CN104962520A - 一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：(1)无菌操作收集恶性胸腹水，分装于无菌离心管内，常温离心，得到细胞沉淀；(2)用无菌性PBS液体重悬细胞沉淀，得到肿瘤细胞混悬液，取肿瘤细胞混悬液沿离心管管壁加到离心管内的血清上，在离心管形成两层溶液，上层为肿瘤细胞混悬液层，下层为血清层；(3)将步骤(2)中的加入了肿瘤细胞混悬液的离心管静置5-8分钟，而后用巴氏吸管吸取管底部的血清且不破坏液体分层，取出的血清置于新的离心管中，加入无菌PBS液，常温离心，弃上清，获得纯化的肿瘤细胞。本发明提供的方法适合各种类型的恶性胸腹水中肿瘤细胞的分离和纯化，避免了现有分离纯化方法的局限性。

Description

一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种肿瘤细胞的分离方法，尤其涉及一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法。
背景技术
胸水是呼吸内科常见的临床病症,分为渗出性及漏出性两种，可由炎症性病变、肿瘤性病变、全身性疾病及某器官病变引起。其中恶性胸水主要有胸腔脏器的恶性肿瘤引起，尤其是在晚期肺癌中常见，发生率高达60%。且常呈进行性。发病原因主要是胸膜转移结节侵犯和阻塞毛细血管和淋巴管所致，故胸水中含有大量蛋白质和血液有形成分，血性胸水约占75%。
腹水是腹膜腔内过多的液体积聚，是临床常见的病理现象，由腹膜原发或转移性恶性肿瘤形成的腹水称为恶性腹水，其他原因形成的腹水称为良性腹水，其常见病因有肝硬化、肿瘤和结核性腹膜炎。也分为渗出性及漏出性两种，其中以血性腹水最为常见。
恶性胸腹水中多含有肿瘤细胞，对于临床上病因诊断，病情判断以及临床治疗策略的调整都有着十分重要的意义。同时从恶性胸腹水中分离纯化得到的肿瘤细胞，因其直接来源于病人病灶，是药物敏感性试验以及肿瘤研究中的重要的研究工具。目前，常用的从恶性胸腹水中分离纯化的方法有离心成渣法、密度梯度离心法和不连续密度离心法。不过，这些方法都存在不同的缺陷，如细胞收集量较少，分离与纯化步骤分离，纯化程度低，需要如肿瘤细胞分离液、淋巴细胞分离液等专门的分离纯化试剂等问题。而且上述方法操作时涉及多次较长时间高速离心，容易造成分离后细胞状态较差，细胞不贴壁，无法进行进一步研究。因此，研发一种新型的操作简单，分离高效，对细胞伤害小的分离纯化方法显得至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便的、快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，包括以下步骤：
(1) 无菌操作收集恶性胸腹水，分装于无菌离心管内，常温离心，得到细胞沉淀；
(2) 用无菌性PBS液体重悬细胞沉淀，得到肿瘤细胞混悬液，取肿瘤细胞混悬液沿离心管管壁加到离心管内的血清上，在离心管形成两层溶液，上层为肿瘤细胞混悬液层，下层为血清层；
(3) 将步骤(2)中的加入了肿瘤细胞混悬液的离心管静置5-8分钟，而后用巴氏吸管吸取管底部的血清且不破坏液体分层，取出的血清置于新的离心管中，加入无菌PBS液，常温离心，弃上清，获得纯化的肿瘤细胞。
所述步骤(1)的恶性胸腹水为血性胸腹水时，用红细胞裂解液收集并混匀所述细胞沉淀，常温离心，得到不含红细胞的细胞沉淀。所述红细胞裂解液包含139.6 mmol/L NH4Cl，16.96 mmol/L Tris，用1 mol/L HCl调 pH至7.2，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存。
所述步骤(1)中的离心条件为：转速1000-2000r/min，离心时间3-6分钟。
所述步骤(2)的血清相对于蒸馏水的比粘度为1.4-1.8。所述的血清可以是人源血清，也可以是动物源血清。作为本发明的一个实施例，所述血清为小牛血清。
所述步骤(2)中，肿瘤细胞混悬液的细胞浓度不超过106个/ml；所述肿瘤细胞混悬液与血清之间的体积比为1:1-1.5，且血清高度不低于4cm。
所述步骤(3)中吸取管底部的血清的操作至少进行两次，每次吸取后，静置3-5分钟后再进行下一次吸取，每次吸取5-6ml血清。
所述步骤(3) 中的离心条件为：转速1000-2000r/min，离心时间3-6分钟。
本发明所述的无菌性PBS液体由0.27g磷酸二氢钾(KH2PO4)，1.42g磷酸氢二钠(Na2HPO4)，8g氯化钠(NaCl)，0.2g氯化钾(KCl)，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2-7.4，最后定容到1L，灭菌后室温密封保存。
本发明方法与现有技术相比具有以下有益效果：
(1)本发明采用的血清自然沉淀的方法同时进行肿瘤细胞的分离与纯化，简化操作步骤。
(2)本发明方法中涉及到的试剂均为温和的缓冲液及血清，并且方法过程中不涉及长时间的高速离心，对细胞伤害小，得到的肿瘤细胞状态好。
(3)本发明提供的分离纯化方法稳定性好，重复性好，得到的细胞纯度高，易于培养。
(4)本发明提供的方法适合各种类型的恶性胸腹水中肿瘤细胞的分离和纯化，避免了现有分离纯化方法的局限性。
(5)本发明提供的方法涉及的试剂便宜，成本低，可转化成试剂盒，具有非常好的经济效益。
附图说明
图1是从离心管中吸取肿瘤细胞图示。
图2是普通倒置相差显微镜(100×)下采用本发明方法从非血性恶性胸水中分离纯化得到的肿瘤细胞，血细胞和杂细胞少，肿瘤细胞呈团状。
图3是普通倒置相差显微镜(100×)下采用本发明方法从非血性恶性胸水中分离纯化得到的肿瘤细胞，肿瘤细胞呈团状，仅见少量红细胞。
图4是普通倒置相差显微镜(100×)下采用肿瘤细胞分离液连续密度梯度离心法从非血性恶性胸水中分离纯化得到的肿瘤细胞，肿瘤细胞呈团状，可见成纤维细胞，红细胞较多。
图5是普通倒置相差显微镜(100×)下采用淋巴细胞分离液连续密度梯度离心法从非血性恶性胸水中分离纯化得到的肿瘤细胞，肿瘤细胞呈团状，有大量杂细胞，包括成纤维细胞、间皮细胞、有大量血细胞。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
恶性非血性胸水中肿瘤细胞的分离与纯化
实施例1
 1、主要实验材料
（1）胸水来源：肺腺癌患者的胸腔积液。
（2）PBS溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g， 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g， 氯化钠(NaCl)：8g， 氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2-7.4，最后定容到1L。实验前24小时配制并高温高压灭菌后室温密封保存。
（3）小牛血清：杭州四季青公司。
（4）50ml离心管：美国BD公司。
（5）无菌玻璃巴氏吸管：美国Fasher公司
（6）离心机：德国Eppendrof公司
2、操作步骤
（1）无菌抽取肺癌患者胸腔积液500ml，从中取200ml，分别装入4支50ml离心管内，1500r/min常温离心5分钟，得到细胞沉淀。
（2）用20mlPBS液体收集并混匀细胞沉淀，得到肿瘤细胞混悬液，取一只无菌50ml离心管加入25ml小牛血清，血清的比粘度（相对于蒸馏水）为1.4。用巴氏吸管将混匀的肿瘤细胞悬液沿管壁轻轻加到血清上，使其分为两层，肿瘤细胞悬液层在上。
（3）将加入肿瘤细胞悬液层的离心管静置6分钟，用一巴氏吸管离心管底部吸取5ml血清（如图1示），吸取过程要十分小心不能破坏液体分层，再静置3分钟后，再次从底部吸取5ml血清，将两次得到的血清混合，并加入30ml无菌PBS液，1500r/min（离心力300g左右）常温离心5分钟，便可得到分离纯化后的肿瘤细胞（见图2）。
实施例2
与实施例1不同的是：
2、操作步骤
（1）无菌抽取肺癌患者胸腔积液500ml，从中取200ml，分别装入4支50ml离心管内，1500r/min常温离心5分钟，得到细胞沉淀。
（2）用20mlPBS液体收集并混匀细胞沉淀，得到肿瘤细胞混悬液，取一只无菌50ml离心管加入30ml小牛血清，血清的比粘度（相对于蒸馏水）为1.8。用巴氏吸管将混匀的肿瘤细胞悬液沿管壁轻轻加到血清上，使其分为两层，肿瘤细胞悬液层在上，血清液层在下，高度不低于4cm。
（3）将加入肿瘤细胞悬液层的离心管静置5分钟，用一巴氏吸管离心管底部吸取5ml血清，吸取过程要十分小心不能破坏液体分层，再静置5分钟后，再次从底部吸取5ml血清，将两次得到的血清混合，并加入30ml无菌PBS液，1500r/min（离心力300g左右）常温离心5分钟，便可得到分离纯化后的肿瘤细胞。
实施例3
与实施例1不同的是：
2、操作步骤
（1）无菌抽取肺癌患者胸腔积液500ml，从中取200ml，分别装入4支50ml离心管内，1500r/min常温离心5分钟，得到细胞沉淀。
（2）用20mlPBS液体收集并混匀细胞沉淀，得到肿瘤细胞混悬液，取一只无菌50ml离心管加入20ml小牛血清，血清的比粘度（相对于蒸馏水）为1.6。用巴氏吸管将混匀的肿瘤细胞悬液沿管壁轻轻加到血清上，使其分为两层，肿瘤细胞悬液层在上，血清液层在下，高度不低于4cm。
（3）将加入肿瘤细胞悬液层的离心管静置6分钟，用一巴氏吸管离心管底部吸取5ml血清，吸取过程要十分小心不能破坏液体分层，再静置4分钟后，再次从底部吸取5ml血清，将两次得到的血清混合，并加入30ml无菌PBS液，1500r/min（离心力300g左右）常温离心5分钟，便可得到分离纯化后的肿瘤细胞。
对比例：常用肿瘤细胞连续密度梯度分离方法
具体步骤：
1、主要实验材料
（1）胸水来源：肺癌患者的胸腔积液。
（2）PBS溶液：磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g， 磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g， 氯化钠(NaCl)：8g， 氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.2-7.4，最后定容到1L。实验前24小时配制并高温高压灭菌后室温密封保存。
（3）小牛血清：杭州四季青公司。
（4）人淋巴细胞分离液：天津灏洋生物制品科技有限责任公司。
（5）人肿瘤细胞分离液：天津灏洋生物制品科技有限责任公司。
（6）50ml离心管：美国BD公司。
（7）无菌玻璃巴氏吸管：美国Fasher公司
（8）离心机：德国Eppendrof公司
（9）低温台式水平离心机：Eppendorf 5810R型
2、操作步骤
（1）无菌收集恶性胸腔积液600ml，1500r/min离心5min，沉淀细胞用无菌PBS缓冲液洗涤2次后弃上清，细胞沉淀悬于60ml的PBS缓冲液中，调至适宜的浓度，平均分成三份，每份20ml。
（2）分离及纯化
处理1：其中一份细胞悬液用放有1/2体积的淋巴细胞分离液置于50ml无菌离心管中，再小心加入上述细胞悬液，经1500r/min离心15min，此时离心管从上至下分为四层，第二层白色层即为肿瘤细胞积聚层，小心吸取此层细胞放入15ml离心管内，加适量PBS缓冲液冲洗两次，即可得到淋巴细胞分离液连续密度梯度离心法分离得到的肿瘤细胞。
处理2：其中一份细胞悬液小心置于装有相同体积的肿瘤细胞分离液的无菌离心管中，经1500r/min离心15min，此时离心管从上至下分为两层，小心吸取上层细胞悬液放入另一15ml离心管内，加适量PBS缓冲液冲洗两次，1000r/min离心3min，即可得到肿瘤细胞分离液连续密度梯度离心法分离得到的肿瘤细胞。
处理3：最后一份细胞悬液混匀后轻轻的从管壁加入到含相同体积小牛血清的50ml离心管中，静置6分钟，从管底部吸出6 ml溶液，置一50ml离心管中，再隔6分钟，从管底部吸出6 ml溶液，置于前管，加适量PBS缓冲液冲洗两次，1000r/min离心3min，即可得到血清自然沉淀法分离得到的肿瘤细胞。
（3）将3种不同方法纯化得到的肿瘤细胞用等体积的培养基混匀后，在倒置荧光显微镜观察，比较肿瘤细胞纯度。
试验结果：利用本发明提供的方法分离纯化得到的肿瘤细胞只有少量的红细胞（见图3）；肿瘤细胞分离液连续密度梯度离心法得到的肿瘤细胞有成纤维细胞，红细胞较多（见图4）；淋巴细胞分离液连续密度梯度离心法得到的肿瘤细胞有大量的杂细胞，有成纤维细胞、间皮细胞，有大量的红细胞（见图5）。
结论：本发明提供的方法纯化的肿瘤细胞纯度最高，优于肿瘤细胞分离液和淋巴细胞分离液。

Claims (10)

1.一种快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 无菌操作收集恶性胸腹水，分装于无菌离心管内，常温离心，得到细胞沉淀；
(2) 用无菌性PBS液体重悬细胞沉淀，得到肿瘤细胞混悬液，取肿瘤细胞混悬液沿离心管管壁加到离心管内的血清上，在离心管形成两层溶液，上层为肿瘤细胞混悬液层，下层为血清层；
(3) 将步骤(2)中的加入了肿瘤细胞混悬液的离心管静置5-8分钟，而后用巴氏吸管吸取管底部的血清且不破坏液体分层，取出的血清置于新的离心管中，加入无菌PBS液，常温离心，弃上清，获得纯化的肿瘤细胞。
2.根据权利要求1所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)的恶性胸腹水为血性胸腹水时，用红细胞裂解液收集并混匀所述细胞沉淀，常温离心，得到不含红细胞的细胞沉淀。
3.根据权利要求2所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液包含139.6 mmol/L NH4Cl，16.96 mmol/L Tris， pH 7.2。
4.根据权利要求1或2所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)的血清相对于蒸馏水的比粘度为1.4-1.8。
5.根据权利要求4所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述的血清为人源血清或动物源血清。
6.根据权利要求4所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述血清为小牛血清。
7.根据权利要求4所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，肿瘤细胞混悬液的细胞浓度不超过106个/ml；所述肿瘤细胞混悬液与血清之间的体积比为1:1-1.5，且血清高度不低于4cm。
8.根据权利要求4所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述步骤(3)中吸取管底部的血清的操作至少进行两次，每次吸取后，静置3-5分钟后再进行下一次吸取，每次吸取5-6ml血清。
9.根据权利要求4所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(3) 中的离心条件为：转速1000-2000r/min，离心时间3-6分钟。
10.根据权利要求4所述的快速高效的从恶性胸腹水中分离纯化肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述的无菌性PBS液体包含0.27g/L磷酸二氢钾，1.42g/L磷酸氢二钠，8g/L氯化钠，0.2g氯化钾，pH为7.2-7.4。
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