CN108241031A - 检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明检测血液中茶碱药物浓度的方法是使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的茶碱药物浓度，该方法提高了定量结果的准确性，消除系统误差；缩短了样本处理时间，使检测过程简便快速，更利于在临床治疗中对患者体内的茶碱血药浓度进行监测，为茶碱的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础。
Description
技术领域
本发明涉及精神类药物的临床血药浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测血液中茶碱药物浓度的方法。
背景技术
茶碱(Theophylline)是黄嘌呤类抗支气管痉挛药，具有良好的平喘、抗炎作用，几十年来一直是治疗支气管哮喘等急、慢性肺部疾病的常用药物。茶碱分子式为C7H8N4O2，化学结构式如图1所示。茶碱的有效血药浓度为10-20μg/mL，低于10μg/mL疗效不显著，高于20μg/mL则易出现严重毒副作用。由于其个体差异较大，治疗剂量与中毒剂量较接近，安全范围较窄，剂量过大或给药速度太快，易引起严重毒性反应甚至死亡。因此要使血药浓度维持在有效水平，保证临床用药达到预期疗效，有必要进行茶碱血药浓度监测，以便制定合理的个体化给药方案。
目前测定茶碱血清或血浆或血浆浓度常采用的方法大致有紫外分光光度法、荧光偏振免疫分析法、化学发光酶免疫分析法、放射免疫法、高效液相色谱法、液相色谱法质谱联用法等。其中，紫外分光光度易受其他物质干扰，可能导致定量不准确，且所用样本量与试剂量均偏大；荧光偏振免疫分析法仪器及试药的价格较高，难以在中小医院推广使用；化学发光酶免疫分析法的定标有效期短，难以在实际临床应用中较好调控；液相色谱法质谱联用法分析成本高，对场地及人员要求较高。高效液相色谱法具有定量准确，重现性好，成本低等优点，但目前仍存在前处理操作较复杂，外标法定量易导致结果不够准确，分析时间较长等问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是提供一种检测血液中茶碱药物浓度的方法，将内标法与高效液相色谱法相结合，使茶碱血药浓度的测定快速准确，并通过简化前处理步骤，缩短样品处理时间。
本发明采用的技术方案是：
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL分别与10μL内标工作液和90ul空白血清或空白血浆混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，再分别加入含有甲醇的乙腈沉淀蛋白试剂300uL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，然后在10000-15000rpm的转速下高速离心，10-12min，得到至少三种标准溶液的上清液，使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对上述标准溶液的上清液进行检测，得出上述至少三种标准工作液和内标色谱图，在上述标准工作液和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为茶碱溶液，所述内标工作液为可可碱溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取茶碱标准品20mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有1-1000μg/mL茶碱的范围内配置出各标准工作液；
(b)内标工作液的配制：
精确称取可可碱标准品1mg置于10mL容量瓶用纯水溶解，并定容于10mL，得到内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s-1min；
(d)用移液枪移取300uL的含有甲醇的乙腈沉淀蛋白试剂加入步骤(c)的离心管中，在1200-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min，然后在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)的待测样品上清液100uL，使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对上述待测样品上清液进行检测，得出上述待测的样品的茶碱和内标色谱图，在上述茶碱和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的茶碱药物浓度；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有茶碱的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有可可碱的浓度；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有10、20、40、80、160、200、400μg/mL浓度的茶碱溶液；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述沉淀蛋白试剂是含有0-30％体积甲醇的乙腈混合溶液；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为Agilent 1290Infinity inline filter；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪设置的柱温为26℃；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用流动相为甲醇-水，并且等度洗脱，流速为1mL/min，分析时间为3min；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述DAD检测器的检测波长为274nm；
本发明的检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其中：所述含水量为体积比的含水量。
本发明有益效果：
本发明所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，将内标法与高效液相色谱法相结合，提高了定量结果的准确性，消除系统误差；并优化前处理步骤，缩短了样本处理时间，使检测过程简便快速，更利于在临床治疗中对患者体内的茶碱血药浓度进行监测，为茶碱的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础。
附图说明
图1为茶碱化学结构式；
图2为实施例中标准溶液中茶碱及其内标色谱图；其中，1-茶碱；2-可可碱；
图3为实施例中加标血清或血浆样本中茶碱及其内标色谱图；其中，1-茶碱；2-可可碱；
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
本发明检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将七种不同浓度的标准工作液10μL分别与10μL内标工作液和90ul空白血清或空白血浆混合制成七种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀30s，再分别加入含有甲醇的乙腈沉淀蛋白试剂300uL，其中沉淀蛋白试剂是含有0-30％体积甲醇的乙腈混合溶液，并在转速为2000rpm下涡旋混匀3min后，然后在12000rpm的转速下高速离心，10min，得到七种标准溶液的上清液，使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对上述标准溶液的上清液进行检测，得出上述七种标准工作液和内标色谱图，在上述标准工作液和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有茶碱的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有可可碱的浓度；
(a)标准工作液的配制：
精确称取茶碱标准品20mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有10、20、40、80、160、200、400μg/mL茶碱浓度的范围内配置出各标准工作液，该标准工作液现用现配；
(b)内标工作液的配制：
精确称取可可碱标准品1mg置于10mL容量瓶，用纯水溶解，并定容于10mL，得到内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s；
(d)用移液枪移取300uL的含有甲醇的乙腈沉淀蛋白试剂加入步骤(c)的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋混合3min，然后在12000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)的待测样品上清液100uL，使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对上述待测样品上清液进行检测，得出上述待测的样品的茶碱和内标色谱图，在上述茶碱和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的茶碱药物浓度。
高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为Agilent 1290Infinity inline filter；色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18，柱温为26℃，流动相为甲醇-水，并且等度洗脱，流速为1mL/min，分析时间为3min。
DAD检测器的检测波长为274nm。
如无特殊说明，本申请文件中的含水量为体积比的含水量。
本实施例中技术方法论证如下：
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的10μL的各个浓度的茶碱标曲工作液，加入10μL内标工作液，并加入空白血清或血浆或血浆90μL混匀，经前处理后进样分析，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明茶碱的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：0.0625μg/mL。
(2)定量限(LOQ)：0.1250μg/mL。
(3)线性范围：
茶碱在1μg/mL到1000μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2＞0.99。
二、该方法的回收率和精密度
取茶碱标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表1。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为98.0％～102.8％，相对标准偏差为0.51％～0.96％，结果见表1。
表1茶碱加标回收率和精密度
| 加标量 | 2μg/mL | 8μg/mL | 20μg/mL |
| 平均回收率 | 98.0％ | 98.7％ | 102.8％ |
| 精密度RSD | 0.51％ | 0.96％ | 0.68％ |
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中茶碱药物浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
血清或血浆或血浆样本中茶碱及其内标的色谱图见图2，标准溶液中茶碱及其内标的色谱图见图3，茶碱和可可碱的保留时间分别为2.54min和1.69min，由图2和图3可知本实施例方法以可可碱为内标，系统误差得以消除，目标化合物的识别更为准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测血液中茶碱药物含量的液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL分别与10μL内标工作液和90ul空白血清或空白血浆混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，再分别加入含有甲醇的乙腈沉淀蛋白试剂300uL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，然后在10000-15000rpm的转速下高速离心，10-12min，得到至少三种标准溶液的上清液，使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对上述标准溶液的上清液进行检测，得出上述至少三种标准工作液和内标色谱图，在上述标准工作液和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为茶碱溶液，所述内标工作液为可可碱溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取茶碱标准品20mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有1-1000μg/mL茶碱的范围内配置出各标准工作液；
(b)内标工作液的配制：
精确称取可可碱标准品1mg置于10mL容量瓶，用纯水溶解，并定容于10mL，得到内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得到血消或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入100μL步骤(二)中所述血清或血浆，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s-1min；
(d)用移液枪移取300uL的含有甲醇的乙腈沉淀蛋白试剂加入步骤(c)的离心管中，在1200-2000rpm的转速下涡旋混合4-6min，然后在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(d)的待测样品上清液100uL，使用液相色谱分析仪器和DAD检测器对上述待测样品上消液进行检测，得出上述待测的样品的茶碱和内标色谱图，在上述茶碱和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的茶碱药物浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有茶碱的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有可可碱的浓度。
3.如权利要求2所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有10、20、40、80、160、200、400μg/mL浓度的茶碱溶液。
4.如权利要求3所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述沉淀蛋白试剂是含有0-30％体积甲醇的乙腈混合溶液。
5.如权利要求4所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为Agilent 1290 Infinity inline filter。
6.如权利要求4所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18。
7.如权利要求4所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪设置的柱温为26℃。
8.如权利要求8所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用流动相为甲醇-水，并且等度洗脱，流速为1mL/min，分析时间为3min。
9.如权利要求5-8任意一个权利要求所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述DAD检测器的检测波长为274nm。
10.如权利要求9所述的检测血液中茶碱药物浓度的方法，其特征在于：所述含水量为体积比的含水量。
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