CN108303488A - 一种检测血液中氯硝西泮含量的液相色谱分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法是使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度，该方法具有快速、提取率高、重现性好、专属性好、分离效率高和定量分析准确的优点，可满足抗癫痫药物氯硝西泮血药浓度监测的要求，为临床氯硝西泮的个性化给药提供依据。

Description

一种检测血液中氯硝西泮含量的液相色谱分析方法
技术领域
本发明涉及精神类药物的临床血药浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法。
背景技术
氯硝西泮(Clonazepam，CZP)为广谱抗惊厥药，也可用于焦虑性神经症，是一种高阶苯二氮卓类药物。其分子式为C15H10ClN3O3，化学结构为1，3-二氢-7-硝基-5-(2-氯苯基)-2H-1，4-苯并二氮杂卓-2酮，具体结构式如图1所示。氯硝西泮临床应用于治疗神经性疾病，其治疗窗窄，有效血药浓度仅为20-70ng/mL；而且个体间药动学特征差异大，临床主张个性化给药。不良反应以中枢系统症状多见，也可出现行为异常，血药浓度超过100μg/mL时可见发作加频。因此，在临床治疗中，对氯硝西泮进行及时准确的血药浓度监测十分必要。
目前，氯硝西泮的检测方法主要包括薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法。在众多的方法中，液相色谱法为测定氯硝西泮的首选方法。以往方法存在前处理复杂、干扰因素多、分析时间长、灵敏度不高、定性定量不够准确的问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是提供一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，该方法定量准确，成本低，普适性高。
本发明采用的以下技术方案：
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL分别和10μL内标工作液及由1∶1的甲醇和水组成的80μL复溶液混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀1-5min后，使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的氯硝西泮和内标色谱图，在上述氯硝西泮和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为氯硝西泮溶液，所述内标工作液为硝西泮溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取氯硝西泮标准品10mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有200ng/mL-2000ng/mL氯硝西泮的范围内配置出各标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)内标工作液的配制：
精确称取硝西泮标准品10mg置于10mL容量瓶，用含水量为0％-25％甲醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到浓度为650ng/mL的内标工作液，并在-20℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清或血浆，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合20s-1min；
(d)用移液枪移取1.25mL由1∶2-4的二氯甲烷与乙酸乙酯组成的萃取剂加入步骤(c)的离心管中，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合4-6min，再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，得到上清液；
(e)取步骤(d)上清液1mL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入由1∶1的甲醇和水组成的复溶液100μL，然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀30s-1min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心2-4min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测，得出上述待测的样品的氯硝西泮和内标色谱图，在上述氯硝西泮和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是己知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度。
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：所述上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有氯硝西泮的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有硝西泮的浓度；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：所述七种不同浓度的标准工作液分别为含有200、400、600、800、1000、1500、2000ng/mL浓度的氯硝西泮溶液；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：在步骤(d)中所述萃取剂是由1∶3的二氯甲烷与乙酸乙酯组成的萃取剂，标准储备液A和标准内标储备液B均以甲醇溶解配制，配制标准工作液和内标工作液的稀释液中甲醇与水的比例为7∶3；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：所述紫外检测器是VANQISH检测器，其检测波长为310nm，在线过滤器为Agilent 1290 Infinity inlinefilter；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为Waters公司的SunFireC18；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：所述高效液相色谱仪设置的柱温为35℃；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用流动相为含0.05％甲酸的乙腈和水溶液，其中乙腈和水的体积比例为34∶66，高效液相色谱仪进样量为30μL，使用等度洗脱程序，流速为0.4ml/min，分析时间为6.5min；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：所述含水量为体积含水量。
本发明有益效果：
本发明所述的检测血液中氯硝西泮浓度的方法，快速，提取率高，重现性好，专属性好，分离效率高，定量分析准确，可满足抗癫痫药物氯硝西泮血药浓度监测的要求，为临床氯硝西泮的个性化给药提供依据。
附图说明
图1为氯硝西泮化学结构式；
图2为实施例中标准溶液中氯硝西泮及其内标色谱图；其中，1-氯硝西泮；2-硝西泮；
图3为实施例中加标血清或血浆样本中氯硝西泮及其内标色谱图；其中，1-氯硝西泮；2-硝西泮；
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
本实施例中技术方法论证如下：
本发明的一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将七种不同浓度的标准工作液10μL分别和10μL内标工作液及由1∶1的甲醇和水组成的80μL复溶液混合制成七种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀3min后，使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述标准溶液进行检测，得出上述七种标准溶液的氯硝西泮和内标色谱图，在上述氯硝西泮和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为氯硝西泮溶液，所述内标工作液为硝西泮溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取氯硝西泮标准品10mg置于10ml容量瓶，用甲醇进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为30％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有氯硝西泮浓度为200、400、600、800、1000、1500和2000ng/mL下配置出各标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)内标工作液的配制：
精确称取硝西泮标准品10mg置于10mL容量瓶，用甲醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含水量为30％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到浓度为650ng/mL的内标工作液，并在-20℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清或血浆，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合30s；
(d)用移液枪移取1.25mL由1∶3的二氯甲烷与乙酸乙酯组成的萃取剂加入步骤(c)的离心管中，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合5min，再在12000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液；
(e)取步骤(d)上清液1mL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入由1∶1的甲醇和水组成的复溶液100μL，然后在2000rpm转速下涡旋混匀1min后，再在12000rpm的转速下高速离心3min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述步骤(f)90uL待测样品进行检测，得出上述待测的样品的氯硝西泮和内标色谱图，在上述氯硝西泮和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度。
上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有氯硝西泮的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有硝西泮的浓度。
紫外检测器是VANQISH检测器，其检测波长为310nm，在线过滤器为Agilent 1290Infinity inline filter；高效液相色谱仪所使用的色谱柱为Waters公司的SunFireC18；柱温为35℃；高效液相色谱仪所使用流动相为含0.05％甲酸的乙腈和水溶液，其中乙腈和水的体积比例为34：66，高效液相色谱仪的进样量为30μL，使用等度洗脱程序，流速为0.4ml/min，分析时间为6.5min；
如果没有特别声明，在本发明中含水量为体积含水量。
该方法的线性关系和定量限
将上述配制的10μL的各个浓度的氯硝西泮标准工作液，加入10μL内标工作液，并加入复溶液80μL混匀进样，按本实施例测定条件浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明氯硝西泮的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：10ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：20ng/mL。
(3)线性范围：
氯硝西泮在200ng/mL到2000ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2＞0.999。
二、该方法的回收率和精密度
取氯硝西泮标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如下表1。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为98.26％～105.54％，相对标准偏差为2.23％～3.31％，结果见表1。
表1氯硝西泮加标回收率和精密度
加标量 40ng/mL 80ng/mL 150ng/mL
平均回收率 98.26％ 100.97％ 105.54％
精密度RSD 2.23％ 2.11％ 3.31％
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中氯硝西泮药物浓度，重现性良好，分析时间短，且加样回收率得到提高，从而提高了检测结果的准确度。
血清或血浆样本中氯硝西泮及其内标的色谱图见图3，标准溶液中氯硝西泮及其内标的色谱图见图2，氯硝西泮和硝西泮的保留时间分别为5.073min和4.196min，由图2和图3可知本实施例方法以硝西泮为内标，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标标准曲线法具有较高准确度。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先将至少三种不同浓度的标准工作液10μL分别和10μL内标工作液及由1∶1的甲醇和水组成的80μL复溶液混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀1-5min后，使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述标准溶液进行检测，得出上述至少三种标准溶液的氯硝西泮和内标色谱图，在上述氯硝西泮和内标色谱图中分别得到标准目标物峰面积与内标物峰面积，以上述至少三个标准目标物峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液浓度与内标工作液浓度的比值即相对浓度为作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b；所述标准工作液为氯硝西泮溶液，所述内标工作液为硝西泮溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取氯硝西泮标准品10mg置于10ml容量瓶，用含水量为0％-25％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10ml，得到标准储备液A，将标准储备液A用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，分别在含有200ng/mL-2000ng/mL氯硝西泮的范围内配置出各标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)内标工作液的配制：
精确称取硝西泮标准品10mg置于10mL容量瓶，用含水量为0％-25％甲醇溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，将标准储备液B用含水量为25％-60％的甲醇溶液的稀释液进行稀释，得到浓度为650ng/mL的内标工作液，并在-20℃条件下保存；
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取10μL步骤(b)中所述内标工作液于1.5ml离心管中，然后加入200μL步骤(二)中所述血清或血浆，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合20s-1min；
(d)用移液枪移取1.25mL由1∶2-4的二氯甲烷与乙酸乙酯组成的萃取剂加入步骤(c)的离心管中，在1200-2000rpm的转速下涡旋震荡混合4-6min，再在10000-15000rpm的转速下高速离心8-12min，得到上清液；
(e)取步骤(d)上清液1mL放入另一支1.5ml离心管中，在常温下用N2缓慢吹干；
(f)向步骤(e)的上述吹干的离心管中加入由1∶1的甲醇和水组成的复溶液100μL，然后在1200-2000rpm转速下涡旋混匀30s-1min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心2-4min，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
使用液相色谱分析仪器和紫外检测器对上述步骤(f)待测的样品进行检测，得出上述待测的样品的氯硝西泮和内标色谱图，在上述氯硝西泮和内标色谱图中得到待测目标物峰面积与内标物峰面积，将待测目标物峰面积与内标物峰面积的比值y代入上述步骤(一)的标准曲线方程中，通过计算得到待检测样品中目标物相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述上述标准工作液浓度指标准工作液中所含有氯硝西泮的浓度，内标工作液浓度指内标工作液中所含有硝西泮的浓度。
3.如权利要求2所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液。
4.如权利要求3所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述七种不同浓度的标准工作液分别为含有200、400、600、800、1000、1500、2000ng/mL浓度的氯硝西泮溶液。
5.如权利要求4所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：在步骤(d)中所述萃取剂是由1∶3的二氯甲烷与乙酸乙酯组成的萃取剂，标准储备液A和标准内标储备液B均以甲醇溶解配制，配制标准工作液和内标工作液的稀释液中甲醇与水的比例为7∶3。
6.如权利要求5所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述紫外检测器是VANQISH检测器，其检测波长为310nm，在线过滤器为Agilent 1290 Infinityinline filter。
7.如权利要求5所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的色谱柱为Waters公司的SunFireC18。
8.如权利要求5所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪设置的柱温为35℃。
9.如权利要求5所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用流动相为含0.05％甲酸的乙腈和水溶液，其中乙腈和水的体积比例为34∶66，高效液相色谱仪的进样量为30μL，使用等度洗脱程序，流速为0.4ml/min，分析时间为6.5min。
10.如权利要求5至9之一所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，其特征在于：所述含水量为体积含水量。
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