CN105802912A - 从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用 - Google Patents

从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105802912A
CN105802912A CN201610318003.9A CN201610318003A CN105802912A CN 105802912 A CN105802912 A CN 105802912A CN 201610318003 A CN201610318003 A CN 201610318003A CN 105802912 A CN105802912 A CN 105802912A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extracellular
microcapsule
cells
culture supernatant
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610318003.9A
Other languages
English (en)
Inventor
郭子宽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellbang (beijing) Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Cellbang (beijing) Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellbang (beijing) Biotechnology Co Ltd filed Critical Cellbang (beijing) Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201610318003.9A priority Critical patent/CN105802912A/zh
Publication of CN105802912A publication Critical patent/CN105802912A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/50—Soluble polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种从细胞或组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法其专用分离试剂、试剂盒与应用。该方法采用聚乙二醇(PEG)溶液，使细胞或组织培养上清或体液中的细胞外微囊疏离水溶液，再采用低速离心的方法浓缩并收集沉降的细胞外微囊。用本发明的方法每次可处理1000mL或以上的标本，与超速离心和层析法比较，该方法操作简单，所用时间短，无需大型仪器设备，且重复性好。本发明不但解决了细胞外微囊分离的难题，也将推动细胞外微囊的科研研究及其临床应用。

Description

从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及细胞外微囊的获取技术，特别涉及一种从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与分离得到的细胞外微囊的应用。
背景技术
在生理及病理条件下，静止及活化的细胞可以向细胞外空间及体液中释放一种囊泡性结构，它由脂类双层结构包裹，直径在几十纳米至几个微米之间，称为细胞外微囊，英文名称为extracellularvesicles(EV)。根据来源及囊泡大小不同，细胞外微囊也有其它名称，如肿瘤泌体(oncosomes)、前列腺泌体(prostasomes)、凋亡小体(apoptoticbodies)等。目前，人们倾向于根据细胞释放囊泡结构的方式，将细胞外微囊分为凋亡小体、脱落微囊(sheddingmicrovesicles)和外泌体(exosomes)三类囊泡结构。凋亡小体源于细胞凋亡过程中的凋亡球体。脱落囊泡由细胞膜发芽形成。外泌体通常较小，它在细胞内形成，是内吐囊泡以出芽的方式向内凹陷，形成多个囊泡组成的多囊泡内涵体，之后与质膜融合并将内容物释放到细胞外。
近年来，细胞外微囊的作用越来越受到人们重视。细胞外微囊可发挥多种生理功能，通过其内的活性物质水平转移，如蛋白质、脂类物质、DNA和RNA等的转移，影响进入细胞的多种功能。细胞外微囊参与了多种生理及病理过程，如炎症反应、免疫调节、血管新生、血栓形成、神经系统疾病、癌症的发生、肿瘤细胞浸润及转移等。因此，细胞外囊泡是生理及病理状态下细胞间信息传递的关键物质基础之一。
在某些疾病状态下，体液中细胞外微囊含量会提高，如心血管疾病、多种癌症包括神经母细胞瘤、卵巢癌、黑色素瘤和肾癌等，自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎，糖尿病和慢性肾功能不全等。由于细胞外微囊含有特定组织的标记，因此，它可作为这些疾病早期诊断及后续观察的生物标记物。
细胞外囊泡也可能用于某些疾病的治疗。如美国FDA就批准了法国的研究者利用树突状细胞来源的细胞外微囊治疗黑色素瘤。此外，美国FDA批准的细胞外微囊临床试验项目还有：利用患者腹水微囊治疗结肠癌，利用单核细胞来源的微囊治疗非小细胞肺癌，利用间充质干细胞来源的微囊治疗糖尿病等。
因此，细胞外微囊不但可以用于疾病的诊断，也可用于用于疾病的治疗，是一种新型的疾病的生物诊疗方式。
然而，目前人们采用的细胞外微囊的分离方法过于繁琐，微囊的收获量也不稳定，微囊的分离、纯化方法亟待改进。目前，细胞外微囊的分离方法主要有：(1)超速离心法；(2)蔗糖密度梯度分离结合超速离心法；(3)层析法。超速离心或密度梯度超速离心，均需要价格昂贵的超高速离心机，离心机机箱内需达到真空状态，每次离心量一般只有60mL，离心时间至少需要6个小时。层析法利用微囊物理性状，通过高效层析柱收获目标物质，但每次加样量只有100-200mL，需要时间24小时以上。此外，由于细胞外微囊来源不同、来源的个体不同、或者来源细胞的状态不同，样品中细胞外微囊的含量差异很大，从而造成层析法获取细胞外微囊的浓度差异，影响后续的使用。因此，迫切需要一种新的细胞外微囊的分离方法及其专用分离试剂。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂。
本发明所提供的细胞外微囊分离试剂是一种以具有体积排斥功能的聚合物(ploymer)为主要成分配制的溶液。
所述具有体积排斥功能的聚合物本发明确定为聚乙二醇(PEG)，其英文名称为polyethyleneglycol，也可为PolyethyleneGlycol或polyethyleneglycol，简称PEG，其分子式为HO(CH2CH2O)nH，其分子结构如式Ⅰ所示，n为聚合度，与分子量相关，通常PEG为分子量大于600的半固体及固体物质，是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合而成：
应用于本发明中的聚乙二醇的分子量应大于或等于2000，最适宜分子量为4000-8000。
以聚乙二醇为主要成分配制的溶液是将聚乙二醇用盐类溶液溶解后形成的溶液；所述盐类溶液为NaCl·Tris·HCl溶液或NaCl溶液。
在以聚乙二醇为主要成分配制的溶液中，所述聚乙二醇的质量百分浓度为20％-60％(质量/体积，单位g/100mL)，优选的浓度为30％-48％，最优选为40％。
所述聚乙二醇溶液在从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊中的用途也属于本发明。
本发明的第二个目的是提供一种简易且重复性良好的从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法。
本发明所提供的分离细胞外微囊的方法，是从含有细胞外微囊生物样品，如细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊，即去除生物样品中绝大部分的水、盐、蛋白质、核酸等成分，并将细胞外微囊进行浓缩。分离过程包括将样品与分离试剂混合后静置，再通过离心的方法将样品中的细胞外微囊沉降，去除上层液体并收集沉降物；这里离心是在低温、室温或者其它温度条件下，通过离心机使样品中的细胞外微囊沉降。
本发明的分离细胞外微囊的方法，是将细胞外微囊分离试剂与细胞培养上清、组织培养上清或体液混合后静置，再离心，收集沉降物，得到细胞外微囊。
所述体液包括血浆、血清、腹水、淋巴液等。
所述细胞培养上清、组织培养上清或体液与细胞外微囊分离试剂的混合比例为1-5：1(体积比)，混合后聚乙二醇的终浓度为3％-20％(质量/体积，W/V)；优选的混合比例为3:1或4:1，混合后聚乙二醇的终浓度为6％-12％。
所述静置条件为0-25℃静置1-24小时，优选为4℃静置12-18小时。
所述离心温度为低温(0-8℃)、室温(20-25℃)或者其它温度(10-30℃)，优选为室温(20-25℃)；所述离心速度包括低速(600-5000rpm)、高速(5000-15000rpm)或超高速(100000-500000rpm)，优选为低速离心。离心条件优选为室温、低速(600-5000rpm)离心10-60分钟，最优选为室温、1200rpm离心30分钟。
离心后沉降物的收集可以使用溶剂(如磷酸盐缓冲液、Tris-CL缓冲液或水等)溶解或直接储存，取出沉降物，沉降物即为目标产物—细胞外微囊。
本发明的第三个目的是提供一种用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂盒。
本发明所提供的试剂盒，包括上述细胞外微囊分离试剂。
本发明提供了一种从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法。该方法适于从细胞培养上清或组织培养上清中分离细胞外微囊，也同样适用于从体液中分离细胞外微囊。该方法的核心是采用聚乙二醇(PEG)溶液，使细胞培养上清、组织培养上清或体液中的细胞外微囊疏离水溶液，再采用低速离心的方法浓缩并收集沉降的细胞外微囊。用本发明的方法每次可处理1000mL或以上的标本。与超速离心和层析法比较，该方法操作简单，所用时间短，无需大型仪器设备，且重复性好。本发明分离细胞外微囊的方法具有以下特点：(1)使用普通离心机、离心时间30分钟就可以完成分离过程；(2)每次可分离1000mL的样品；(3)分离条件无菌，收获的细胞外微囊可直接用于细胞培养；(4)获得的细胞外微囊符合人们公认的标准；(5)获得的细胞外微囊具有功能性；(6)分离试剂可成为一种试剂盒；(7)使用该方法收集的细胞外微囊对细胞无毒性。使用该方法分离的细胞外微囊是功能性的，可进入细胞内，将微囊内物质传递至靶细胞，从而发挥促血管新生、免疫调节、细胞保护等多种效应。因此，细胞外微囊可以作为某些疾病的治疗措施，如糖尿病足的治疗，也可以作为某些疾病的生物标志，如癌症及心肌梗死的生物标志。因此，本发明不但解决了细胞外微囊分离的难题，也将推动细胞外微囊的科研研究及其临床应用。本发明为细胞外微囊的基础及临床研究奠定了良好的基础，具有广阔的应用前景。
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊的电镜照片(标示：500nm)；
图2为从人树突状细胞培养上清中分离的细胞外微囊的电镜照片(标示：500nm)；
图3为从人血液中分离的细胞外微囊的电镜照片(标示：500nm)；
图4为从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊流式细胞学分析结果；
图5为从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊促进人脐带静脉内皮细胞增殖的实验结果；
图6为从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊促进人脐带静脉内皮细胞形成网状结构的实验结果。
具体实施方式
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验或实施获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、从人脐带间充质干细胞培养上清中分离细胞外微囊
1、材料
细胞：人脐带间充质干细胞，由细胞邦(北京)生物技术有限公司提供，按照常规方法进行分离、培养。
主要试剂：聚乙二醇(PEG)，购自美国Sigma公司，货号81260，平均分子量为6000。氯化钠购自美国Sigma公司。Tris和盐酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。胎牛血清购自Invitrogen公司。alpha-MEM培养基购自Invitrogen公司。
主要试剂配制：
(1)常规方法配制500mM的Tris·HCl溶液，pH值为8.0.
(2)用Tris·HCl溶液配制0.15M的NaCl溶液，Tris·HCl为100mM。
(3)使用NaCl·Tris·HCl溶液配制40％(W/V)聚乙二醇(PEG)溶液。
2、分离方法
1)用常规方法培养人脐带间充质干细胞，培养基可为含10％(V/V)胎牛血清的alpha-MEM培养基，培养条件为37℃、5％CO2、95％湿度。本实施例中取第5代细胞，生产中也可以使用第0-第30代的传代细胞。
2)将培养的间充质干细胞用胰蛋白酶消化，计活细胞数，悬浮于含10％(V/V)胎牛血清的alpha-MEM培养基中。
3)按照60000个/cm2底面积将人脐带间充质干细胞接种于直径为150mm的培养皿中，在37℃、5％CO2条件下培养。
4)次日，吸出培养基，用PBS洗涤2次，加入alpha-MEM培养基继续在相同条件下培养72小时。
5)收集细胞培养上清，用普通离心机在室温下1200rpm离心10分钟，去除细胞碎片。
实施例1和实施例2中所描述的细胞培养过程是为保证操作连贯的具体公开，不作为对本发明实施的限制。本领域技术人员可以采用其它已知的方法进行目标细胞的培养并取得细胞培养上清。
6)向750mL培养上清中加入40％(W/V)PEG溶液250mL，PEG终浓度为10％(W/V)，混匀。
7)4℃静置12小时。
8)用普通离心机在室温下1200rpm离心30分钟。
9)去除上层液体，收集下层沉淀物(无需洗涤)即为细胞外微囊。
3、沉淀物镜下鉴定
取收集的沉淀少量，用PBS将其溶解，取悬液2μL，在透射电镜(TecnaiF30，荷兰)下观察，照相。
结果如图1所示，电镜下可见沉淀物具有囊性结构，呈圆形或杯形，直径在100nm左右，符合细胞外微囊形态特征，说明收集的沉淀物为细胞外微囊。
该实施例表明用本发明可从人脐带间充质干细胞培养上清中分离出细胞外微囊。
实施例2、从人树突状细胞培养上清中分离细胞外微囊
1、材料
细胞：人树突状细胞，由细胞邦(北京)生物技术有限公司提供，按照常规方法进行分离、培养。
主要试剂：聚乙二醇(PEG)，购自美国Sigma公司，货号1546605，平均分子量为8000。氯化钠购自美国Sigma公司。IL-4、GM-CSF和LPS购自Peprotech公司。AIM-V无血清培养基为Invitrogen公司产品。
主要试剂配制：
(1)用去离子水配制2M的NaCl溶液。
(2)使用2MNaCl溶液配制30％(W/V)聚乙二醇(PEG)溶液。
2、方法
1)用常规方法培养人树突状细胞，培养基为AIM-V无血清培养基，培养条件为37℃、5％CO2、95％湿度，加入IL-4(终浓度为1000U/mL)和GM-CSF(终浓度为1000U/mL)培养5天后，加入LPS(终浓度为100ng/mL)，继续培养2天。本例取第5代细胞。
2)收集细胞培养上清，用普通离心机在室温下1200rpm离心10分钟，去除细胞碎片。
3)向1000mL细胞培养上清中加入30％(W/V)PEG溶液250mL，PEG终浓度为6％(W/V)，混匀。
4)4℃静置2小时。
5)用普通离心机在室温下1200rpm离心30分钟。
6)去除上层液体，收集下层沉淀物即为细胞外微囊。
3、沉淀物镜下鉴定
用实施例1相同的方法镜下观察，结果如图2所示，电镜下可见囊性结构，呈圆形或杯形，直径在100nm左右，符合细胞外微囊形态特征，说明本发明可从人树突状细胞培养上清中分离出细胞外微囊。
实施例3、从人外周血中分离细胞外微囊
1、材料
细胞：人外周血，来源于健康供者。按照常规方法收获人血浆，肝素抗凝。
主要试剂：聚乙二醇(PEG)，购自美国Sigma公司，货号1546569，平均分子量为4000。氯化钠购自美国Sigma公司。
主要试剂配制：
(1)用去离子水配制2M的NaCl溶液。
(2)使用2MNaCl溶液配制48％(W/V)聚乙二醇(PEG)溶液。
2、方法
1)用常规方法制备人血浆，具体方法为：3000rpm离心10分钟。将血浆转移至50mL离心管。
2)向30mL人血浆中加入48％(W/V)PEG溶液10mL，PEG终浓度为12％(W/V)，混匀。
3)4℃静置过夜(12-18小时)。
4)用普通离心机在室温下1200rpm离心30分钟。
5)去除上层液体，收集下层沉淀物即为细胞外微囊。
3、沉淀物镜下鉴定
用实施例1相同的方法镜下观察，结果如图3所示，电镜下可见囊性结构，呈圆形或杯形，直径在100nm左右，符合细胞外微囊形态特征，说明用本发明的分离试剂及方法可从人外周血中分离出细胞外微囊。
实施例4、从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊的流式细胞学分析
1、材料
细胞：人脐带间充质干细胞，由细胞邦(北京)生物技术有限公司提供，按照常规方法进行分离、培养。
主要试剂：聚乙二醇(PEG)，购自美国Sigma公司，货号81260，平均分子量为6000。氯化钠购自美国Sigma公司。
主要试剂配制：
(1)用去离子水配制2M的NaCl溶液。
(2)使用2MNaCl溶液配制40％(W/V)聚乙二醇(PEG)溶液。
2、方法
1)收集人脐带间充质干细胞培养上清。
2)用普通离心机在室温下1200rpm离心10分钟，以去除培养上清中的细胞碎片。
(可采用实施例1中步骤1-步骤5)的操作)
3)向400mL培养上清中加入40％(W/V)PEG溶液100mL，PEG终浓度达到8％(W/V)，混匀。
4)4℃静置过夜(12-18小时)。
5)用普通离心机在室温下1200rpm离心30分钟。
6)去除上层液体，收集下层沉淀物。
3、沉淀物流式细胞学分析
用PBS将沉淀溶解，取细胞外微囊悬液10μL，按照文献(ZhangHC,LiuXB,HuangS,BiXY,WangHX,XieLX,WangYQ,CaoXF,LvJ,XiaoFJ,YangY,GuoZK.Microvesiclesderivedfromhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsstimulatedbyhypoxiapromoteangiogenesisbothinvitroandinvivo.StemCellsDev.2012；21:3289-97)中报道的方法，用微珠对细胞外微囊进行标记，用流式细胞技术观察细胞外微囊中人CD44、CD9、CD63、CD81分子的表达情况。
结果如图4(A：横坐标为前向角，表示大小，纵坐标为侧向角。B-F：横坐标为前向角，表示大小。B：对照。C-F纵坐标依次分别为：CD9，CD44，CD63，CD81。)所示，从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊表达CD44(D幅)，提示为间充质干细胞来源；此外，从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊，还可表达CD9(C幅)、CD63(E幅)和CD81(F幅)，符合外泌体(exosome)特征，说明用本发明方法分离的细胞外微囊主要为外泌体。
实施例5、从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊促进人脐带静脉内皮细胞增殖情况
1、实验材料
细胞：人脐带间充质干细胞来源于细胞邦(北京)生物技术有限公司，人脐带静脉内皮细胞来源于细胞邦(北京)生物技术有限公司，按照常规方法进行分离、培养。
主要试剂：聚乙二醇(PEG)，购自美国Sigma公司，货号81260，平均分子量为6000。氯化钠购自美国Sigma公司。胎牛血清购自Invitrogen公司。DMEM培养基购自Invitrogen公司。
主要试剂配制：
(1)用去离子水配制2M的NaCl溶液。
(2)使用2MNaCl溶液配制40％(W/V)聚乙二醇(PEG)溶液。
2、实验方法
1)用实施例4中的方法收集人脐带间充质干细胞培养上清中的细胞外微囊(沉淀物)。
2)用常规的Bradford法测定细胞外微囊溶液中的蛋白质浓度。
3)用胰蛋白酶消化法收集人脐带静脉内皮细胞，用含1％(V/V)胎牛血清的DMEM培养基悬浮细胞。
4)按照2000细胞/100μL/孔接种于96孔培养板中。设多个组，体系中加入不同浓度(浓度为1、2.5、5、10μg/mL)的细胞外微囊。
5)72小时后，加入10μL的噻唑蓝，以显示细胞活力，继续培养4小时。
6)去除培养上清，加入100μL的二甲基亚砜，以溶解噻唑蓝代谢物。
7)分光光度计测定450nm光密度值。
3、实验结果
结果如图5(纵坐标：OD450。Neg：阴性对照，培养体系为含1％(V/V)胎牛血清的DMEM。Pos：阳性对照，培养体系为含10％胎牛血清的DMEM。其它各组代表体系中加入了不同浓度的细胞外微囊(以蛋白质浓度计算))所示，从脐带人间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊可促进人脐带静脉内皮细胞增殖，其作用呈浓度依赖性。以往的研究证实，对人脐带静脉内皮细胞体外促增殖效应，是间充质干细胞来源微囊重要的功能之一。该实施例的实验结果表明，本发明从脐带人间充质干细胞培养上清中分离得到的细胞外微囊保留有原有的生物活性。
实施例6、从人脐带间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊促进人脐带静脉内皮细胞网状结构形成
1、实验材料
细胞：来源于细胞邦(北京)生物技术有限公司的人脐带间充质干细胞，来源于细胞邦(北京)生物技术有限公司的人脐带静脉内皮细胞，按照常规方法进行分离、培养。
主要试剂：聚乙二醇(PEG)，购自美国Sigma公司，货号81260，平均分子量为6000。氯化钠购自美国Sigma公司。
主要试剂配制：
(1)用去离子水配制2M的NaCl溶液。
(2)使用2MNaCl溶液配制40％(W/V)聚乙二醇(PEG)溶液。
2、实验方法
1)用实施例4中的方法收集人脐带间充质干细胞培养上清中的细胞外微囊(沉淀物)。
2)用常规的Bradford法测定细胞外微囊溶液中的蛋白质浓度。
3)用胰蛋白酶消化法收集人脐带静脉内皮细胞，用含1％(V/V)胎牛血清的DMEM培养基悬浮细胞。
4)取24孔培养板，用Matrigel(BD公司，美国)铺板，每孔接种1×105个细胞，体系中加入不同浓度(浓度为1、2.5、5、10μg/mL)的细胞外微囊。
5)培养24小时。
6)相差倒置显微镜下计网状结构数量。
3、实验结果
结果如图6(A：阴性对照。B：微囊含量为1μg/mL。C：微囊含量为2.5μg/mL。D：微囊含量为5μg/mL。E：微囊含量为10μg/mL。F：为阳性对照，为含10％(V/V)胎牛血清的DMEM。)所示，从脐带人间充质干细胞培养上清中分离的细胞外微囊可促进人脐静脉内皮细胞网状结构形成，其作用呈浓度依赖性。既往的研究证实，促人脐静脉内皮细胞网状结构形成，是间充质干细胞微囊重要的功能之一。该实施例的实验结果表明，本发明从脐带人间充质干细胞培养上清中分离得到的细胞外微囊保留有原有的生物活性。
实施例7、制备用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂盒
用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂盒，包括细胞外微囊分离试剂，即百分浓度为20％-60％(质量/体积，W/V，单位g/100mL)的聚乙二醇溶液，优选的浓度为30％-48％，最优选为40％；
所述聚乙二醇的分子量应大于2000，最适宜分子量为4000-8000；
所述聚乙二醇溶液是将聚乙二醇用水或盐类溶液溶解后形成的溶液；所述盐类溶液为NaCl·Tris·HCl溶液或NaCl溶液。
试剂盒中各试剂的使用可参考实施例1-4的介绍。

Claims (10)

1.一种用于从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的试剂，是以聚乙二醇(PEG)为主要成分的聚乙二醇溶液，溶液中聚乙二醇的质量/体积浓度为20％-60％(g/100mL)。
2.根据权利要求1所述的用于分离细胞外微囊的试剂，其特征在于：所述聚乙二醇的分子量大于等于2000；优选分子量为4000-8000。
3.根据权利要求1或2所述的用于分离细胞外微囊的试剂，其特征在于：聚乙二醇溶液的溶剂为盐类溶液；所述盐类溶液为NaCl·Tris·HCl溶液或NaCl溶液。
4.根据权利要求1或2或3所述的用于分离细胞外微囊的试剂，其特征在于：所述溶液中聚乙二醇浓度优选为30％-48％；最优选为40％。
5.权利要求1至4任一所述聚乙二醇溶液在从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊中的用途。
6.一种从细胞培养上清、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法，是将权利要求1至4任一的分离试剂与细胞培养上清、组织培养上清或体液混合后静置，再离心，收集沉降物得到细胞外微囊。
7.根据权利要求6所述的分离细胞外微囊的方法，其特征在于：所述体液包括血浆、血清、腹水、淋巴液。
8.根据权利要求6或7所述的分离细胞外微囊的方法，其特征在于：所述细胞培养上清、组织培养上清或体液与分离试剂的混合比例为1-5：1(体积比)，混合后聚乙二醇的终浓度为3％-20％(质量/体积，W/V)；优选混合比例为3:1或4:1，混合后聚乙二醇的终浓度为6％-12％。
9.根据权利要求6或7或8所述的分离细胞外微囊的方法，其特征在于：所述静置条件为0-25℃静置1-24小时；优选为4℃静置12-18小时。
10.根据权利要求6-9任一所述的分离细胞外微囊的方法，其特征在于；所述离心的温度为低温(0-8℃)、室温(20-25℃)或者其它温度(10-30℃)，优选为室温(20-25℃)；所述离心的速度包括低速(600-5000rpm)、高速(5000-15000rpm)或超高速(100000-500000rpm)，优选为低速离心；离心条件优选为室温、低速离心10-60分钟；离心条件最优选为室温、1200rpm离心30分钟。
CN201610318003.9A 2016-05-12 2016-05-12 从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用 Pending CN105802912A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610318003.9A CN105802912A (zh) 2016-05-12 2016-05-12 从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610318003.9A CN105802912A (zh) 2016-05-12 2016-05-12 从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105802912A true CN105802912A (zh) 2016-07-27

Family

ID=56456108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610318003.9A Pending CN105802912A (zh) 2016-05-12 2016-05-12 从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105802912A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624557A (zh) * 2018-05-31 2018-10-09 章毅 间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用
CN111684080A (zh) * 2018-01-29 2020-09-18 Md保健株式会社 通过细菌性宏基因组分析来诊断抑郁症的方法
CN112641803A (zh) * 2019-09-25 2021-04-13 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种干细胞外泌体制剂及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894062A (zh) * 2015-05-19 2015-09-09 暨南大学 一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用
WO2016033695A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Exerkine Corporation Exosome isolation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016033695A1 (en) * 2014-09-05 2016-03-10 Exerkine Corporation Exosome isolation
CN104894062A (zh) * 2015-05-19 2015-09-09 暨南大学 一种干细胞外泌体补片及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARK A. RIDER ET AL.,: ""ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles"", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
邢宇洋等: "乳腺癌细胞外泌体的分离与鉴定", 《肿瘤》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111684080A (zh) * 2018-01-29 2020-09-18 Md保健株式会社 通过细菌性宏基因组分析来诊断抑郁症的方法
CN108624557A (zh) * 2018-05-31 2018-10-09 章毅 间充质干细胞外泌体的制备方法及其应用
CN112641803A (zh) * 2019-09-25 2021-04-13 深圳光彩生命工程技术有限公司 一种干细胞外泌体制剂及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. The exosome total isolation chip
Sahoo et al. Therapeutic and diagnostic translation of extracellular vesicles in cardiovascular diseases: roadmap to the clinic
Fujita et al. Clinical application of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicle-based therapeutics for inflammatory lung diseases
Sluijter et al. Extracellular vesicles in diagnostics and therapy of the ischaemic heart: Position Paper from the Working Group on Cellular Biology of the Heart of the European Society of Cardiology
Ko et al. Sequencing-based protein analysis of single extracellular vesicles
Muller et al. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma
US9829483B2 (en) Methods of isolating extracellular vesicles
CN104017800B (zh) 一种用于血液中全基因组dna提取试剂盒及其方法
CN106399250A (zh) 一种分离外泌体的方法及其试剂盒
CN105802912A (zh) 从细胞、组织培养上清或体液中分离细胞外微囊的方法及其专用分离试剂、试剂盒与应用
CN103805696B (zh) 一种诊断类风湿关节炎的microRNA分子标志物及其检测试剂盒
EP2875348B1 (en) Method for the isolation of microvesicles
Xu et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: Sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology
CN104962520A (zh) 一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法
CN107085066A (zh) 一种用于lc‑ms检测黄曲霉菌代谢组学的前处理方法
CN103710306A (zh) 一种分离纯化小胶质细胞的方法
Wen et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the microbial vesicles task force of the Chinese society for extracellular vesicles
Pallares-Rusiñol et al. Advances in exosome analysis
CN103602632A (zh) 孕妇外周血中胎儿有核红细胞的分离方法
Hua et al. A double tangential flow filtration-based microfluidic device for highly efficient separation and enrichment of exosomes
Zeiller et al. Preparative electrophoretic separation of antibody forming cells
CN104762262A (zh) 一种脐血干细胞的体积离心分离方法
Cao et al. Comparison of alternative extraction methods for secretome profiling in human hepatocellular carcinoma cells
Campos et al. Analytical technologies for liquid biopsy of subcellular materials
CN102586892A (zh) 筛选肿瘤早期诊断靶标的Small RNA-Seq库的构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160727