CN112641803A - 一种干细胞外泌体制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干细胞外泌体制剂，包括：间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞、人血白蛋白以及生理盐水，所述间充质干细胞外泌体为从人脐带间充质干细胞提取出来的外泌体，一种干细胞外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：S1：人脐带间充质干细胞的培养；S2：间充质干细胞外泌体的制备；S3：干细胞外泌体制剂的制备。本发明向人血白蛋白溶液中加入间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞制得干细胞外泌体制剂，得到的外泌体制剂能够显著提高脐带静脉内皮细胞的增值以及迁移能力，促进血管的生成，与细胞治疗相比，外泌体的性质更加稳定，保存运输更加方便，采用传统差速超速离心法提取外泌体，纯度较高，成本较低。
Description
技术领域
本发明属于医疗领域，更具体地说，尤其涉及一种干细胞外泌体制剂。同时，本发明还涉及一种干细胞外泌体制剂的制备方法。
背景技术
干细胞不同于其他细胞的特殊之处即具有强大的自我复制功能和多向分化潜能。研究表明，间充质干细胞可以治疗心肌梗死，随机临床试验已经证明间充质干细胞植入心肌梗死的受损区域可以使血管重塑，抑制心肌纤维化，防止心室重构，修复心脏节律细胞。然而，应用干细胞存在很多不可忽视的问题，如生物安全问题、长期保存与运输问题、非治疗目的分化等。基于以上亟待解决的问题，寻找替代干细胞的治疗途径显得尤为重要。外泌体具有源细胞的生物学特性，逐渐进入人们的视线。外泌体携带的酶以及化学物质可长期不被降解，无潜在毒性；PBS重悬后可于-80℃保存6个月，且生物化学活性不受影响；用于治疗疾病具有一定的安全性外泌体在疾病的早期预防、诊断以及预后判断方面有重要贡献，但暂时没有较好的提取方法。目前，可用来提取外泌体的方法有离心法、过滤离心、密度梯度离心、免疫磁珠法、色谱法、试剂盒法和最近提出的旋转超滤法等，其中离心法是通过物质的离心力不同而将样本分离，但是微泡和外泌体不能得到更好的分离，过滤离心法是通过过滤不同相对分子质量的分子而得，虽然简单易操作，但是所得样品不纯，密度梯度离心法虽然得到的样本较纯，但耗时久，操作复杂，不利于大规模生产，免疫磁珠法利用外泌体表面抗体的特异性，但是其对生物活性的影响未知，尚不能满足进一步实验的要求，色谱法虽然有很多优点但是对设备要求较高，尚不能普及。虽然方法众多，却并没有统一的标准。
发明内容
本发明的目的在于提供一种干细胞外泌体制剂及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种干细胞外泌体制剂，包括：间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞、人血白蛋白以及生理盐水，所述间充质干细胞外泌体为从人脐带间充质干细胞提取出来的外泌体。
一种干细胞外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：人脐带间充质干细胞的培养：于超净工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，PBS充分洗涤，用组织剪将脐带剪为长约1cm的小段，剔除动静脉血管，将华尔通胶剪至1mm3大小，接种于培养瓶中，加入完全培养基，于细胞培养箱中培养，当细胞达到70％-80％融合时，传代培养；
S2：间充质干细胞外泌体的制备：选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用培养基培养，待细胞融合至70％-80％时换无血清培养基培养，48-72h后收集条件培养基，将条件培养基内的第4代脐带间充质干细胞，采用传统差速超速离心法提取外泌体，条件培养基以300×g离心10min去除完整细胞；再经2000×g离心20min进一步去除死细胞和杂质；再经10000×g离心30min去除细胞碎片，最后以100000×g离心70min，弃上清，将沉淀用50μLPBS重悬后，保存至-80℃，得到的间充质干细胞外泌体；
S3：干细胞外泌体制剂的制备：往生理盐水中加入人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为3％-7％的人血白蛋白溶液，将间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞加入制得的质量浓度为3％-7％的人血白蛋白溶液，制得干细胞外泌体制剂。
具体的，所述步骤S1中细胞培养箱的培养温度为37℃，细胞培养箱中二氧化碳的体积分数为5％。
具体的，所述步骤S2中培养第4代脐带间充质干细胞的培养基为含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM的培养基。
具体的，所述步骤S2中采用传统差速超速离心法提取外泌体制得的外泌体蛋白浓度为2.0-3.0g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明向人血白蛋白溶液中加入间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞制得干细胞外泌体制剂，外泌体携带的酶以及化学物质可长期不被降解，无潜在毒性，PBS重悬后可于-80℃保存6个月，且生物化学活性不受影响；用于治疗疾病，具有一定的安全性，外泌体在疾病的早期预防、诊断以及预后判断方面有重要贡献，能够显著提高脐带静脉内皮细胞的增值以及迁移能力，促进血管的生成，与细胞治疗相比，外泌体的性质更加稳定，保存运输更加方便，采用传统差速超速离心法提取外泌体，不存在未知的潜在杂质污染，并且纯度相对较高，成本也比较低，可以大量地提取，满足实验的基本需求，利于后续的实验研究，在实际应用中，重复性高，可作为一种合理的分离方法。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种干细胞外泌体制剂，包括：间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞、人血白蛋白以及生理盐水，所述间充质干细胞外泌体为从人脐带间充质干细胞提取出来的外泌体。
一种干细胞外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1：人脐带间充质干细胞的培养：于超净工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，PBS充分洗涤，用组织剪将脐带剪为长约1cm的小段，剔除动静脉血管，将华尔通胶剪至1mm3大小，接种于培养瓶中，加入完全培养基，于细胞培养箱中培养，当细胞达到70％-80％融合时，传代培养；
S2：间充质干细胞外泌体的制备：选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用培养基培养，待细胞融合至70％-80％时换无血清培养基培养，48-72h后收集条件培养基，将条件培养基内的第4代脐带间充质干细胞，采用传统差速超速离心法提取外泌体，条件培养基以300×g离心10min去除完整细胞；再经2000×g离心20min进一步去除死细胞和杂质；再经10000×g离心30min去除细胞碎片，最后以100000×g离心70min，弃上清，将沉淀用50μLPBS重悬后，保存至-80℃，得到的间充质干细胞外泌体；
S3：干细胞外泌体制剂的制备：往生理盐水中加入人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为3％-7％的人血白蛋白溶液，将间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞加入制得的质量浓度为3％-7％的人血白蛋白溶液，制得干细胞外泌体制剂。
具体的，所述步骤S1中细胞培养箱的培养温度为37℃，细胞培养箱中二氧化碳的体积分数为5％。
具体的，所述步骤S2中培养第4代脐带间充质干细胞的培养基为含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM的培养基。
具体的，所述步骤S2中采用传统差速超速离心法提取外泌体制得的外泌体蛋白浓度为2.0-3.0g/L。
本发明向人血白蛋白溶液中加入间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞制得干细胞外泌体制剂，外泌体携带的酶以及化学物质可长期不被降解，无潜在毒性，PBS重悬后可于-80℃保存6个月，且生物化学活性不受影响；用于治疗疾病具有一定的安全性外泌体在疾病的早期预防、诊断以及预后判断方面有重要贡献，能够显著提高脐带静脉内皮细胞的增值以及迁移能力，促进血管的生成，与细胞治疗相比，外泌体的性质更加稳定，保存运输更加方便，采用传统差速超速离心法提取外泌体，不存在未知的潜在杂质污染，并且纯度相对较高，成本也比较低，可以大量地提取，满足实验的基本需求，利于后续的实验研究，在实际应用中，重复性高，可作为一种合理的分离方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种干细胞外泌体制剂，其特征在于：包括：间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞、人血白蛋白以及生理盐水，所述间充质干细胞外泌体为从人脐带间充质干细胞提取出来的外泌体。
2.一种根据权利要求1所述的干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：人脐带间充质干细胞的培养：于超净工作台上取出脐带标本置于一次性无菌培养皿中，PBS充分洗涤，用组织剪将脐带剪为长约1cm的小段，剔除动静脉血管，将华尔通胶剪至1mm3大小，接种于培养瓶中，加入完全培养基，于细胞培养箱中培养，当细胞达到70％-80％融合时，传代培养；
S2：间充质干细胞外泌体的制备：选择生长状态良好的第4代脐带间充质干细胞，用培养基培养，待细胞融合至70％-80％时换无血清培养基培养，48-72h后收集条件培养基，将条件培养基内的第4代脐带间充质干细胞，采用传统差速超速离心法提取外泌体，条件培养基以300×g离心10min去除完整细胞；再经2000×g离心20min进一步去除死细胞和杂质；再经10000×g离心30min去除细胞碎片，最后以100000×g离心70min，弃上清，将沉淀用50μLPBS重悬后，保存至-80℃，得到的间充质干细胞外泌体；
S3：干细胞外泌体制剂的制备：往生理盐水中加入人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为3％-7％的人血白蛋白溶液，将间充质干细胞外泌体、脐带静脉内皮细胞加入制得的质量浓度为3％-7％的人血白蛋白溶液，制得干细胞外泌体制剂。
3.根据权利要求2所述的一种干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中细胞培养箱的培养温度为37℃，细胞培养箱中二氧化碳的体积分数为5％。
4.根据权利要求2所述的一种干细胞外泌体制剂及其制备方法，其特征在于：所述步骤S2中培养第4代脐带间充质干细胞的培养基为含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM的培养基。
5.根据权利要求2所述的一种干细胞外泌体制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中采用传统差速超速离心法提取外泌体制得的外泌体蛋白浓度为2.0-3.0g/L。
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