CN107988159A - 一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法。包括：胸腔积液样本置于样本收集液，离心弃上清；加入红细胞裂解液去除红细胞，加入PBS缓冲液洗涤细胞，离心弃上清；用KL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中于培养箱中培养。当细胞增殖至85%以上的丰度时，PBS缓冲液洗涤细胞，胰酶‑EDTA消化，终止液中和消化反应；离心收集细胞，用KL培养基重悬细胞，按比例将细胞接种于细胞瓶里传代培养。本发明的方法分离培养所得的胸腔积液原代肿瘤细胞可用于生理学、药学、以及新药研发等方面的相关研究，探索肺癌相关疾病的致病机理、对不同药物的药敏检测，抗癌药物的筛选、新药研发以及针对患者的个性化治疗方案的制定。

Description

一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法及该方法获得的原代肿瘤细胞的应用。
背景技术
1、恶性胸腔积液的成因
目前，恶性胸腔积液多为恶性肿瘤进展所致，是晚期恶性肿瘤的常见并症，肿瘤累及胸膜，使其表面通透性增加，或淋巴引流受阻，或伴有阻塞性肺炎累及胸膜，均可引起渗出性胸腔积液，可见于胸膜间皮瘤、肺癌、乳腺癌、淋巴瘤等。为此，正确诊断恶性肿瘤及其组织类型，及时进行合理有效的治疗，对于缓解病症、减轻痛苦、提高患者的生存质量、延长其生命具有十分重要的意义。
2、恶性胸腔积液的治疗
全身性化疗对于部分小细胞肺癌所致的胸腔积液有一定的疗效，如在抽吸胸液后，向胸腔内注入包括阿霉素、顺铂、氟尿嘧啶、丝裂霉素、硝卡芒芥、博来霉素等在内的抗肿瘤药物，是最常用的治疗方法，这样的做法有助于杀伤肿瘤细胞，减缓胸液的产生。近年来，向胸腔内注入生物免疫调节剂，是探索治疗恶性胸腔积液较为成功的方法，诸如短小棒状杆菌疫苗（CP）、IL-2、干扰素β、干扰素γ、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK细胞）、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）等，均可抑制恶性肿瘤细胞，增强淋巴细胞局部的浸润及活性。
但是，由于不同病人其自身免疫系统以及个体化差异的存在，对不同抗癌药物的敏感程度各不相同，从而展现出对抗癌药物不同的作用效果。虽然目前癌症所导致的恶性胸腔积液在现阶段存在一些相应的治疗办法，但是仍然有一个十分棘手的问题摆在我们面前，即缺乏一个合适的体外肿瘤原代细胞的模型来进行药敏实验并确定如何对患者选择合适的抗癌药物来缓解或控制其病情，以减少癌症病人所产生的胸水量或控制患者产生胸水的速率。因此，获取原代肿瘤细胞的分离培养是肿瘤化疗体外药敏及生物免疫治疗中首要步骤。
3、利用恶性胸腔积液培养原代肿瘤细胞
恶性胸腔积液中主要细胞成分为淋巴细胞、成纤维细胞及肿瘤细胞。恶性胸腔积液培养原代肿瘤细胞是指从临床供体取得肿瘤细胞胸水后在体外进行的首次培养。利用恶性胸腔积液培养的原代肿瘤细胞具有很多特点，首先恶性胸腔积液刚刚离体，生物特性未发生很多变化，最接近和反映体内生物特性，很适合作药物测试、细胞分化等实验研究。然而在以往的利用恶性胸腔积液培养原代肿瘤细胞的方法中，受限于肿瘤细胞来源于恶性胸腔积液，较原发灶中的肿瘤细胞更为脆弱，其原代细胞培养更容易失败。失败原因包括：恶性胸腔积液收集量不足，沉淀细胞数量少；未提前制备样本收集液冷藏恶性胸腔积液，细胞活力大大减弱；培养过程中没有及时清除成纤维细胞，是造成上皮来源的恶性胸腔积液肿瘤细胞培养失败最主要的原因。
因此，迫切需要一种有效的恶性胸腔积液培养原代肿瘤细胞的培养新方法来协助建立恶性胸腔积液来源的原代肿瘤细胞作为药物测试新模型。
发明内容
为了解决现有技术中利用恶性胸腔积液培养原代肿瘤细胞容易失败的问题，本发明提供一种基于样本收集液（样本收集液为含2%青/链霉素和100μg/mL制菌霉素的PBS缓冲液）、红细胞裂解液、PBS缓冲液分离得到胸腔积液原代肿瘤细胞，并利用KL培养基对原代肿瘤细胞进行原代培养和传代培养的方法。该方法在短期内扩增早代胸腔积液肿瘤细胞并让其稳定生长，成功建立了来源于癌症病人的胸腔积液原代肿瘤细胞药敏检测模型，可用于癌症病人个性化治疗的药物筛选以及抗癌新药的研发。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明的第一方面，提供一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：
（1）、胸腔积液原代肿瘤细胞分离、接种：
（a）取1支50mL离心管（已灭菌），加入8～10mL的样本收集液用来收集胸腔积液；
（b）收集病人的胸腔积液样本至上述离心管中，一般每管可收集30mL胸腔积液，建议每个病人收集2～3管，冷藏条件下运输至细胞培养室；
（c）1000～1500rmp离心，时间为4～5min，离心弃掉上清，若观察离心管内的细胞沉淀收集不好，可适当延长离心时间；
（d）加入细胞沉淀量6～10倍体积的红细胞裂解液去除红细胞，轻轻混匀，室温放置，中间可适当晃动，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
（e）如果发现红细胞仍然较多，可以重复上述步骤（d）一次；
（f）加入10～15mL的PBS缓冲液洗涤1～2次，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
（g）用1 mL KL培养基重悬沉淀，根据沉淀量接种细胞，然后接种1～3个T25的培养瓶，每瓶补充培养基到7mL，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
(2)、胸腔积液原代肿瘤细胞的换液：
（a）细胞培养24h后，在显微镜下观察，若漂浮细胞较多，吸掉培养基，用不含钙镁离子的PBS缓冲液轻轻的洗1～2次，更换新的KL培养基继续培养；实验操作时动作要轻柔；
（b）培养过程2～4天更换培养基，注意观察培养基颜色，若变黄则需要更换新的胸腔积液原代肿瘤细胞培养基继续培养；
所述样本收集液为含2%青/链霉素和100μg/mL制菌霉素的PBS缓冲液；所述培养基KL的成分包括：DMEM与Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲状腺氨酸（triiodothyronine），5-20μM Y-27632、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、5-20 ng/ml激活素A（Activin A）以及5-10ng Adenine，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
本发明第二方面提供上述胸腔积液原代肿瘤细胞的传代培养方法，包括如下步骤：
(1) 胸腔积液原代肿瘤细胞的传代
（a）待上述胸腔积液原代肿瘤细胞融合度达85%以上即可消化传代，弃掉旧的培养基；
（b）用PBS缓冲液润洗细胞去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，操作步骤一定要动作轻柔；
（c）加入1mL0.05%胰酶-EDTA，37℃孵育1～3min消化，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍（注意：细胞未见变圆也可拍下）；
（d）当90%细胞从培养瓶脱落后加入1-2mL终止液终止；
（e）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，室温1000rmp，离心4min弃上清；
（f）用KL培养基重悬细胞，以1/3～1/2的比例传代，培养基补至7mL;
(2)上述(1)中胸腔积液原代肿瘤细胞的冻存方法，包括如下步骤：
（a）待细胞融合度达85%以上，弃旧培养基；
（b）动作轻柔地用PBS缓冲液润洗细胞以去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次；
（c）加入0.6ml，0.05%胰酶-EDTA消化，轻柔晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍（注意：细胞未见变圆也可拍下）；37℃孵育1～3min；
（d）当90%细胞从培养瓶脱落后加入1-2mL终止液终止；
（e）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，1000rmp，4min离心弃上清；
（f）用冻存液重悬细胞沉淀，按照一定的比例将细胞悬液置于冻存管中；冻存液的配方比例优选为90%胎牛血清（FBS）+10%DMSO;
（g）将冻存管移至冻存盒内，置于-80℃冰箱，后移放至液氮永久保存。
上述胸腔积液原代肿瘤细胞可用于病理学、诊断方法学以及新药研发等方面的相关研究，探索肺癌相关疾病的致病机理、体外胸腔积液原代肿瘤细胞针对不同药物的药敏检测，抗癌药物的筛选、新药研发以及针对患者的个性化治疗方案的制定。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
（1）本发明提供的样本收集和分离方法，保证细胞活力的同时可获得原始数量较多的源于癌症病人本身的胸腔积液肿瘤细胞；
（2）本发明提供的传代培养方法，优点在于提供了一种优化培养基，可以在整个培养过程中优化上皮细胞的培养条件，让其在成分复杂恶性胸腔积液细胞中作为优势种群显著提高细胞数量和活性，使其集落形成数量增多，改善以往其他原代胸腔积液肿瘤细胞培养方法培养时肿瘤细胞生长缓慢，肿瘤细胞集落形成少的情况；
（3）本发明提供的传代培养方法，优点在于提供的优化培养基已减少甚至剔除利于成纤维细胞的配方及成分，使成纤维细胞的增殖受到抑制，因此可以排除其对上皮来源的恶性胸腔积液肿瘤细胞造成的细胞污染，解决胸腔积液原代肿瘤细胞培养失败最主要的难题；
（4）本发明提供的分离和传代培养方法，短期内扩增早代胸腔积液肿瘤细胞并让其稳定生长，成功建立了来源于癌症病人的胸腔积液原代肿瘤细胞药敏检测模型，可用于癌症病人个性化治疗的药物筛选以及抗癌新药的研发。
附图说明
图1是胸腔积液原代肿瘤细胞培养流程图；
图2是不同病人的胸腔积液原代肿瘤细胞图；
图3是不同病人的胸腔积液原代肿瘤细胞生长曲线图；
图4是来源于病人1的胸腔积液原代肿瘤细胞对不同抗癌药物的药敏检测图；
图5是来源于病人2的胸腔积液原代肿瘤细胞对不同抗癌药物的药敏检测图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】胸腔积液原代肿瘤细胞的分离培养
（1）实验前准备工作：在50mL无菌离心管中加入10mL样本收集液以用来收集胸腔积液；
（2）收集病人的胸腔积液样本至上述离心管中，每管可收集30mL胸腔积液，每个病人收集2管，冷藏条件下运输至细胞培养室；
（3）离心1000rmp，5min，弃掉上清；
（4）加入5mL的红细胞裂解液去除红细胞，轻轻混匀，室温放置5min，中间可适当晃动，离心1000rmp，5min弃上清；
（5）加入15mL的PBS缓冲液洗涤2次，离心1000rmp，4min弃上清；
（6）用1mL的KL培养基重悬细胞沉淀，接种细胞于T25的培养瓶中培养，将培养基补至7mL，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
按照上述方法（如图1）分离培养成功的胸腔积液原代肿瘤细胞，于显微镜下观察细胞的形态，细胞之间排列紧密、细胞间界限清晰、细胞边缘立体感强、呈多角型的上皮细胞。
【实施例2】胸腔积液原代肿瘤细胞的传代培养
（1）当在T25培养瓶中培养的胸腔积液原代肿瘤细胞增殖至85%以上的丰度时，即可消化传代，弃掉旧的培养基；
（2）用PBS缓冲液润洗细胞以去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，注意动作要轻柔；
（3）加入1ml，0.05%的胰酶-EDTA于37℃孵育2min，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍；
（4）当90%细胞从培养瓶脱落后加入2mL含10%胎牛血清的PBS终止液终止消化反应；
（5）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶1次，离心弃上清；
（6）用1mL的KL培养基重悬细胞，按照1:2的比例传代，补足培养基至6mL。
按照上述方法传代培养所得到的胸腔积液原代肿瘤细胞，可在体外持续稳定的生长并传代，细胞状态鲜活，细胞间界限清晰，细胞边缘立体感强（如图2）。
【实施例3】胸腔积液原代肿瘤细胞的生长曲线绘制
（1）当在T25培养瓶中培养的胸腔积液原代肿瘤细胞增殖至85%以上的丰度时，即可消化离心后种于96孔板；
（2）胸腔积液原代肿瘤细胞消化离心种板时，重复实例2（2）～（5）操作步骤；
（3）用KL培养基制备成单细胞悬液，台盼蓝与细胞悬液1:1混匀细胞计数仪检测细胞数量与活力，每孔200μL细胞悬液接种于96孔板，细胞数为6000个/孔，每日设置12个复孔，放入37℃CO2培养箱分别培养1～7天；
（4）每日移去板内溶液，每孔加入含有10μLCKK-8检测试剂的无血清DMEM培养基100μL；
（5）在37℃CO2细胞培养箱继续孵育1.5h，酶标仪在450nm处测定的吸光度；
（6）所有数据经统计软件GraphPad Prism7进行统计学分析和作图，输出并保存图形和数据，由实验结果可知，胸腔积液原代肿瘤细胞短期内增殖较快，适宜大量扩增（如图3）。
实施例4建立肺癌病人胸腔积液原代肿瘤细胞的的体外培养体系在药物或其组合敏感性筛选的的方法，包括如下具体步骤：
（1）当细胞培养瓶中培养的胸腔积液原代肿瘤细胞处于对数生长期时，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化3min，消化终止液终止消化，1000rpm低速离心4 min，用KL培养基制备成单细胞悬液，台盼蓝与细胞悬液1:1混匀细胞计数仪检测细胞数量与活力，每孔100μL细胞悬液接种于96孔板，细胞数为6000～8000个/孔，放入37℃CO2培养箱培养；
（2）次日吸去孔内溶液加药，病人1来源的胸腔积液原代肿瘤细胞设置靶向单药组埃克替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、奥希替尼和联用组顺铂+多西他赛、顺铂+吉西他滨、顺铂+培美曲塞和顺铂+紫杉醇处理细胞，病人2来源的胸腔积液原代肿瘤细胞设置靶向单药组色瑞替尼、克唑替尼和联用组顺铂+多西他赛、顺铂+培美曲塞、卡铂+多西他赛和卡铂+培美曲塞处理细胞，每孔加入200μL含不同浓度药物的培养基。设置合理药物浓度梯度，各个药物实验组的各个梯度均设置6个复孔，同时设置细胞对照组（同体积细胞培养基替代）及空白对照组（同体积PBS缓冲液替代）每组设置6个复孔。
（3）药物统一处理48h，移去板内溶液，每孔加入含有10μLCKK-8检测试剂的无血清DMEM培养基100μL，包含各药物实验组、对照组和空白组。
（4）在37℃CO2细胞培养箱继续孵育1.5h，酶标仪在450nm处测定的吸光度。
（5）所有数据经统计软件GraphPad Prism7进行统计学分析和作图，输出并保存图形和数据。
（6）结果分析：由实验结果可知，对病人1来源的胸腔积液原代肿瘤细胞药效学为：奥希替尼＞阿法替尼＞厄洛替尼＞吉非替尼＞埃克替尼，考虑《NCCN指南》以铂为主组合化疗的标准方案，尝试药物联用的药敏检测和毒性检测，对该个体而言顺铂+培美曲塞的组合联用效应较高且毒性较小，可考虑为临床治疗备选方案。对病人2来源的胸腔积液原代肿瘤细胞药效学为：色瑞替尼＞克唑替尼，对该个体而言卡铂+培美曲塞的组合联用效应较高且毒性较小，可考虑为临床治疗备选方案。（如图4、5）
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、胸腔积液原代肿瘤细胞分离、接种：
（a）取1支50mL离心管（已灭菌），加入8～10mL的样本收集液用来收集胸腔积液；
（b）收集病人的胸腔积液样本至上述离心管中，一般每管可收集30mL胸腔积液，建议每个病人收集2～3管，冷藏条件下运输至细胞培养室；
（c）1000～1500rmp离心，时间为4～5min，离心弃掉上清，若观察离心管内的细胞沉淀收集不好，可适当延长离心时间；
（d）加入细胞沉淀量6～10倍体积的红细胞裂解液去除红细胞，轻轻混匀，室温放置，中间可适当晃动，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
（e）如果发现红细胞仍然较多，可以重复上述步骤（d）一次；
（f）加入10～15mL的PBS缓冲液洗涤1～2次，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
（g）用1 mL KL培养基重悬沉淀，根据沉淀量接种细胞，然后接种1～3个T25的培养瓶，每瓶补充培养基到7mL，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；
(2)、胸腔积液原代肿瘤细胞的换液：
（a）细胞培养24h后，在显微镜下观察，若漂浮细胞较多，吸掉培养基，用不含钙镁离子的PBS缓冲液轻轻的洗1～2次，更换新的KL培养基继续培养；实验操作时动作要轻柔；
（b）培养过程2～4天更换培养基，注意观察培养基颜色，若变黄则需要更换新的胸腔积液原代肿瘤细胞培养基继续培养；
所述样本收集液为含2%青/链霉素和100μg/mL制菌霉素的PBS缓冲液；所述培养基KL的成分包括：DMEM与Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲状腺氨酸（triiodothyronine），5-20μM Y-27632、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、5-20 ng/ml激活素A（Activin A）以及5-10ng Adenine，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
2.根据权利要求1所述的方法培养的胸腔积液原代肿瘤细胞的传代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 胸腔积液原代肿瘤细胞的传代
（a）待权利要求1所述的方法培养的胸腔积液原代肿瘤细胞融合度达85%以上即可消化传代，弃掉旧的培养基；
（b）用PBS缓冲液润洗细胞去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，操作步骤一定要动作轻柔；
（c）加入1mL 0.05%胰酶-EDTA，37℃孵育1～3min消化，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍，细胞未见变圆也可拍下；
（d）当90%细胞从培养瓶脱落后加入1-2mL终止液终止；
（e）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，室温1000rmp，离心4min弃上清；
（f）用KL培养基重悬细胞，以1/3～1/2的比例传代，培养基补至7mL;
(2)上述(1)中胸腔积液原代肿瘤细胞的冻存方法，包括如下步骤：
（a）待细胞融合度达85%以上，弃旧培养基；
（b）动作轻柔地用PBS缓冲液润洗细胞以去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次；
（c）加入0.6ml，0.05%胰酶-EDTA消化，轻柔晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍（注意：细胞未见变圆也可拍下）；37℃孵育1～3min；
（d）当90%细胞从培养瓶脱落后加入1-2mL终止液终止；
（e）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，1000rmp，4min离心弃上清；
（f）用冻存液重悬细胞沉淀，按照一定的比例将细胞悬液置于冻存管中；冻存液的配方比例优选为90%胎牛血清（FBS）+10%DMSO；
（g）将冻存管移至冻存盒内，置于-80℃冰箱，后移放至液氮永久保存。
3.权利要求1或2的方法制备的原代肿瘤细胞在以下方面的应用：
（1）筛选抗肿瘤药物；
（2）药敏检测。
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