CN103091149B - 血红蛋白电泳液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血红蛋白电泳液的制备方法，先用吸管吸取血液中沉降的红细胞，滴入到生理盐水中，借助吸嘴从液面自上至下反复冲打，洗去杂质，使清洁的红细胞均匀地悬浮在液体当中，接着，上机离心，使红细胞充分沉淀在底部，倾倒出离心后的上清液，以去除血浆及杂质，留余量的红细胞，最后，加蒸馏水，溶解红细胞，双手端起试管架利用手腕轻轻前后摇动数次至溶血液澄清透明。整个制备过程中不需接触任何化学试剂，不会对环境有污染，离心过程最多只需5分钟，检测临床标本效率高，节省人力。

Description

血红蛋白电泳液的制备方法

技术领域

本发明属于临床实验方法，具体是涉及一种血红蛋白电泳液的制备方法。

背景技术

血液的主要蛋白成分是血红蛋白，是血红细胞中的最主要蛋白成分，而在红细胞中液中含有微量的超氧化物歧化酶(SOD)，碳酸酐酶、糖酵解酶系等。在血液部分则含有200多种功能不同的蛋白组分，因此，血红蛋白制备的第一步即是要将红细胞与其它组分进行分离(即分浆处理)，最后通过溶解洗涤红细胞以获得所需的血红蛋白液。目前，常用的血红蛋白电泳液的制备方法主要有：四氯化碳溶血法、氯仿溶血法、皂素氰化钾溶血法。

1、四氯化碳溶血法：将EDTA抗凝全血除去血浆，用生理盐水洗去细胞外的杂质，加入蒸馏水溶血，用四氯化碳(AR)溶解，提取脂溶性物质，沉淀细胞膜及基质蛋白，经离心后，上层为澄清透明的血红蛋白液，其具体操作步骤是：新鲜抗凝静脉血离心除去血浆。用生理盐水洗涤红细胞3～4次，每次盐水与红细胞之比少于8∶1。最后一次以3000～4000r/min，快速离心20min，尽量吸去生理盐水，按压积红细胞之体积加入等体积的蒸馏水和0.5体积的四氯化碳，剧烈震荡3min，使彻底溶血，用4000r/min离心20min，吸出上层血红蛋白溶液，待用。该方法法制成的Hb液清晰、稳定，膜蛋白及四氯化碳在试管底部，容易分离，但毒性较大，花费时间较长。

2、氯仿溶血法：该方法操作同四氯化碳溶血法，只是在萃取血红蛋白液时加入两种不同的有机溶剂，即：加四氯化碳和氯仿。该方法制成的HB液与四氯化碳法的基本一致，且毒性较小，但能沉淀UHb，故不适于UHb检查。

3、皂素氰化钾溶血法：对全血标本做洗涤压缩细胞和溶血的准备，离心10分钟，从血浆中分离出细胞，去除血浆，重新悬浮在5～10倍体积的生理盐水溶液(0.85％NaCl)中离心去除悬浮液洗涤压缩细胞3次，洗涤标本后，准备样本混合，10μl标本和100μl溶血液，用力振动15秒。该方法由于含有氰化物，会对环境有污染。

还有，中国卫生部制定的《全国临床检验操作规程》(第3版)提到的方法：血红蛋白溶液的制备，取新鲜抗凝血液，离心后去血浆，用生理盐水洗涤红细胞3～4次，最后一次应尽量移去盐水部分，再加相当于红细胞压积2～3倍的蒸馏水，加1体积四氯化碳或氯仿，猛烈振摇5～6min，静置片刻，高速离心，将上层Hb溶液分离出来备用。3000r/min离心5min，吸出上层清亮的血红蛋白液。

综上，现有技术在制备过程中，漩涡器每次混匀只能一只手拿1～2支，每次双手最多能处理4支样本，且用力充分混匀，标本量大时，耗时太多，混匀时间要求每支溶液保证在15秒以上较佳，在此过程中试管底部与设备表面接触所散出的热量相对较高，促使四氯化碳气体挥发更快，操作人员吸入也就相应增加。样本离心10分钟的时间，每个标本要洗三次，按我中心现在的标本量及设备，一台离心机最多64孔，平均每天约500个左右的样本，需离心约8次，每次10分钟，那这一步骤都需要1.5小时(在离心过程中还需要将样本放进与取出样本，需离心的次数越多，耗时也就越多)，再加上洗三次的时间，共需时间250min才能将样本洗完，耗时非常长。

发明内容

本发明的目的是克服上述技术上的障碍，提供一种毒性小且能快速制备血红蛋白电泳液的方法。

本发明是这样实现的：一种血红蛋白电泳液的制备方法，由以下步骤组成：

(1)取红细胞，滴入到浓度为0.7～1.0％NaCl的生理盐水中洗涤1次；

(2)上机离心3～5min，弃上清液，留余量的红细胞；

(3)加300～350μl蒸馏水溶解红细胞；

(4)再次上机离心3～5min。

所述红细胞与生理盐水的容积比可以为1∶4～5。

所述红细胞容积为130～150μl，生理盐水容积为5～7ml。

步骤(1)所述的洗涤过程中，供助吸嘴从液面自上至下反复冲打3～5次，洗去杂质，使清洁的红细胞均匀地悬浮在液体当中。

所述步骤(3)所述溶解过程中，摇动试管数次至溶血液澄清透明。

所述两次离心的转速均为3000～4000r/min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明方法省掉了溶血素和四氯化碳两种有毒化学试剂接触，减少了加溶血素后等待红细胞溶解缓慢的时间，省掉了前后两次漩涡充分混匀时间，整个制备血红蛋白液的过程中不需接触任何化学试剂，不会对环境有污染。

2、离心过程最多只需5分钟，检测临床标本效率高。

3、制备过程中，一只手一次性可以握4～6支管，替代了传统方法用真空泵一支支吸走上清液，节省人力，节省时间，为病人提前发报告，节省试剂成本，减小人体伤害。

附图说明

图1为血红蛋白电泳液的电泳图。

具体实施方式

本发明制备血红蛋白的较佳方法是：

1、用吸管吸取血液中沉降的红细胞135μl，滴入到7ml浓度为0.9％NaCl的生理盐水中，借助吸嘴从液面自上至下反复冲打3～5次，洗去杂质，使清洁的红细胞均匀地悬浮在液体当中。

2、上机3500r/min转速下离心5min，使红细胞充分沉淀在底部，倾倒出离心后的上清液，以去除血浆及杂质，留余量的红细胞。

3、加蒸馏水320μl，溶解红细胞，双手端起试管架利用手腕轻轻前后摇动数次至溶血液澄清透明即可。

4、为了获得更好效果，可以再次上机3500r/min转速下离心5min。

制备好的血红蛋白电泳液，根据带电粒子在电场中作定向运动，可将可溶性被测物的各个蛋白质进行分离，然后对分离后的凝胶进行染色扫描分析，采用琼脂糖凝胶电泳法，用于筛查地中海贫血和血红蛋白病。根据电泳结果作出判断，如果显示四条血红蛋白区带，从阳极端依次为HBA，HBF，HBA2，CE，则属于正常，除上述出现的区带外，其他区带均属异常区带，目前国内已发现的最常见和重要的异常Hb以HbA为标志，在PH8.5TEB不连续电泳中大致分为六组，包括快速异常血红蛋白H组和J组、慢速异常血红蛋白G组、D组、E组。且此改良方法均可检出且效果较其他方法清晰。需要说明：无论哪种方法对于陈旧血红蛋白区带分散，效果差，不稳定血红蛋白易发生沉淀，所以，制作血红蛋白液采用新鲜血液是最理想的。

将传统方法与本专利方法作比较，将二者结果再与国际地贫协会推荐的方法HPLC测得的结果比较，三种初筛方法再与地贫基因确认方法比较结果符合性，从而可以客观地评价试验的可靠性。表1为所取样本的辅助诊断检测，表2为电泳所测数据。

表1  部分样本红细胞参数及红细胞渗透脆性实验

编号	性别	年龄	OFT	Hb	MCV	MCH	MCHC	RDW	RBC
										1	女	31y	47	115	72	22	311	16	5.2
2	女	27y	78	96	74	24	321	17	4.0
										3	男	38y	30	138	69	22	318	15	6.3
4	男	43d	70	123	81	26	321	18	4.7
										5	男	19y	18	103	65	20	303	22	5.2
6	男	6y	18	88	57	16	288	21	5.3
										7	女	19y	28	101	64	20	319	17	4.9
8	女	5y	15	93	59	17	290	22	5.4
										9	女	27y	21	111	67	22	327	18	5.1
10	男	1d	81	168	113	37	327	18	4.5

表2四种方法检测结果对比

Claims (1)

1.一种临床实验用血红蛋白电泳液的制备方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：

(1)用吸管吸取血液中沉降的红细胞135μl，滴入到7ml浓度为0.9％NaCl的生理盐水中，借助吸嘴从液面自上至下反复冲打3～5次，洗去杂质，使清洁的红细胞均匀地悬浮在液体当中；

(2)上机3500r/min转速下离心5min，弃上清液，留余量的红细胞；

(3)加320μl蒸馏水溶解红细胞,双手端起试管架利用手腕轻轻前后摇动数次至溶血液澄清透明；

(4)再次上机3500r/min转速下离心5min，上清液即为血红蛋白电泳液。