(1)收集外泌体原液：将获得的上清用0.22μm滤器进行微滤，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液。
(2)外泌体稳定：加入外泌体原液体积1/2的浓度为5％的PEG6000溶液与上清混合，低温孵育1h，孵育温度在2～6℃，获得外泌体交联体系；
(3)外泌体保护：加入蔗糖溶液用于缓冲机械力，体系中蔗糖浓度为10％，混合均匀，获得外泌体超速离心体系；
(4)富集提纯：放入超速离心机4℃、110000g低温离心1h，得到外泌体沉淀；
(5)清洗保持：将脐带间充质干细胞的外泌体用预冷的PBS清洗并放入超速离心机离心，110000g，低温离心1h，进一步去除超过140nm的囊泡，弃PBS上清,将沉淀用海藻糖溶液重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液标记后储存。
外泌体短期保存置于2-8℃保存即可,一周以上长期不用时置-80保存。
留取30μl重悬液用于透射电镜观察和10μl用于BCA浓度测定，其余重悬液标记浓度，分装后-80℃储存。
对比例1至3采用传统超速离心法提纯外泌体
将获得外泌体原液放入超速离心机离心，110000g，4℃离心-120min，弃上清，用预冷的PBS清洗获得的沉淀，得到的脐带间充质干细胞的外泌体用PBS清洗并放入超速离心机离心，110000g，4℃离心-70min。
用预冷的PBS清洗获得的沉淀，将沉淀放入弃上清，沉淀用预冷的PBS重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液标记后储存，步骤同实施例1至3。
留取30μl重悬液用于透射电镜观察和10μl用于BCA浓度测定，其余重悬液标记浓度，分装后-80℃储存
对比例4
一种干细胞外泌体高纯度提取方法，包括以下步骤：
(1)收集外泌体原液：将获得的上清用0.22μm滤器进行微滤，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液。
(2)外泌体稳定：加入外泌体原液体积1/4的浓度为5％的PEG4000溶液与上清混合，低温孵育2h，孵育温度在4℃，获得外泌体交联体系；
(3)外泌体保护：加入葡萄糖用于缓冲机械力，体系中葡萄糖浓度为15％，混合均匀，获得外泌体超速离心体系；
(4)富集提纯：放入超速离心机4℃、110000g低温离心2h，得到外泌体沉淀；
(5)清洗保持：将脐带间充质干细胞的外泌体用预冷的PBS清洗并放入超速离心机离心，110000g，低温离心2h，进一步去除超过140nm的囊泡，弃PBS上清,将沉淀用海藻糖溶液重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液标记后储存。
外泌体短期保存置于2-8℃保存即可,一周以上长期不用时置-80保存。
留取30μl重悬液用于透射电镜观察和10μl用于BCA浓度测定，其余重悬液标记浓度，分装后-80℃储存。
对比例5
采用葡萄糖保护的干细胞外泌体高纯度提取方法，包括以下步骤：
(1)收集外泌体原液：将获得的上清用0.22μm滤器进行微滤，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液。
(2)外泌体稳定：加入外泌体原液体积相当(1倍)的浓度为5％的PEG6000溶液与上清混合，低温孵育1h，孵育温度在4℃，获得外泌体交联体系；
(3)外泌体保护：加入葡萄糖用于缓冲机械力，体系中葡萄糖浓度为15％，混合均匀，获得外泌体超速离心体系；
(4)富集提纯：放入超速离心机4℃、110000g低温离心1h，得到外泌体沉淀；
(5)清洗保持：将脐带间充质干细胞的外泌体用预冷的PBS清洗并放入超速离心机离心，110000g，低温离心1h，进一步去除超过140nm的囊泡，弃PBS上清,将沉淀用海藻糖溶液重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液标记后储存。
外泌体短期保存置于2-8℃保存即可,一周以上长期不用时置-80保存。
留取30μl重悬液用于透射电镜观察和10μl用于BCA浓度测定，其余重悬液标记浓度，分装后-80℃储存。
对上述对比例以及实施例提取的脐带间充质干细胞的外泌体进行检测，步骤如下：
Trizol-沉淀法提取外泌体总RNA
1-取适量样本于1.5mL离心管中，加入1mLTrizol，充分振荡混匀样品，室温静置5min；
2-加入200μL氯仿，剧烈振荡混匀30s，室温静置3-5min；
3-4℃，12000rpm离心15min；
4-吸取上层水相至另一离心管中，加入等体积异丙醇，过夜沉淀；
5-弃上清，加入DEPC-H2配置的75％乙醇洗涤沉淀；
6-4℃，7500rpm离心5min；
7-晾干沉淀
8弃上清，加入30μLDEPC-H20溶解·沉淀(H20、TE或0.5％SDS均须用DEPC处理并高压灭菌)
RNA纯度测定
1检查Thermo Nanodrop 2000C分光光度计的仪器和电脑端相对应的，取1μl高压灭菌的去离子水清洗检测孔3次
2调零：用1μl高压灭菌的去离子水点样。
3接着取1μl刚刚溶解的RNA溶液上机检测，可以直接获得浓度。
4判断标准：若A260/A280>2.2，则表明RNA已水解成单核酸；若A260/A280<1.8，则表明RNA中蛋白或者其他有机物的污染很严重；若1.8<A260/A280<2.0，则认为蛋白或其他有机物的污染在可以接受的范围内.
实施例与对比例的总蛋白测试绘制的标准曲线如图1所示，总蛋白测试结果如下表3所示：
表3总蛋白测试结果
实施例与对比例的RNA纯度测定结果如下表4所示，统计结果如图7所示：
表4 RNA纯度测定结果
外泌体蛋白CD63表达水平鉴定凝胶电泳WB照片如图8所示。
根据表4的纯度显示以及图7至8的测定结果，本发明提供的干细胞外泌体高纯度提取方法，相对于传统超速离心法能有效保护外泌体，避免超速离心带来的外泌体破裂，外泌体纯度、蛋白表达量皆明显改善。另外，由对比例4和对比例5显示，PEG的含量和保护剂的种类皆明显影响外泌体提纯的效果，尤其是PEG的含量，含量过低可能会相反导致外泌体RNA纯度降低。
本发明提取的外泌体，优选采用海藻糖进行重悬，其保存效果与PBS重悬的保存效果比较如图9所示。海藻糖的保存效果显著优于PBS的保存效果。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)收集外泌体原液；
(2)外泌体稳定：将步骤(1)获得的外泌体原液与PEG混合后，使得PEG的浓度在1.6％至2.5％之间，孵育1～3h,获得稳定的外泌体交联体系；
(3)外泌体保护：在步骤(2)中获得的外泌体交联体系中，加入蔗糖溶液使的体系中蔗糖浓度在10％至15％，获得外泌体超速离心体系；
(4)富集提纯：将步骤(3)中获得的外泌体一次或反复多次超速离心进行富集，获得提纯的外泌体沉淀；步骤(4)所述超速离心条件2-6℃、110000g低温离心1-2h。
2.如权利要求1所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，还包括以下步骤：
(5)清洗保存：将步骤(4)中获得的提纯的外泌体沉淀，采用海藻糖或PBS清洗并重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体保存。
3.如权利要求2所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，采用海藻糖重悬。
4.如权利要求2所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，步骤(5)所述清洗条件：110000g，2-6℃离心1-2h；重悬条件：2000g，4℃离心10-20min。
5.如权利要求1所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：收集干细胞培养液上清，去除细胞碎片及杂质，获得外泌体原液，优选在相对离心力200g～300g下离心8-10分钟去除细胞碎片。
6.如权利要求1所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，所述步骤(2)控制孵育温度在2～6℃，使得PEG分子交联成网状结构。
7.如权利要求1所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，步骤(2)所述PEG溶液浓度在5％至10％，
8.如权利要求1所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，步骤(2)所述PEG分子量在4000到6000。
9.如权利要求1所述的干细胞外泌体高纯度提取方法，其特征在于，步骤(3)所述蔗糖溶液浓度在30％至50％。
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