CN101093214B - 一种测定抗癫痫药物血药浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属医学检验领域,涉及体内药物的分析测定方法,具体涉及一种测定抗癫痫药物血药浓度的方法。本方法将待测样品预处理后,经酸性流动相在色谱柱分离后,用紫外检测器同时检测抗癫痫药物苯巴比妥,拉莫三嗪,奥卡西平和单羟奥卡西平的定量浓度,本方法样品取样少,前处理简单、快速、灵敏,不受内源性物质和常用合并用药的干扰,无需昂贵的设备和试剂,分析周期短,成本低,适合于临床常规治疗药物血药浓度的监测。
Description
技术领域
本发明属医学检验领域,涉及体内药物的分析测定方法,具体涉及一种测定抗癫痫药物血药浓度的方法。
背景技术
苯巴比妥(Phenobarbital,PB)、拉莫三嗪(Lamotrigine,LTG)、奥卡西平(Oxcarbazepine,OXC)是临床上常用的抗癫痫药物。其中,奥卡西平OXC在体内可迅速代谢为活性代谢产物单羟奥卡西平(Monohydroxycarbazepine,MHD)。由于这些药物的药动学个体间差异大,治疗窗窄且药动学特征、抗癫痫效果与药物不良反应有相关关系,因此开展上述药物的治疗药物监测有重要的临床意义。
目前国内外测定抗癫痫药物血药浓度的方法主要是有高效液相色谱法(HPLC)和免疫法。免疫法只能测定PB,其他药物的测定只能采用HPLC法。文献报道的方法存在种种弊端:如操作繁琐费时,效率低,测定周期长,所需仪器设备或试剂价格昂贵,分析成本高,不适合常规治疗药物浓度监测。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速测定抗癫痫药物血药浓度的方法。本方法用于测定人血浆、血清中苯巴比妥(PB)、拉莫三嗪(LTG)、奥卡西平(OXC)和单羟奥卡西平(MHD)的定量浓度。
本方法无需昂贵的设备和试剂,具有操作简便,快速,灵敏度高,血浆用量少,成本低等优点,适合常规治疗药物浓度监测。
本方法将待测样品预处理后,经酸性流动相在色谱柱分离后,用紫外检测器检测,采用下述步骤进行:
1)样品预处理
定量分取血浆或血清样品,加入有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀,所述的蛋白沉淀剂选自甲醇或乙腈或甲醇和乙腈混合物;
2)样品分离与分析
采用通用型的液相色谱柱,其填料为ZORBAX Eclipse XDBC18高效液相系统采用通用型的紫外检测器以及高压泵,流动相采用甲醇和酸性水溶液的混合物为流动相,等度洗脱;
3)紫外检测器检测,测峰面积,用标准曲线方程换算浓度。
与现有技术相比,本方法具有以下特点:
1、预处理方法:简单的一步有机溶媒蛋白沉淀法,操作简便、价廉,适用于临床常规检测。
2、分离条件:分离采用填料为ZORBAX Eclipse XDB C18的色谱柱为固定相,甲醇和水(pH=2.1~2.5)的混合物为流动相,等度洗脱,10分钟内完成(PB)、(LTG)、(OXC)(MHD)四种抗癫痫药物的分离,内源性物质和常用合并用药不干扰上述四种药物的测定。
3、检测时针对不同的待测药物采用不同的波长,避免内源性物质的干扰,获得最佳的响应信号。4、内标采用价廉易得的药物氯唑沙宗,安全性好且有合适的保留时间。
本发明方法快速准确、灵敏度高、操作简便、成本低、适合于临床常规监测。PB、LTG、OXC和MHD线性范围分别为5~100,1~50,0.5~50,2~100mg/L,线性相关系数(r)均大于0.999,方法平均回收率分别为101.3%,100.7%,96.7%和101.5%,日内和日间精密度RSD分别小于5.01%,8.16%,10.54%和9.04%。
附图说明
图1是典型色谱图
其中,A:空白血浆(A1:240nm,A2:215nm);B:空白血浆+标准品(B1:240nm,B2:215nm);C:服用奥卡西平200mg tid的癫痫患者的色谱图(C1:240nm,C2:215nm);D:服用苯巴比妥30mg qd和拉莫三嗪125mg tid的癫痫患者的色谱图(D1:240nm,D2:215nm);图中1:拉莫三嗪,2:苯巴比妥,3:单羟奥卡西平,4:奥卡西平,5:内标,氯唑沙宗。
具体实施方式
实施例1
色谱条件
Waters2690HPLC系统,Waters2487双波长紫外检测器、Millennium32色谱工作站(Version4.0);色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDBXDB C18(150mm×4.6mm,5μm);柱温:40℃;流动相:甲醇∶0.1%乙酸液(pH2.3±0.2)(38∶62,V/V);流速:1.5mL/min;215nm测定PB和MHD的浓度,240nm测定LMG和OXC的浓度。
血浆样品预处理
精密吸取100μL血浆置1.5mL Eppendorf管中,加20μg·mL-1氯唑沙宗甲醇工作液300μL,涡旋振荡10s,离心(12000×g,4℃)10min,取上清液20μL进样。内标法以峰面积定量。
选择性
取不同来源的10位健康志愿者的血样和未服用PB、LTG、OXC和MHD的癫痫患者的20例血样,按照上述样品制备和测定方法进行测定,未发现内源性物质对上述测定组分有干扰。由于癫痫患者中合并用药现象较为常见,故对常见合并用抗癫痫药卡马西平、苯妥英、丙戊酸、安定、硝基安定、氯硝基安定、扑米酮以及其他常用药物对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、安替比林、胃复安等进行考察。结果未发现上述常见合并用药对测定组分有干扰。结果显示,内标氯唑沙宗、PB、LTG、OXC和MHD的典型色谱保留时间分别为8.0,4.5,3.2,7.0和5.2min,各测试组分峰形良好、分离完全。整个色谱分析过程时间为9min。
线性试验
分别配制含1000mg/L PB、LTG、OXC和MHD的甲醇标准工作液,并稀释成合适的浓度梯度,空白血浆稀释定容至4mL,配成含PB5,15,25,50,75,100mg/L,LTG1,5,12.5,25,37.5,50mg/L,OXC0.5,2.5,12.5,25,37.5,50mg/L,MHD2,10,25,50,75,100mg/L的系列标准曲线血样。各取血浆100μL,按“血浆样品预处理”方法操作。以待测组分与内标峰面积比(A)和待测组分的浓度(C)作加权(1/C)线性回归,得PB、LTG、OXC和MHD标准曲线回归方程分别为:A=0.01566C+1.377×10-2,A=0.05980C+6.243×10-3,A=0.05845C+7.290×10-3,A=0.02196C-3.770×10-3,相关系数(r)均大于0.999。PB、LTG、OXC和MHD的线性范围分别为5~100mg/L,1~50mg/L,0.5~50mg/L和2~100mg/L。PB、LTG、OXC和MHD的最低检测限(信噪比>3)分别为2.5,0.5,0.25和1mg/L。
准确度和精密度
分别精密吸取PB、LTG、OXC和MHD的甲醇标准工作液,用适量空白血浆稀释配制成含PB10,40,80mg/L,LTG2,20,40mg/L,OXC1,20,40mg/L,MHD4,40,80mg/L的系列质控血样。各取血浆100μL,按”血浆样品预处理”方法操作。根据线性回归方程计算其实测浓度,计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差(RSD)表示,(C实测/C理论)×100%即为回收率。
经实际患者血药浓度测定,结果证实,内源性物质不干扰拉莫三嗪,苯巴比妥,单羟奥卡西平,奥卡西平和氯唑沙宗的测定。且上述待测组分和内标物质峰形对称,分离良好。
表1是血浆中苯巴比妥、拉莫三嗪、奥卡西平和单羟奥卡西平浓度的日内、日间精密度和方法回收率。
表1
Claims (1)
1.一种测定抗癫痫药物血药浓度的方法,其特征是待测样品预处理后,经酸性流动相在色谱柱分离后,用紫外检测器检测,经酸性流动相在色谱柱分离后,用紫外检测器检测;所述的抗癫痫药物是苯巴比妥、拉莫三嗪、奥卡西平和/或单羟奥卡西平,其检测步骤包括:
1)样品预处理
定量分取血浆或血清样品,加入有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀,所述的蛋白沉淀剂选自甲醇或乙腈或甲醇和乙腈混合物;
2)样品分离与分析
采用通用型的液相色谱柱,其填料为ZORBAX Eclipse XDBC18,高效液相系统采用通用型的紫外检测器以及高压泵,流动相采用甲醇和酸性水溶液的混合物为流动相,等度洗脱;
其中,色谱条件为:色谱柱采用Agilent XDB C18 150mm×4.6mm,5μm柱温:40℃;流动相采用甲醇∶0.1%乙酸液=38∶62 v/v;流速:1.5mL/min;
3)紫外检测器检测,测峰面积,用标准曲线方程换算浓度
采用紫外检测器215nm测定苯巴比妥和单羟奥卡西平的峰面积,240nm测定拉莫三嗪和奥卡西平的的峰面积,用标准曲线方程换算成浓度。
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