CN109355261A - 一种尿源性膀胱癌细胞培养基及尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法 - Google Patents

一种尿源性膀胱癌细胞培养基及尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种尿源性膀胱癌细胞培养基及尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法。本发明提供一种基于样本收集液、PBS缓冲液分离得到尿源性膀胱癌细胞，并采用BLM培养基与灭活的小鼠成纤维细胞共培养，提供一种操作简单、稳定有效的对尿源性膀胱癌细胞进行原代、传代培养的方法。该方法在短期内扩增尿源性膀胱癌细胞并让其稳定生长，该细胞可以准确反映患者的生理状况，可以成功建立来源于癌症病人的尿源性膀胱癌细胞的膀胱癌早期筛查、膀胱癌复发监测、膀胱癌疗效监测和药敏试验指导用药的新模型，可用于癌症病人尿液细胞动态监测、药敏试验指导用药以及抗癌新药的研发。

Description

一种尿源性膀胱癌细胞培养基及尿源性膀胱癌细胞的体外培 养方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，涉及一种尿源性膀胱癌细胞培养基及尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法。
背景技术
流行病学调查研究发现，膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，全世界发病率居恶性肿瘤第9位，男性发病率为女性的3～4倍，其发病率随着年龄增加呈上升趋势。其中90％膀胱癌属于膀胱尿路上皮癌，肿瘤切除后5年复发率高达30～80％。因此，早期筛查和复发检测肿瘤对于膀胱癌的治疗和降低术后复发率十分重要。
膀胱镜检查和活检是诊断膀胱癌最可靠的方法，患者均经膀胱镜检查常规观察肿瘤部位、形态，并做肿瘤活检，其病理结果是膀胱癌诊断的金标准。膀胱镜检查过程中，任何可疑的肿块以及病灶均取病理活检，检查结果按照TNM系统进行分期：原位癌(CIS)、Ta期(非浸润性乳头状癌)、T1期(肿瘤侵及上皮下结缔组织)、T2期(肿瘤侵犯肌层)。在膀胱镜检查中视野内为正常组织或者组织病理学检查结果为非恶性组织的定义为阴性。但膀胱镜检查具有侵入性，操作不便，患者痛苦程度较高，还有尿道感染、出血等风险。
尿脱落细胞学检查则是针对尿液中的脱落上皮细胞的形态学检查，原理在于对尿液行传统尿细胞学HE染色后，普通光镜下观察脱落细胞。病理学采用4级分级法分析细胞学检查结果，Ⅰ级正常细胞，Ⅱ级有非典型细胞，判断标准为阴性；Ⅲ级有可疑肿瘤细胞，Ⅳ级有肿瘤细胞，Ⅴ级有形态典型的肿瘤细胞，判断标准为阳性。此方法检测膀胱癌虽为无创，但易受到结石、炎症等因素的影响而出现假阳性结果，且受检测员的主观影响大，对于组织恶性分化程度较高、体积较小的肿瘤患者，尿液中的脱落细胞往往较少，因此其诊断膀胱癌敏感度受到限制(灵敏度为10％～40％)。
这两种检查方法在临床应用上都受到一定限制，因此，寻找敏感性高、特异性高、无创、无痛苦、相对经济、简单可行的膀胱癌早期筛查方法和随访的依据已成为研究的热点和临床应用的需要。目前，临床常应用新技术核基质蛋白22(NMP22)定量分析法对膀胱癌的复发进行监测，NMP22试验可以定量分析核基质蛋白的含量，具有较高的敏感性(灵敏度为70％～80％)和特异性。但NMP22检测方法也存在一定缺陷，如今确切的定量分界点仍存在争议。全细胞荧光原位杂交(FISH)检测膀胱上皮癌(BUC)的方法学建立是对尿脱落细胞学检查的发展和补充。与细胞学检测相比，从BUC的病理类型(表浅性和侵袭性)、分化程度(低度恶性和高度恶性)、是否有BUC史等方面分析，虽然FISH法敏感性更高，但目前临床应用尿脱落细胞进行FISH检测也有局限性，包括制作细胞悬液过程中步骤繁琐、4℃冰箱不能长时间保存、传统细胞滴片制片常容易聚积成团等。
大部分膀胱癌是来自泌尿系统上皮的恶性肿瘤，复发率非常高，因此临床建议对膀胱癌患者进行长时间的随访以监测肿瘤的复发及病情的进展，通常例行膀胱镜检查以及尿液细胞学检查。但由于膀胱镜在检查中易对人体造成侵袭性损伤，且检查费用相对较高，因此发展和优化尿液细胞学检查，更有益于对患者进行定期随访以监测肿瘤的复发情况。尿液与人体代谢密切相关，尿液排出前必会经过膀胱，特别是膀胱癌患者的尿液中还会含有数量较多的膀胱癌上皮组织的脱落肿瘤细胞。此外，尿源性细胞可从尿液中直接收集培养获得，操作方式简单且无任何创伤性，就患者而言会有更好的临床依从性。
目前，术后的膀胱灌注化疗成为预防膀胱癌复发的关键治疗措施。但是在膀胱灌注化疗药物的选择上，临床上具有盲目性和经验用药的随众性。膀胱癌患者的复发除存在肿瘤复发的高危因素外，还与治疗过程中出现的多药耐药性有关。膀胱癌的原发性耐药和获得性耐药是造成复发率升高的重要原因。选用敏感性化疗药物进行个体化治疗是提高疗效的关键。由于不同患者其自身的免疫系统以及个体化差异的存在，对不同化疗药物的敏感性各不相同，因此个体化的灌注化疗越来越得到重视。国内外文献报道的膀胱灌注化疗药物的个体化选择方法有两种：基因选择法和肿瘤药敏法。其中，肿瘤药敏法作为一种较为经济、有效、方便的选择方法，受到临床医生的关注。然而新鲜的膀胱尿路上皮癌组织需要经膀胱镜检查后通过组织活检取材，由于供体不适影响患者依从性，因此收集不同个体的尿液来源细胞构建不同尿源性膀胱癌细胞应用于个体化医疗具有重大意义。
从个体尿液中收集培养得到尿源性膀胱癌细胞受到许多因素的影响，不同于其他常规的原代细胞，尿源性细胞会处于较长的潜伏期而较难进入对数生长期，细胞容易出现凋亡及死亡的现象。目前临床上所用的尿源性细胞分离培养方法大多成本高且操作繁琐，如收集的尿液细胞必须接种到包被有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿上以增强细胞贴壁能力，且需要较长时间(7～10天)才逐渐有贴壁的细胞克隆出现。待原代细胞增殖密集(10～15天)经胰酶消化传代，又需要重新接种到包被基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿上扩增，表明细胞在体外的增殖和传代能力受到限制，影响大批量开展实验研究。总所周知，尿源性细胞因为本身作为一种原代细胞，常规操作时其在体外培养、传代的能力非常有限，一般在经历5～6次传代后细胞便逐渐退化走向衰老或凋亡且不可继续传代使用。为获得无限增殖的能力，传统方法是通过导入外源基因或病毒转染构建为永生化细胞株，然而这一操作会改变尿源性细胞的原有遗传背景和表型，这必然影响其在尿液细胞学膀胱癌早期筛查、药敏试验指导用药等方面的研究。此外，尿源性细胞来源虽然多限于泌尿系统的器官和组织，但病理状态下除脱落的膀胱癌上皮细胞外，还会包含红细胞、白细胞和肾上皮细胞等多种细胞，因此传统方法中所用的培养方法或培养基会给所培养的尿源性膀胱癌细胞带来细胞交叉污染，也会引起后续的生物学特性相关研究的争议。目前监测早期膀胱癌等恶性肿瘤的检测化验大多还依赖于创伤性地组织或细胞活检，随着肿瘤这类恶性疾病的广泛发生和人们健康危机意识的明显提高，早期筛查、提前预症、及早治疗、动态监测已成为保护生命健康的主要趋势。因此如何充分利用尿液培养尿源性膀胱癌细胞，使其在膀胱癌早期筛查、膀胱癌复发监测、膀胱癌疗效监测等方面的研究中物尽其用，正在逐渐为研究者关注。
综上所述，迫切需要一种操作简单、稳定有效的尿源性膀胱癌细胞的体外培养新方法来协助建立原代、传代尿源性膀胱癌细胞，该类细胞可以准确反映患者的生理状况并作为膀胱癌早期筛查、膀胱癌复发监测、膀胱癌疗效监测和药敏试验指导用药的新模型。
发明内容
为了解决现有技术中培养尿源性膀胱癌细胞操作繁琐、容易失败或细胞污染、不能持续传代培养的问题，本发明提供一种尿源性膀胱癌细胞培养基BLM及基于样本收集液(样本收集液为含2％青/链霉素、100μg/mL制菌霉素的PBS缓冲液)、PBS缓冲液分离得到尿源性膀胱癌细胞，并利用BLM培养基提供一种操作简单、稳定有效的对尿源性膀胱癌细胞进行原代、传代培养的方法。该方法在短期内扩增尿源性膀胱癌细胞并让其稳定生长，该细胞可以准确反映患者的生理状况，可以成功建立来源于癌症病人的尿源性膀胱癌细胞的膀胱癌早期筛查、膀胱癌复发监测、膀胱癌疗效监测和药敏试验指导用药的新模型，可用于癌症病人尿液细胞动态监测、药敏试验指导用药以及抗癌新药的研发。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明的第一方面，提供一种尿源性膀胱癌细胞培养基BLM，所述BLM培养基的成分包括：DMEM与无血清培养基SFM按体积比1:3混合，同时添加5％(v/v)的FBS(胎牛血清)，以及5μg/mL胰岛素(insulin)，25ng/ml氢化可的松(hydro-cortisone)，0.1nM霍乱毒素(cholera toxin)，0.125ng/ml表皮生长因子(epithelial growth factor〈EGF〉)，10mg/ml庆大霉素(gentamicin)，250ng/ml两性霉素B(amphotericin B)，1μM A83-01选择性抑制剂，5μM Y-27632 ROCK抑制剂，3μM异丙肾上腺素(isoproterenol)，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
本发明的第二方面，提供一种尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法，包括如下步骤：
1)尿源性膀胱癌细胞的原代培养：
(1)尿液取样：
(a)取样对象：男性膀胱癌患者；
(b)取样要求：尿液样本应在膀胱癌患者手术前取样，尿液采集前，应避免跑步、爬楼等剧烈运动，应避免精液、前列腺液、粪便等各种物质的污染；
(c)取已灭菌离心管，加入样本收集液用来收集尿液；所述样本收集液为含2％青/链霉素和100μg/mL制菌霉素的PBS缓冲液；
(d)使用苯扎溴铵酊清洁尿道区；
(e)取中段尿液；
(f)标好详细的患者信息，冷藏条件下运输至细胞培养室，时间控制在2～6h；
(2)尿源性膀胱癌细胞的体外原代和传代培养：
将原代尿源性膀胱癌细胞与放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞共培养，所述共培养利用上述BLM培养基进行，所述小鼠成纤维细胞为小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201714。
优选地，加入的小鼠成纤维细胞的终浓度约1～2×106个/mL。
优选地，培养过程2～4天更换培养基，注意观察培养基颜色，若变黄则需要更换新的BLM培养基继续培养；
优选地，上述尿源性膀胱癌细胞的原代培养具体步骤为：
(a)样本1000～1500rmp离心，时间为8～10min，离心弃掉上清，若观察离心管内的细胞沉淀收集不好，可适当延长离心时间；
(b)加入10～15mL的PBS缓冲液洗涤1～2次，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
(c)用1mL BLM培养基重悬沉淀，根据沉淀量接种细胞，然后接种1～2个T25的培养瓶，加入放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞约1～2×106个/mL共培养，每瓶补充培养基到7mL，放入37℃、5％CO2培养箱中培养24～48h后显微镜下观察细胞生长状况(※为了让细胞更好的贴壁，24h内不宜挪动培养瓶)；
优选地，上述尿源性膀胱癌细胞的传代培养具体步骤为：
(a)待原代培养的尿源性膀胱癌细胞融合度达85％以上即可消化传代，弃掉旧的培养基；
(b)用PBS缓冲液润洗细胞去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，操作步骤一定要动作轻柔；
(c)加入1mL浓度为0.02％的EDTA后轻轻晃匀使之与培养瓶上的细胞充分接触，20～30s后拍打培养瓶外壁，使小鼠成纤维细胞从培养瓶壁上脱落，当在显微镜下观察到小鼠成纤维细胞全部脱离瓶壁后，迅速移除EDTA，用PBS洗涤膀胱癌细胞3次；
(d)加入1mL 0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育3～5min消化，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍(注意：细胞未见变圆也可拍下)；
(e)当90％细胞从培养瓶脱落后加入1～2mL终止液终止；
(f)将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，室温1000rmp，离心4min弃上清；
(g)用BLM培养基重悬细胞沉淀，以1/3～1/2的比例传代，接种于培养瓶培养，培养基补至7mL，补加放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞的用量为1.2～1.6×106个/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
本发明第三方面，提供一种尿源性膀胱癌细胞培养试剂盒，包含小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714，和上述BLM培养基。
本发明第四方面，提供上述BLM培养基或上述试剂盒在尿源性膀胱癌细胞的体外培养中的应用。
上述尿源性膀胱癌细胞可用于膀胱癌早期筛查、膀胱癌复发监测、膀胱癌疗效监测和药敏试验指导用药等方面的相关研究，探索膀胱癌相关疾病的致病机理、体外尿源性膀胱癌细胞针对不同药物的药敏检测，抗癌药物的筛选、新药研发以及针对患者的个性化治疗方案的制定。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：
(1)本发明提供的样本收集和培养方法，保证细胞活力的同时可获得原始数量较多的源于癌症病人本身的尿源性膀胱癌细胞，本发明所述培养方法成功率(样本检出率)更高，特别是高级别膀胱癌患者成功率(样本检出率)高达95％以上；
(2)本发明提供的尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法，优点在于提供了一种优化培养基BLM，可以在整个培养过程中优化上皮细胞的培养条件，让尿源性膀胱癌细胞在成分复杂的尿源性细胞中作为优势种群显著提高细胞数量和活性，使其集落形成数量增多，改善以往其他原代尿源性膀胱癌细胞培养方法培养时肿瘤细胞生长缓慢，肿瘤细胞集落形成少的情况；优化的培养基以减少甚至剔除利于非上皮细胞的配方及成分，使非上皮细胞的增殖受到抑制，因此可以排除其对上皮来源的尿源性膀胱癌细胞造成的细胞污染，解决尿源性膀胱癌细胞培养失败最主要的难题；
(3)本发明提供的原代和传代培养方法，短期内扩增早代尿源性膀胱癌细胞并让其稳定生长，该细胞可以准确反映患者的生理状况，成功建立了来源于癌症病人的尿源性膀胱癌细胞的尿液细胞动态监测模型，可应用于癌症病人尿脱落细胞学膀胱癌早期筛查、膀胱癌复发监测、膀胱癌疗效监测等领域；
(4)本发明提供的原代和传代培养方法，短期内扩增早代尿源性膀胱癌细胞并让其稳定生长，该细胞可以准确反映患者的生理状况，成功建立了来源于癌症病人的尿源性膀胱癌细胞的药敏试验指导用药模型，可用于癌症病人个性化治疗的药物筛选以及抗癌新药的研发。
附图说明
图1是尿源性膀胱癌细胞培养及应用的技术路线图；
图2是原代尿源性膀胱癌细胞共培养第3天形态图；
图3是传代尿源性膀胱癌细胞共培养第45天形态图；
图4是不同临床来源的尿源性细胞培养(检出)统计图；
图5是不同病人的尿源性膀胱癌细胞对不同抗癌药物的药敏检测图；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
表1 下述实施例中BLM培养基各成分的情况：
【实施例1】尿液取样：
(1)取样对象：男性膀胱癌患者；
(2)取样要求：尿液采集前，应避免跑步、爬楼等剧烈运动，应避免精液、前列腺液、粪便等各种物质的污染(尿液样本应在膀胱癌患者手术前取样)；
(3)实验前准备工作：在50mL无菌离心管中加入20mL样本收集液以用来收集尿液；
(4)使用苯扎溴铵酊清洁尿道区，弃掉第一段尿液，取中断尿液，收集至上述离心管中，每管可收集20mL尿液，每个病人收集3管，冷藏条件下运输至细胞培养室。
按照上述方法(如图1)采集尿液样本用于尿源性膀胱癌细胞原代、传代培养。
【实施例2】尿源性膀胱癌细胞原代培养、换液：
(1)样本1500rmp离心，时间为8min，离心弃掉上清；
(2)加入10mL的PBS缓冲液洗涤2次，1000rmp离心，时间为5min，弃上清；
(3)用1mL BLM培养基重悬沉淀，然后接种于T25的培养瓶，每瓶补充培养基到7mL，加入放射线辐照或药物丝裂酶素C处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的的小鼠成纤维细胞约2×106个/mL共培养，放入37℃、5％CO2培养箱中培养36h后显微镜下观察细胞生长状况，所述小鼠成纤维细胞是申请号：201810335862.8中国专利申请中的小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714。对小鼠成纤维细胞MFC/HL-041的放射线辐照或药物丝裂酶素C处理方法按照申请号：201810335862.8中国专利申请中的【实施例3】和【实施例4】的步骤进行。
(4)细胞培养36h后，在显微镜下观察，若漂浮细胞较多，吸掉培养基，用不含钙镁离子的PBS缓冲液轻轻的洗2次，更换新的BLM培养基继续培养；
(5)培养过程中每2天更换一次培养基，注意观察培养基颜色，若变黄则需要更换新的BLM培养基继续培养。
按照上述方法培养成功的原代尿源性膀胱癌细胞，第3天于显微镜下观察细胞的形态，细胞散在分布，细胞间界限清晰、细胞边缘立体感强，呈短梭形或多角形上皮细胞(如图2)。
【实施例3】尿源性膀胱癌细胞的传代培养：
(1)待上述尿源性膀胱癌细胞融合度达85％以上即可消化传代，弃掉旧的培养基；
(2)用PBS缓冲液润洗细胞去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，操作步骤一定要动作轻柔；
(3)加入1mL浓度为0.02％的EDTA后轻轻晃匀使之与培养瓶上的细胞充分接触，20～30s后拍打培养瓶外壁，使小鼠成纤维细胞从培养瓶壁上脱落，当在显微镜下观察到小鼠成纤维细胞全部脱离瓶壁后，迅速移除EDTA，用PBS洗涤膀胱癌细胞3次；
(4)加入1mL 0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育4min消化，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍；
(5)当90％细胞从培养瓶脱落后加入2mL终止液终止；
(6)将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，室温1000rmp，离心4min弃上清；
(7)用1mL的BLM培养基重悬细胞沉淀，以1/2的比例传代，接种于培养瓶培养，培养基补至7mL，补加放射线辐照或药物丝裂酶素C处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的的小鼠成纤维细胞的用量约为1.5×106个/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养；
(8)用90％胎牛血清(FBS)+10％DMSO比例的冻存液重悬剩余的1/2细胞沉淀，按照一定的比例将细胞悬液置于冻存管中；
(9)将冻存管移至冻存盒内，置于-80℃冰箱，后移放至液氮永久保存。
按照上述方法连续传代培养的尿源性膀胱癌细胞，第45天于显微镜下观察细胞的形态，细胞数量多，生长好，细胞排列紧密且成簇排列，细胞间界限清晰、细胞边缘立体感强、呈“铺路石样”的上皮细胞(如图3)。分别收集健康人(28例)、高级别膀胱癌患者(33例)、低级别膀胱癌患者(8例)、原位膀胱癌患者(6例)、手术+药物治疗患者(22例)、复发患者(12例)等不同临床来源的尿液样本，进行尿源性膀胱癌细胞的培养，细胞培养(样本检出)数据经统计软件GraphPad Prism7进行统计分析和作图。统计结果显示健康人样本检出率为0％(0/28)，高级别膀胱癌患者样本检出率为96.96％(32/33)，低级别膀胱癌患者样本检出率为75％(6/8)，原位膀胱癌患者样本检出率为83.33％(5/6)，手术+药物治疗后的患者样本检出率为0％(0/22)，复发患者的样本检出率为100％(12/12)，样本检出率具有非常高的临床相关性(如图4)。综上所述，本发明的培养方法和优化培养基可广泛应用于尿源性膀胱癌早期筛查、膀胱癌复发监测、膀胱癌疗效监测。
【实施例4】建立病人尿源性膀胱癌细胞的的体外培养体系在药物或其组合敏感性筛选的的方法，包括如下具体步骤：
(1)当细胞培养瓶中培养的尿源性膀胱癌细胞处于对数生长期时，用0.05％胰蛋白酶/EDTA消化3min，消化终止液终止消化，1000rpm低速离心4min，用BLM培养基制备成单细胞悬液，台盼蓝与细胞悬液1:1混匀细胞计数仪检测细胞数量与活力，每孔100μL细胞悬液接种于96孔板，细胞数为3000个/孔，放入37℃CO2培养箱培养；
(2)次日吸去孔内溶液加药，病人1、2来源的尿源性膀胱癌细胞设置化疗单药组丝裂霉素、羟基喜树碱、吡柔比星、阿霉素、奈达铂、卡铂、顺铂、吉西他滨和靶向组舒尼替尼处理细胞，每孔加入100μL含不同浓度药物的培养基。设置合理药物浓度梯度，各个药物实验组的各个梯度均设置6个复孔，同时设置细胞对照组(同体积细胞培养基替代)及空白对照组(同体积PBS缓冲液替代)，每组设置6个复孔。
(3)药物统一处理72h，移去板内溶液，每孔加入含有10μL Alamar Blue检测试剂的无血清DMEM培养基100μL，包含各药物实验组、对照组和空白组。
(4)在37℃CO2细胞培养箱继续孵育3.5h，多功能酶标仪在560nm处测定的吸光度。
(5)所有数据经热图软件pheatmap进行统计学分析和作图，输出并保存图形和数据。
(6)结果分析：由实验结果可知，对病人1来源的尿源性膀胱癌细胞药效学表现为敏感的药物为舒尼替尼，对该个体而言，舒尼替尼的药物作用效应较高且毒性较小，可考虑为临床治疗备选方案。对病人2来源的尿源性膀胱癌细胞药效学表现为敏感的药物为顺铂，对该个体而言，顺铂的药物作用效应较高且毒性较小，可考虑为临床治疗备选方案。病人1、2因为个体化差异的存在，对不同化疗药物的敏感性各不相同，表明构建不同尿源性膀胱癌细胞应用于个体化医疗具有重大意义(如图5)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种尿源性膀胱癌细胞培养基BLM，其特征在于，所述BLM培养基的成分包括：DMEM与无血清培养基SFM按体积比1:3混合，同时添加5％(v/v)的胎牛血清，以及5μg/mL胰岛素，25ng/ml氢化可的松，0.1nM霍乱毒素，0.125ng/ml表皮生长因子，10mg/ml庆大霉素，250ng/ml两性霉素B，1μM A83-01选择性抑制剂，5μM Y-27632，3μM异丙肾上腺素，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
2.一种尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)尿液取样：
(a)取样对象：男性膀胱癌患者；
(b)取样要求：尿液样本应在膀胱癌患者手术前取样，尿液采集前，应避免跑步、爬楼等剧烈运动，应避免精液、前列腺液、粪便等各种物质的污染；
(c)取已灭菌离心管，加入样本收集液用来收集尿液；所述样本收集液为含2％青/链霉素和100μg/mL制菌霉素的PBS缓冲液；
(d)使用苯扎溴铵酊清洁尿道区；
(e)取中段尿液；
(f)标好详细的患者信息，冷藏条件下运输至细胞培养室，时间控制在2～6h；
(2)尿源性膀胱癌细胞的体外原代和传代培养：
将原代尿源性膀胱癌细胞与放射线辐照或是药物处理灭活后的小鼠成纤维细胞共培养，所述共培养利用权利要求1所述的BLM培养基进行，所述小鼠成纤维细胞为小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714。
3.根据权利要求2所述的尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法，其特征在于，加入的灭活后的小鼠成纤维细胞的终浓度约1～2×106个/mL。
4.根据权利要求2所述的尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法，其特征在于，培养过程2～4天更换培养基，注意观察培养基颜色，若变黄则需要更换新的BLM培养基继续培养。
5.根据权利要求2所述的尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法，其特征在于，所述尿源性膀胱癌细胞的原代培养具体步骤为：
(a)步骤(1)获得的尿液样本1000～1500rmp离心，时间为8～10min，离心弃掉上清，若观察离心管内的细胞沉淀收集不好，可适当延长离心时间；
(b)加入10～15mL的PBS缓冲液洗涤1～2次，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
(c)用1mL BLM培养基重悬沉淀，根据沉淀量接种细胞，然后接种1～2个T25的培养瓶，加入放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞约1～2×106个/mL共培养，每瓶补充培养基到7mL，放入37℃、5％CO2培养箱中培养24～48h后显微镜下观察细胞生长状况，为了让细胞更好的贴壁，24h内不宜挪动培养瓶。
6.根据权利要求2所述的尿源性膀胱癌细胞的体外培养方法，其特征在于，所述尿源性膀胱癌细胞的传代培养具体步骤为：
(a)待原代培养的尿源性膀胱癌细胞融合度达85％以上即可消化传代，弃掉旧的培养基；
(b)用PBS缓冲液润洗细胞去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，操作步骤一定要动作轻柔；
(c)加入1mL浓度为0.02％的EDTA后轻轻晃匀使之与培养瓶上的细胞充分接触，20～30s后拍打培养瓶外壁，使小鼠成纤维细胞从培养瓶壁上脱落，当在显微镜下观察到小鼠成纤维细胞全部脱离瓶壁后，迅速移除EDTA，用PBS洗涤膀胱癌细胞3次；
(d)加入1mL 0.05％胰酶-EDTA，37℃孵育3～5min消化，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍，细胞未见变圆也可拍下；
(e)当90％细胞从培养瓶脱落后加入1～2mL终止液终止；
(f)将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，室温1000rmp，离心4min弃上清；
(g)用BLM培养基重悬细胞沉淀，以1/3～1/2的比例传代，接种于培养瓶培养，培养基补至7mL，补加放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞的用量为1.2～1.6×106个/mL，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
7.一种尿源性膀胱癌细胞培养试剂盒，其特征在于，包含小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714，和权利要求1所述BLM培养基。
8.权利要求1所述BLM培养基或权利要求7所述试剂盒在尿源性膀胱癌细胞的体外培养中的应用。
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