CN110161159B - 一种奥卡西平生物等效试验的生物样本分析方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于药物检测方法领域,尤其涉及药物的生物等效性试验中的生物样本分析方法。一种奥卡西平生物等效试验的生物样本分析方法,包括受试者血样采集、血样处理、生物样本检测和数据分析。本发明的目的是描述如何建立人血浆中奥卡西平及其代谢产物10,11‑二氢‑10‑羟基卡马西平浓度的LC‑MS/MS测定方法,并按照国家药品监督管理局的相关指导原则的要求对该方法进行验证,从而准确定量检测人血浆样品中的奥卡西平及10,11‑二氢‑10‑羟基卡马西平浓度,以支持基于药代动力学参数比较的奥卡西平制剂生物等效性评价。
Description
技术领域
本申请属于药物检测方法领域,尤其涉及药物的生物等效性试验中的生物样本分析方法。
背景技术
生物等效评价通过生物学指标将受试药物与参比药物进行对比,是仿制药申请上市制剂质量评价的重要依据,同时也是药物新剂型、新规格研究的重要评价方法,通常以受试者的血液作为生物样本分析受试药物的血药浓度、吸收代谢速度等药代动力学为指标进行评价。
羧酸酯酶(carboxylesterase,CES)属于B族酯酶家族,广泛分布于各种生物中,动物中的羧酸酯酶可以分为CES1-CES5五个家族,以肝脏、肠和肺中含量最高。
羧酸酯酶是一种能催化酯键、酰胺键和硫酯键断裂的水解酶,其作用底物广泛(羧酸酯酶的水解特性尚未研究清楚),除了执行解毒外源毒素等生物自身的生理功能外,羧酸酯酶在药物代谢中也起到重要作用,羧酸酯酶可以水解大量含酯键、酰胺键和硫酯键的药物或前药。包括人在内的多数哺乳动物血浆中均存在羧酸酯酶,在研究含酯键、酰胺键和硫酯键的已知或未知药物的代谢时,必需考虑血浆中的羧酸酯酶影响,一般考虑取血样后尽快加入羧酸酯酶抑制剂如双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP),苯甲基磺酰氟等羧酸酯酶抑制剂不可逆地抑制羧酸酯酶活性,其中双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP)由于超过99%的高抑制效率成为首选抑制剂(ZL201010260758.0,Wadkins RM等,Discovery of novel selectiveinhibitors of human intestinal carboxylesterase for the amelioration ofirinotecan-induced diarrhea:synthesis,quantitative structure-activityrelationship analysis,and biological activity,Mol.Pharmacol,2004年,第65卷,第6期)。
申请人在进行药物代谢研究时发现,使用常用的肝素、EDTA抗凝剂采血管采血时加入双(对硝基苯基)磷酸酯(BNPP)抑制羧酸酯酶保存血液样本会很大程度地降低羧酸酯酶抑制效果(抑制效果降低50%左右),导致样品中相应药物检测结果严重失真。而不使用抗凝采血管采血,则必须对每份样本在10几分钟的时间内完成加入BNPP,混合,离心、取血浆这一系列工作,这在实验室条件下处理少量样本时并无问题,但是在样本量大,特别是需要在较差的条件(如实验动物饲养地、住院患者/行动不便患者采血时)下处理大量样本时,给实验组织带来很大的困难。
奥卡西平是一种神经性药物,可用于局限性及全身性癫痫发作。奥卡西平片原研厂家为诺华制药,商品名为“Trileptal”(曲莱)。用于治疗原发性全面性强直-阵挛性和部分性,伴有或不伴继发性全面性癫痫发作,适用于成年人和2岁以上儿童癫痫患者。
奥卡西平片的生物等效性试验中的生物样本分析一般需要以离心后获得的血浆且经过前处理后作为检测样本,离心过程所需的离心机以及洁净的移液环境操作虽然在实验室和医院中容易获得,但是从采血样到样本处理到检测往往需要较长的时间,一般就需要先采用抗凝管采血抑制血液凝固等待到实验室或医院批量进行处理,如果不对血样进行抗凝处理和抑制羧酸酯酶保存,会导致检测结果的失真。
发明内容
本发明的目的在于提供一种受羧酸酯酶影响小、保证采血后血液储存一段时间后再离心处理取血浆检测仍然能有较高的准确度的奥卡西平生物等效试验的生物样本分析方法。
本发明的目的是描述如何建立人血浆中奥卡西平及其代谢产物10,11-二氢-10-羟基卡马西平浓度的LC-MS/MS测定方法,并按照国家药品监督管理局的相关指导原则的要求对该方法进行验证,从而准确定量检测人血浆样品中的奥卡西平及10,11-二氢-10-羟基卡马西平浓度,以支持基于药代动力学参数比较的奥卡西平制剂生物等效性评价。
一种奥卡西平生物等效试验的生物样本分析方法,包括受试者血样采集、血样处理、生物样本检测和数据分析。
进一步的,生物样本分析的分析物是奥卡西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平,且其标准曲线的范围是:奥卡西平:10~10000ng/mL,10,11-二氢-10-羟基卡马西平:50~50000ng/mL。
进一步的,血样采集是使用的血液保存管中含有血液保存剂,所述的血液保存剂包含BNPP以及非肝素或EDTA的抗凝剂,其中所述的非肝素或EDTA的抗凝剂为草酸钠和氟化钠。
进一步的,其中BNPP、草酸钠和氟化钠的质量比为5:3:1。
进一步的,血样采集后置于含血液保存剂的保存管内,将保存管放在冰浴上,送到离心式离心,离心后取上层血浆放入含血液保存剂的保存管内储存。
进一步的,在进行生物样本上机检测前,对血浆样本进行处理,其处理方法为:去100μ血浆样本加入到深孔板内,加入50μ内标工作液,涡旋震荡30s后加入300μl纯乙腈,涡旋震荡1min,4℃,13000rpm条件下离心10min,取上清液10μl加入到预加有990μl的稀释液的深孔板中,将样品板置于酶标板振荡器上,700rpm,室温下震荡5min,以备进样用;其中所述的内标工作液是奥卡西平-D4用甲醇稀释到4000.00ng/ml的溶液;所述的稀释液是ACN:Water=30:70(v/v),含0.1%FA。
进一步的,检测方法采用LC-MS/MS;其中液相条件,流动相:A:0.1%甲酸-水;B:0.1%甲酸-乙腈;流速:0.8000mL/min;柱温:40℃;质谱的离子化方式为ESI,扫描方式为正离子模式。
本申请一种奥卡西平生物等效试验的生物样本分析方法,采用了BNPP以及非肝素或EDTA的抗凝剂,在抗凝血的同时保证了对羧酸酯酶的抑制效果,保证采血后血液储存一段时间后再离心处理取血浆检测仍然能有较高的准确度,从而准确定量检测人血浆样品中的奥卡西平及10,11-二氢-10-羟基卡马西平浓度,以支持基于药代动力学参数比较的奥卡西平制剂生物等效性评价。
具体实施方式
所用的主要试剂和仪器如下:
抗凝采血管1:购自江苏康捷,肝素锂抗凝剂;
抗凝采血管2:购自珠海康利莱,EDTA-K2抗凝剂;
BNPP、草酸钠、氟化钠购自SIGMA(现MERCK);
奥卡西平标准品来源于European Pharmacopoeia;
10,11-二氢-10-羟基卡马西平(奥卡西平的代谢物)标准品购自TorontoResearch Chemicals。
液质联用仪购自AB Sciex(型号:Exion LC AD&TQ5500);色谱柱:购自ThermoScientific(Hypersil GOLD C18(100*4.6mm,5μm),色谱条件为流动相:A:0.1%甲酸-水;B:0.1%甲酸-乙腈;流速:0.8000mL/min;柱温:40℃;质谱的离子化方式为ESI,扫描方式为正离子模式;
雄性SD大鼠:购自广东省医学实验动物中心;
其他设备和试剂采用常规国产或进口型号。
HPLC检测过程
奥卡西平标准品配制成50、100、200、500、1000、2000ng·mL-1,10,11-二氢-10-羟基卡马西平标准品配制成5、10、20、60、100、200、400ng·mL-1。按照实施例前述HPLC步骤检测,计算标准曲线,两者标准曲线在10-10000ng·mL-1和50-50000ng·mL-1范围内均具有良好的线性关系(r为0.9985和0.9991)。
实施例1抗凝剂对羧酸酯酶抑制剂抑制效果干扰的发现
申请人在进行奥卡西平(出于保密原因,暂不公开实验方案)药物代谢研究时发现一种普遍存在的现象,对于同一患者施用药物后同一时间点所取血样,使用肝素采血管加BNPP后处理后保存8-10小时取血浆检测的血药浓度,与采血直接加入BNPP后处理后立即(数分钟)取血浆检测的血药浓度相比仅有50-70%。
实施例2不同抗凝剂对羧酸酯酶抑制剂抑制效果的干扰
取SD大鼠新鲜血液样本,进行不同的如下处理(每个处理三份重复):
处理方法1
使用不加抗凝剂采血管,加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,直接离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法2
使用不加抗凝剂采血管,加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,直接离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法3
使用抗凝采血管1,加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法4
使用抗凝采血管2,加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法5
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量5mg·mL-1的草酸钠),加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法6
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量5mg·mL-1的氟化钠),加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法7
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量3mg·mL-1的草酸钠和3mg·mL-1的氟化钠),加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
结果如下表:
表1:不同抗凝剂对羧酸酯酶抑制剂抑制效果的干扰-1
结果表明草酸钠、氟化钠抗凝剂对羧酸酯酶抑制剂抑制效果的干扰普遍小于肝素和EDTA,两者组合使用时更能保证干扰效果,但8.576的奥卡西平浓度:10,11-二氢-10-羟基卡马西平浓度仍然不能满足药物代谢检测的要求。
进一步比例筛选实验(每个处理三份重复,部分比例筛选实验省略,仅保留有代表性的结果)
处理方法7-1
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量3mg·mL-1的草酸钠和1mg·mL-1的氟化钠),加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法7-2
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量1mg·mL-1的草酸钠和3mg·mL-1的氟化钠),加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法7-3
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量2mg·mL-1的草酸钠和2mg·mL-1的氟化钠),加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
处理方法7-4
使用自制抗凝采血管(其中加入有对应采血量4mg·mL-1的草酸钠和4mg·mL-1的氟化钠),加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP 5mg·mL-1,零下4摄氏度保存8小时后离心取血浆,零下70摄氏度保存72h后检测;
结果如下表:
表2:不同抗凝剂对羧酸酯酶抑制剂抑制效果的干扰-2
结果表明,过高的草酸钠和氟化钠用量并不利于减少干扰(7-4等方案),比例上,草酸钠与氟化钠3:1质量比时(BNPP:草酸钠:氟化钠为5:3:1)时对羧酸酯酶抑制剂抑制效果的干扰接近处理方法2的水平(在奥卡西平/10,11-二氢-10-羟基卡马西平剩余总量上甚至略优于处理方法2),基本可以满足药物代谢检测的要求。
实施例3本申请中的保存剂的实际应用效果
将本申请的保存剂实际用于奥卡西平大鼠血药浓度实验。取得了与加入BNPP后立即取血浆检测基本类似的结果。取一个代表性个体检测结果如下:
表3本申请中的保存剂用于奥卡西平大鼠血药浓度实验
结果表明,本申请的血液保存剂可以在多种药物检测中有效的同时抗凝并抑制羧酸酯酶活性,8-12小时后(基本满足大量样品采集—运输到实验室所需时间)所保存样品的检测结果与即时处理后的检测结果基本相同。
实施例4:LC-MS/MS检测人血浆中奥卡西平及其代谢产物10,11-二氢-10-羟基卡马西平的生物分析方法
1、表1:主要使用的设备
2、表2:分析方法和色谱条件
3、检测样本来源
表3:符合方案要求的受试者样品情况
样本来源和采集地:杭州市第一人民医院;
样本采集情况:
受试者编号:K001~K012;
样本保存管:自制血液采集保存管,含适量草酸钠与氟化钠3:1质量比的保存液;
样本采集后处理:采集血样后加入适量BNPP 5mg·mL-1离心取血浆,干冰保存运输;
所有样品(检测管)自接收之日起储存于-70℃冰箱。
4、表4:分析方法和分析方法效能
5、表5:对照品信息
6、表6:标准曲线
7、表7:LCMSMS(Exion LC AD&TQ5500)的系统适应性
8、表8:受试者样品中待测物(周期1,奥卡西平及10,11-二氢-10-羟基卡马西平)的计算浓度(单位,ng/mL)
试验编号:BMT181001OXC
结果显示:经计算,分析物奥卡西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平的平均准确度均在相应理论浓度的85-115%之间,精密度均≤15%,符合接受标准。
本申请一种奥卡西平生物等效试验的生物样本分析方法,准确定量检测人血浆样品中的奥卡西平及10,11-二氢-10-羟基卡马西平浓度,可以支持基于药代动力学参数比较的奥卡西平制剂生物等效性评价。
Claims (2)
1.一种奥卡西平生物等效试验的生物样本分析方法,包括受试者血样采集、血样处理、生物样本检测和数据分析步骤,生物样本分析的分析物是奥卡西平和10,11-二氢-10-羟基卡马西平,且其标准曲线的范围是:奥卡西平:10~10000 ng/mL ,10,11-二氢-10-羟基卡马西平:50 ~ 50000 ng/mL,其特征在于采血管中加入对应采血量3mg·mL-1的草酸钠和1mg·mL-1的氟化钠,加入奥卡西平标准品乙腈溶液配制成约300ng·mL-1的血液样品,加入BNPP5mg·mL-1,上述血液样品可以在零下4摄氏度保存8-12小时,然后离心取上层血浆。
2.权利要求1所述的奥卡西平生物等效试验的生物样本分析方法,其特征在于离心后的血浆可在零下70摄氏度保存72小时后检测,在进行生物样本上机检测前,对血浆样本进行处理,其处理方法为:取100μ血浆样本加入到深孔板内,加入50μ内标工作液,涡旋震荡30s后加入300μl纯乙腈,涡旋震荡1min,4℃,13000rpm条件下离心10min,取上清液10μl加入到预加有990μl的稀释液的深孔板中,将样品板置于酶标板振荡器上,700rpm,室温下震荡5min,以备进样用;其中所述的内标工作液是奥卡西平-D4用甲醇稀释到4000.00ng/ml的溶液;所述的稀释液是ACN:Water=30:70(v/v),含0.1%FA,检测方法采用LC-MS/MS;其中液相条件,流动相:A:0.1%甲酸-水; B:0.1%甲酸-乙腈;流速:0.8000 mL/min;柱温:40℃;质谱的离子化方式为ESI,扫描方式为正离子模式。
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