CN108195978A - 检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法 - Google Patents
检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明名称为检测血液样品中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,它利用液相色谱分析仪和紫外检测器对标准溶液进行标定,分别拟合得出代表奥卡西平浓度的标准曲线方程为y1=a*x1+b和代表奥卡西平代谢物浓度的标准曲线方程y2=c*x2+d,取待测血液样品,对该待检测血液样品经过前处理后,使用相同的液相色谱分析仪和紫外检测器对待测的样品进行检测,得到待测血液y1和y2值,将待测血液样品的y1和y2分别代入上述两个标准曲线方程中,通过计算分别得到待测血液样品中奥卡西平及其代谢产物的相对浓度x1和x2,内标物工作液浓度是已知的,通过计算可以得到待检测血液样品中的奥卡西平及其代谢产物的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及精神类药物的临床血药浓度监测技术领域,尤其涉及一种检测血液中抗癫痫药物奥卡西平及其代谢产物含量的方法。
背景技术
奥卡西平(Oxcarbazepine,OXC)是一种新型抗癫痫药物,是卡马西平的10-酮基衍生物,分子式为C15H12N2O2,具体结构如图1所示。该药适合于成年人和5岁以上的儿童,治疗部分性和全身强直-阵挛性发作。OXC具有耐受性好,药物间相互作用少等特点,正逐步取代传统抗癫痫药物单用或联合应用。OXC口服吸收迅速,通过胃肠道几乎迅速降解为活性代谢物(以下简称为代谢物)10,11-二氢-10-羟基卡马西平(Monohydroxycarbazepine,MHD)。MHD分子式为C15H14N2O2,化学结构式如图2所示。OXC的药时曲线下面积一般只有MHD的1%-2%,故认为MHD为其在体内的主要药效物质。国外报道MHD控制癫痫发作的血药浓度范围为8-35mg/L,超过该范围时将会出现不良反应。
目前测定血液中奥卡西平及其代谢产物含量通常采用的方法为高效液相色谱法和高效液相色谱质谱联用法。其中,高效液相色谱质谱联用法分析成本高,对场地要求较高,且需要专业人员进行操作,不适合在中小医院广泛开展。高效液相色谱法具有定量准确,重现性好,成本低等优点,但已被报道的文献方法大多存在着前处理操作较复杂,外标法定量易导致结果不够准确,分析时间较长等问题,尚不适于大通量的样本检测。
发明内容
针对上述技术问题,本发明目的是提供一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的方法,将内标法与高效液相色谱法相结合,使奥卡西平及其代谢产物血药含量的测定结果更准确,并缩短样品分析时间。
本发明采用的技术方案是:
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的液相色谱分析方法,其中:它包括以下步骤:
(一)标准溶液的标定
首先用移液器分别移取10μL标准工作液、10μL内标工作液和90μL空白血清或血浆分别置于离心管中混合制成至少三种不同浓度的标准溶液,将上述标准溶液分别在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀1-2min后,加入萃取剂1000μL甲基叔丁基醚,并在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀4-6min后,再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min,得到上清液,对上述标准溶液分别移取800μL上清液并置于另一个离心管中,在常温下用N2缓慢吹干;向上述吹干的离心管中加入100μL由45∶32∶23的水、乙腈和甲醇组成的复溶液,进行溶解,然后在1500-2000rpm转速下涡旋混匀1-2min后,再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min,得到上清液,分别移取上述上清液,利用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述上清液进行检测,得到至少三种不同浓度的奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的标准溶液色谱图,从上述奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的标准溶液色谱图中分别得到奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的峰面积,分别以上述至少三个不同浓度的奥卡西平标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1,以上述奥卡西平标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1,将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归,拟合得到标准曲线方程为y1=a*x1+b,并且得出权重系数a、b;以上述至少三个不同浓度的奥卡西平代谢产物的标准溶液峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2;以上述奥卡西平代谢产物的标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2,将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归,拟合得到标准曲线方程为y2=c*x2+d,并且得出权重系数c、d;所述的标准工作液为含有奥卡西平和奥卡西平代谢产物的溶液,内标工作液为含有2-萘酚的溶液。
(a)标准储备液的配制:
精确称取奥卡西平标准品10mg置于5mL容量瓶,用甲醇进行溶解,并定容于5mL,得到标准储备液A,并在-80℃条件下保存,有效期为1个月;精确称取代谢物标准品10mg置于5mL容量瓶,用50%甲醇溶液进行溶解,并定容于5mL,得到标准储备液B,并在-80℃条件下保存,有效期为1个月;
(b)标准工作液的配制
取适量步骤(a)中标准储备液A与标准储备液B混合,用50-80%的甲醇水溶液进行稀释,所得的标准工作液中奥卡西平浓度为270μg/mL、奥卡西平代谢产物浓度为540μg/mL,然后继续用上述甲醇水溶液进行稀释,分别对浓度范围在20-270μg/mL的奥卡西平和浓度范围在40-540μg/mL奥卡西平代谢产物进行配制,得到不同浓度的标准工作液,并在-80℃条件下保存,有效期为1个月;
(c)内标工作液的配制:
精确称取2-萘酚标准品5mg于5mL容量瓶,用甲醇溶解,并定容至5mL,得到标准储备液C,该内标工作液-80℃条件下保存,有效期为1个月。
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL,在离心速度为3500rpm下离心10min,取上清液得血清或血浆,上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用;
(三)待测样品处理
(d)用移液枪移取10μL步骤(c)的内标工作液于1.5mL的离心管中,然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆,并在1200-2000rpm的转速下涡旋混合1-2min后,向上述离心管中加入萃取剂1000μL甲基叔丁基醚,并在1200-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min后,再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min,得到上清液;
(e)取步骤(d)上清液800μL放入另一支1.5ml离心管中,在常温下用N2缓慢吹干;
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入100μL由45∶32∶23的水、乙腈和甲醇组成的复溶液,然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀1-2min后,再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min,得到上清液即为待测样品;
(四)待测样品的检测
使用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测,得出上述待测样品的奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的色谱图,从上述奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标色谱图中可以得到奥卡西平峰面积、奥卡西平代谢产物峰面积与内标物峰面积,将奥卡西平峰面积与内标物峰面积的比值y1代入上述步骤(一)的标准曲线方程y1=a*x1+b中,通过计算得到待检测样品中奥卡西平与内标物的相对浓度x1,内标物工作液浓度是已知的,由此计算得到该待检测血液样本中的奥卡西平的血药浓度;将奥卡西平代谢产物峰面积与内标物峰面积的比值y2代入上述步骤(一)的标准曲线方程y2=c*x2+d中,通过计算得到待检测样品中奥卡西平代谢产物与内标物的相对浓度x2,内标物工作液浓度是已知的,由此计算得到该待检测血液样本中的奥卡西平代谢产物的血药浓度。
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的液相色谱分析方法,其中:在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液,七种不同浓度的标准工作液分别为含有奥卡西平浓度为20μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为40μg/mL、奥卡西平浓度为30μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为60μg/mL、奥卡西平浓度为60μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为120μg/mL、奥卡西平浓度为80μg/mL和代谢物的浓度160μg/mL、奥卡西平浓度为120μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为240μg/ml、奥卡西平浓度为180μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为360μg/mL、奥卡西平浓度为270μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为540μg/mL的标准工作液。
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物药物含量液相色谱分析方法,其中:在步骤(b)中用由7∶3的甲醇和水组成的稀释液进行稀释。
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的液相色谱分析方法,其中:所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/160.5M。
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的液相色谱分析方法,其中:所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为DIONEX Acclaim 120-C18。
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的液相色谱分析方法,其中:所述高效液相色谱仪设置的柱温为35℃。
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的液相色谱分析方法,其中:所述高效液相色谱仪所使用流动相为含45∶32∶32比例的水、乙腈和甲醇,流速为1mL/min,进样量为0.4μL。
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的液相色谱分析方法,其中:述紫外检测器是VANQISH检测器,其检测波长为302nm,采集频率为2.0Hz。
本发明是一种检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药含量的液相色谱分析方法,其中:所述含水量为体积比的含水量。
本发明有益效果:
本发明所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物含量的方法,将内标法与高效液相色谱法相结合,提高了定量结果的准确性,消除系统误差;并将奥卡西平及其活性代谢产物MHD进行了同时测定,可更全面了解药物在体内的药效物质浓度;并缩短了样本分析时间,使检测过程简便快速,更利于在临床治疗中对患者体内的奥卡西平及其代谢产物的含量进行监测,为奥卡西平的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础。
附图说明
图1为奥卡西平的化学结构式;
图2为奥卡西平代谢产物的化学结构式;
图3为标准溶液中奥卡西平及其代谢产物MHD与内标色谱图;其中,标号1为MHD;标号2为奥卡西平;标号3为内标物2-萘酚;
图4为实施例中加标血清样本中奥卡西平及其代谢产物MHD与内标色谱图;其中,标号1为MHD;标号2为奥卡西平;标号3为内标物2-萘酚。
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
(一)标准溶液的标定
首先用移液器分别移取10μL标准工作液、10μL内标工作液和90μL空白血清或血浆分别置于离心管中混合制成至少三种不同浓度的标准溶液,将上述标准溶液分别在转速为1500rpm下涡旋混匀1min后,加入萃取剂1000μL甲基叔丁基醚,并在转速为2000rpm下涡旋混匀5min后,再在12000rpm的转速下高速离心10min,得到上清液,对上述标准溶液分别移取800μL上清液并置于另一个离心管中,在常温下用N2缓慢吹干;向上述吹干的离心管中加入100μL由45∶32∶23的水、乙腈和甲醇组成的复溶液,进行溶解,然后在2000rpm转速下涡旋混匀1min后,再在12000rpm的转速下高速离心5min,得到上清液,分别移取上述上清液,利用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述上清液进行检测,得到至少三种不同浓度的奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的标准溶液色谱图,从上述奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的标准溶液色谱图中分别得到奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的峰面积,分别以上述至少三个不同浓度的奥卡西平标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1,以上述奥卡西平标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1,将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归,拟合得到标准曲线方程为y1=a*x1+b,并且得出权重系数a、b;以上述至少三个不同浓度的奥卡西平代谢产物的标准溶液峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2;以上述奥卡西平代谢产物的标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2,将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归,拟合得到标准曲线方程为y2=c*x2+d,并且得出权重系数c、d;所述的标准工作液为含有奥卡西平和奥卡西平代谢产物的溶液,内标工作液为含有2-萘酚的溶液;
(a)标准储备液的配制:
精精确称取奥卡西平标准品10mg置于5mL容量瓶,用甲醇进行溶解,并定容于5mL,得到标准储备液A,并在-80℃条件下保存,有效期为1个月;精确称取奥卡西平代谢产物标准品10mg置于5mL容量瓶,用50%甲醇溶液进行溶解,并定容于5mL,得到标准储备液B,并在-80℃条件下保存,有效期为1个月;
(b)标准工作液的配制
取适量步骤(a)中标准储备液A与标准储备液B混合,用70%的甲醇水溶液进行稀释,所得含有奥卡西平浓度为270μg/mL、奥卡西平代谢产物浓度为540μg/mL的标准工作液,然后继续用上述甲醇水溶液进行稀释,得到含有奥卡西平浓度为20μg/mL和奥卡西平代谢产物的浓度40μg/mL、奥卡西平浓度为30μg/mL和代谢物的浓度60μg/mL、奥卡西平浓度为60μg/mL和代谢物的浓度120μg/mL、奥卡西平浓度为80μg/mL和代谢物的浓度160μg/mL、奥卡西平浓度为120μg/mL和代谢物的浓度240μg/mL、奥卡西平浓度为180μg/mL和代谢物的浓度360μg/mL、奥卡西平浓度为270μg/mL和代谢物的浓度540μg/mL的标准工作液;
(c)内标工作液的配制:
精确称取2-萘酚标准品5mg于5mL容量瓶,用甲醇溶解,并定容至5mL,得到标准储备液C,该内标工作液-80℃条件下保存,有效期为1个月。
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL,在离心速度为3500rpm下离心10min,取上清液得血清或血浆,上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用;
(三)待测样品处理
(d)用移液枪移取10μL步骤(c)的内标工作液于1.5mL的离心管中,然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆,并在1500rpm的转速下涡旋混合1min后,向上述离心管中加入萃取剂1000μL甲基叔丁基醚,并在2000rpm的转速下涡旋混合5min后,再在12000rpm的转速下高速离心10min,得到上清液;
(e)取步骤(d)上清液800μL放入另一支1.5mL离心管中,在常温下用N2缓慢吹干;
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入100μL由45∶32∶23的水、乙腈和甲醇组成的复溶液,然后在2000rpm转速下涡旋混匀1min后,再在12000rpm的转速下高速离心5min,得到上清液即为待测样品;
(四)待测样品的检测
使用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测,得出上述待测样品的奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的色谱图,从上述奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标色谱图中可以得到奥卡西平峰面积、奥卡西平代谢产物峰面积与内标物峰面积,将奥卡西平峰面积与内标物峰面积的比值y1代入上述步骤(一)的标准曲线方程y1=a*x1+b中,通过计算得到待检测样品中奥卡西平与内标物的相对浓度x1,内标物工作液浓度是已知的,由此计算得到该待检测血液样本中的奥卡西平的血药浓度;将奥卡西平代谢产物峰面积与内标物峰面积的比值y2代入上述步骤(一)的标准曲线方程y2=c*x2+d中,通过计算得到待检测样品中奥卡西平代谢产物与内标物的相对浓度x2,内标物工作液浓度是已知的,由此计算得到该待检测血液样本中的奥卡西平代谢产物的血药浓度。
高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/160.5M。所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为DIONEX Acclaim 120-C18,5μm,4.6mm×250mm;高效液相色谱仪设置的柱温为35℃;使用流动相为含45∶32∶32比例的水、乙腈和甲醇,流速为1mL/min,进样量为0.4μL。紫外检测器是VANQISH检测器,其检测波长为302nm,采集频率为2.0Hz,分析时间为11min;含水量为体积比的含水量。
本实施例中技术方法论证如下:
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的10μL的各个浓度的奥卡西平及MHD混合标准工作液,分别加入10μL内标工作液,并加入空白血清或血浆90μL混匀,经前处理后进样分析,按本实施例测定条件,按浓度由低到高进行测定,以定量色谱峰面积-浓度作图,得到标准曲线,结果表明线性范围和定量限如下:
(1)检测限(LOD):奥卡西平为0.062μg/mL;MHD为0.218μg/mL。
(2)定量限(LOQ):奥卡西平为0.208μg/mL:MHD为0.727μg/mL。
(3)线性范围:
奥卡西平在2μg/mL到270μg/mL范围内,线性良好,相关系数R2>0.99;MHD在4μg/mL到540μg/mL范围内,线性良好,相关系数R2>0.99。
二、该方法的回收率和精密度
分别取奥卡西平和MHD标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验,按本实施例方法进行测定,重复分析测定6批次,奥卡西平和MHD回收率和精密度分别如表1和表2所示。奥卡西平在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为97.49%~101.10%,相对标准偏差为0.98%~2.94%,结果见表1。MHD在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为100.55%~104.08%,相对标准偏差为1.31%~4.04%,结果见表2。
加标量 | 3μg/mL | 8μg/mL | 18μg/mL |
平均回收率 | 98.92% | 101.10% | 97.49% |
精密度RSD | 2.91% | 2.94% | 0.98% |
表1奥卡西平加标回收率和精密度
加标量 | 6μg/mL | 16μg/mL | 36μg/mL |
平均回收率 | 101.57% | 104.08% | 100.55% |
精密度RSD | 3.10% | 4.04% | 1.31% |
表2MHD加标回收率和精密度
综合上述验证试验,本实施例的检测限,回收率和精密度等各项技术指标均符合要求,方法检测血液中奥卡西平及其代谢产物含量,重现性良好,加样回收率高,提高了检测结果的准确度。
血清样本中奥卡西平及其代谢产物MHD和内标的色谱图见图4,标准溶液中奥卡西平及其代谢产物MHD和内标的色谱图见图3,奥卡西平、MHD和2-萘酚的保留时间分别为5.40min、4.21min和9.13min,由图3和图4可知本实施例方法以2-萘酚为内标,系统误差得以消除,目标化合物的识别更为准确,且分析时间短、干扰小,特异性强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种检测血液样品中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:它包括以下步骤:
(一)标准溶液的标定
首先用移液器分别移取10μL标准工作液、10μL内标工作液和90μL空白血清或血浆分别置于离心管中混合制成至少三种不同浓度的标准溶液,将上述标准溶液分别在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀1-2min后,加入萃取剂1000μL甲基叔丁基醚,并在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀4-6min后,再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min,得到上清液,对上述标准溶液分别移取800μL上清液并置于另一个离心管中,在常温下用N2缓慢吹干;向上述吹干的离心管中加入100μL由45∶32∶23的水、乙腈和甲醇组成的复溶液,进行溶解,然后在1500-2000rpm转速下涡旋混匀1-2min后,再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min,得到上清液,分别移取上述上清液,利用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述上清液进行检测,得到至少三种不同浓度的奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的标准溶液色谱图,从上述奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的标准溶液色谱图中分别得到奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的峰面积,分别以上述至少三个不同浓度的奥卡西平标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1,以上述奥卡西平标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1,将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归,拟合得到标准曲线方程为y1=a*x1+b,并且得出权重系数a、b;以上述至少三种不同浓度的奥卡西平代谢产物的标准溶液峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y2:以上述奥卡西平代谢产物的标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x2,将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归,拟合得到标准曲线方程为y2=c*x2+d,并且得出权重系数c、d;
上文所述的标准工作液为含有奥卡西平和奥卡西平代谢产物的溶液,内标工作液为含有2-萘酚的溶液;
(a)标准储备液的配制:
精确称取奥卡西平标准品10mg置于5mL容量瓶,用甲醇进行溶解,并定容于5mL,得到标准储备液A,并在-80℃条件下保存,有效期为1个月;精确称取奥卡西平代谢产物标准品10mg置于5mL容量瓶,用50%甲醇溶液进行溶解,并定容于5mL,得到标准储备液B,并在-80℃条件下保存,有效期为1个月;
(b)标准工作液的配制
取适量步骤(a)中标准储备液A与标准储备液B混合,用50-80%的甲醇水溶液进行稀释,所得的标准工作液中奥卡西平浓度为270μg/mL、奥卡西平代谢产物浓度为540μg/mL,然后继续用上述甲醇水溶液进行稀释,分别对浓度范围在20-270μg/mL的奥卡西平和浓度范围在40-540μg/mL奥卡西平代谢产物进行配制,得到不同浓度的标准工作液,并在-80℃条件下保存,有效期为1个月;
(c)内标工作液的配制:
精确称取2-萘酚标准品5mg于5mL容量瓶,用甲醇溶解,并定容至5mL,得到标准储备液C,该内标工作液-80℃条件下保存,有效期为1个月。
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5mL,在离心速度为3500rpm下离心10min,取上清液得血清或血浆,上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用;
(三)待测样品处理
(d)用移液枪移取10μL步骤(c)的内标工作液于1.5mL的离心管中,然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆,并在1200-2000rpm的转速下涡旋混合1-2min后,向上述离心管中加入萃取剂1000μL甲基叔丁基醚,并在1200-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min后,再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min,得到上清液;
(e)取步骤(d)上清液800μL放入另一支1.5ml离心管中,在常温下用N2缓慢吹干;
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入100μL由45∶32∶23的水、乙腈和甲醇组成的复溶液,然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀1-2min后,再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min,得到上清液即为待测样品;
(四)待测样品的检测
使用液相色谱分析仪和紫外检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测,得出上述待测样品的奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标物的色谱图,从上述奥卡西平、奥卡西平代谢产物和内标色谱图中可以得到奥卡西平峰面积、奥卡西平代谢产物峰面积与内标物峰面积,将奥卡西平峰面积与内标物峰面积的比值y1代入上述步骤(一)的标准曲线方程y1=a*x1+b中,通过计算得到待检测样品中奥卡西平与内标物的相对浓度x1,内标物工作液浓度是已知的,由此计算得到该待检测血液样本中的奥卡西平的血药浓度;将奥卡西平代谢产物峰面积与内标物峰面积的比值y2代入上述步骤(一)的标准曲线方程y2=c*x2+d中,通过计算得到待检测样品中奥卡西平代谢产物与内标物的相对浓度x2,内标物工作液浓度是已知的,由此计算得到该待检测血液样本中的奥卡西平代谢产物的血药浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液,七种不同浓度的标准工作液分别为含有奥卡西平浓度为20μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为40μg/mL、奥卡西平浓度为30μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为60μg/mL、奥卡西平浓度为60μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为120μg/mL、奥卡西平浓度为80μg/mL和代谢物的浓度160μg/mL、奥卡西平浓度为120μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为240μg/ml、奥卡西平浓度为180μg/mL和奥卡西平代谢产物浓度为360μg/mL、奥卡西平浓度为270μg/mLl和奥卡西平代谢产物浓度为540μg/mL的标准工作液。
3.如权利要求2所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:在步骤(b)中用由7∶3的甲醇和水组成的稀释液进行稀释。
4.如权利要求3所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER1/160.5M。
5.如权利要求3所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为DIONEX Acclaim 120-C18。
6.如权利要求3所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:所述高效液相色谱仪设置的柱温为35℃。
7.如权利要求3所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:所述高效液相色谱仪所使用流动相为含45∶32∶32比例的水、乙腈和甲醇,流速为1mL/min,进样量为0.4μL。
8.如权利要求3至7之一所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:所述紫外检测器是VANQISH检测器,其检测波长为302nm,采集频率为2.0Hz。
9.如权利要求8所述的检测血液中奥卡西平及其代谢产物血药浓度的液相色谱分析方法,其特征在于:所述含水量为体积比的含水量。
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