CN102426238B - 一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂 - Google Patents

一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂 Download PDF

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本发明公开了一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂，其特征在于，制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂是用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗GPV单克隆抗体，然后用GPV单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素(FITC)制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120；本发明还公开了检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂应用于番鸭小鹅瘟病的临床快速诊断，以及应用于鹅细小病毒抗原在组织细胞中的定位和鉴定。

Description

一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂
技术领域
本发明涉及一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂。
背景技术
番鸭小鹅瘟病是由鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起一月龄以内雏番鸭以腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征的一种病毒性传染病，该病1997年以来在福建省莆田、福清等地的番鸭饲养区暴发流行，目前全国各番鸭饲养区均有发生，发病率50％-70％、病死率40％-65％，给养鸭业造成一定的经济损失。临床上该病不仅常与番鸭细小病毒病(三周病)混合感染，且常被基层兽医误诊为番鸭细小病毒病。由于抗小鹅瘟高免血清对该病具有较好的治疗效果，因此快速诊断是有效控制该病减少损失的前提。虽然已有报道以小鹅瘟单抗建立的间接免疫荧光方法，但我国至今还未见番鸭小鹅瘟病以单抗介导的直接免疫荧光诊断试剂，且至今国内尚缺乏商品化的番鸭小鹅瘟病快速诊断试剂，给临床诊断带来很大困难。因此，快速确诊该病的试剂不仅具有较好的应用价值和产业化前景，而且对有效控制该病是必不可少的。
发明内容
本发明的目的就是提供一种检测番鸭小鹅瘟病的直接免疫荧光试剂，它是通过如下技术方案来实现的：制备检测检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂是取一种来源于人工筛选的抗番鸭源鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)杂交瘤细胞株D11株(即：抗GPV杂交瘤细胞株D11株)，应用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(即：抗GPV单克隆抗体)，然后用抗GPV单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素(FITC)制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光(诊断)试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC(即：中国典型培养物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120。
本发明的目的还提供番鸭小鹅病免疫荧光试剂的应用。
与现有同类技术比较，具有如下优点：应用本发明的试剂建立的直接免疫荧光试验可用于临床快速诊断番鸭小鹅瘟病，也可用于鹅细小病毒(GPV)抗原在组织中的定位和GPV鉴定；直接免疫荧光检测时间短(40分钟内出结果)，特异性强(仅与GPV反应)，重复性好，准确性高(与间接免疫荧光方法的符合率为90％以上)，可用于番鸭小鹅瘟病毒病的快速诊断。
2011年委托福建省科技检索部门对本发明检索，其科技查新结论为：“委托单位福建省农业科学院畜牧兽医研究所的直接免疫荧光检测雏番鸭小鹅瘟病国内未见相关文献报道。”因此，本发明的检测番鸭小鹅瘟病的免疫荧光试剂具有创新性和实用性。
附图说明
图1为在DFA中呈荧光阳性的番鸭脾脏；
图2为在DFA中呈荧光阴性的番鸭脾脏。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进一步说明(但不是对本发明的限制)。并通过定性或定量的实验数据证明本发明的技术方案可以实现所述的用途和/或达到预期效果。
制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂是取一种来源于人工筛选的抗番鸭源鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)杂交瘤细胞株D11株(即：抗GPV杂交瘤细胞株D11株)，应用抗GPV杂交瘤细胞株D11株制备抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(即：抗GPV单克隆抗体)，然后用抗GPV单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素(FITC)制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光(诊断)试剂；所述的抗GPV杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC(即：中国典型培养物保藏中心)，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120。
本发明的检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光(诊断)试剂，特征在于，其制备方法是将蛋白浓度为10mg/mL抗GPV单克隆抗体以透析法对0.1mg/mL异硫氰酸荧光素粉(FITC)4℃标记24h，经sephandx G-50层析柱纯化并适当浓缩，即为番鸭小鹅瘟病免疫荧光诊断试剂。
其中：
1.抗番鸭源鹅细小病毒单克隆抗体(抗GPV单克隆抗体)的制备：即：从液氮中取出抗GPV杂交瘤细胞株D11株，放入预先准备的37℃温水中，使其尽快融化后，1000r/min离心2min，弃冻存液，以细胞营养液(HT-D7777-10％FCS)重悬细胞后，将细胞移至预先加好细胞营养液的培养瓶中，37℃ CO26.0温箱中培养，经扩大培养到足够数量时，收集细胞离心，调细胞浓度达5×106个细胞/ml。腹腔接种12周龄BALB/c小鼠，5×105个细胞/0.1ml/只，约10天左右小鼠腹部明显臌起，以手触摸时皮肤有紧张感，即可用16～18号消毒针头采集腹水。将腹水10000r/min离心15min，弃沉淀，收集上清即为抗GPV单克隆抗体，经Commassibrilliant blue(考马斯亮蓝R-250)法测定抗体蛋白浓度，分装，-20℃以下保存备用。
2.免疫荧光试剂制备
2.1抗体稀释：将抗GPV单克隆抗体以0.025M pH9.2碳酸盐缓冲液(0.025MpH9.2CBS)稀释成含蛋白浓度为10mg/mL，装入透析袋中备用；
2.2荧光素溶液的准备：称取异硫氰酸荧光素粉(FITC)，用0.025M pH9.2CBS配制成0.1mg/mL，磁力搅拌避光溶解；
2.3抗体标记：将透析袋置于相当抗体10倍体积的荧光素溶液中，采用透析法4℃避光磁力搅拌下标记24h；
2.4荧光标记抗体的纯化：取出透析袋中的标记抗体，1000r/min离心3min，取上清液过sephandx G-50层析柱，用灭菌0.01M Ph7.2PBS洗脱，除去游离的荧光素和盐；分管收集第一峰，并将IFA阳性的各管混合，适当浓缩，测定其工作浓度后分装，保存于-20℃备用。即为番鸭小鹅瘟病免疫荧光诊断试剂。
3.直接免疫荧光试验(DFA)方法的建立
3.1GPV感染细胞的制备：将番鸭小鹅瘟病毒(GPV)接种于已长成单层的96孔MDEF细胞培养板，同时设正常MDEF细胞为阴性对照；于37℃5％CO2条件下培养至细胞病变达30％左右时，弃培养上清液，以无菌PBS或生理盐水洗涤1次，每孔加入冷甲醇100μL，4℃固定30min，弃去固定液同前洗涤1次，-40℃冻存备用。
3.2组织冰冻切片的制备：取人工感染番鸭小鹅瘟病毒(GPV)的发病番鸭肝脏、脾脏和胰腺等组织或接种GPV死亡番鸭胚心，切成0.5cm3左右的大小，放置于冰冻切片机的组织固着器上，待组织冷冻后切成6-8um薄片，粘附在载玻片上，冷丙酮固定10-15分钟，-20℃冻存备用。
3.3DFA操作方法：取GPV感染细胞板或冰冻切片，加入适量经1％BSA-PBS稀释的上述免疫荧光试剂工作液，置于湿盒内，37℃感作30min，用PBS或生理盐水洗涤3次后，每孔加30μL抗荧光衰减封片剂(50％甘油-PBS)或切片以50％PBS-甘油封片，置荧光倒置显微镜下观察，以出现亮绿色荧光病灶判定阳性结果，拍照保存。同时设未接种病毒的正常细胞孔或正常组织冰冻切片作为阴性对照。
4.免疫荧光试剂的特性鉴定
4.1荧光试剂的工作浓度和敏感性
取3.1中制备的感染细胞板和阴性细胞对照，每孔分别加入预先经1％BSA-PBS系列稀释的免疫荧光试剂，进行DFA试验，以出现清晰明亮特异性荧光(++)的最大稀释度为试剂的DFA敏感性。结果显示：荧光试剂的敏感性达1∶400。为保证试剂的敏感性和荧光强度，确定工作浓度为1∶150。
4.2荧光试剂的特异性
将荧光抗体适当稀释后，分别取番鸭小鹅瘟病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MPV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、鸭副粘病毒(PMV)等感染细胞和鸭肝炎病毒(DHV)感染胚心冰冻切片，同时设阴性对照，每孔加1∶150稀释的荧光试剂30ul，进行DFA试验。结果显示：在倒置荧光显微镜下仅GPV感染细胞孔出现亮绿色荧光病灶，呈阳性反应，DFA的荧光特性与IFA相同；而其它病毒感染细胞及正常MDEF细胞均无交叉反应。表明制备的免疫荧光试剂特异性好，可用于GPV感染细胞的鉴定。
4.3荧光试剂的重复性和保存期
在96孔细胞培养板中进行。将GPV荧光试剂分装后分别置-40℃保存1、2、3、4、5、6、9、12个月后，对GPV感染细胞进行DFA试验，测定试剂保存期和批内批间重复性。结果显示：在-40℃保存至12个月荧光效价不变(见表1)，因此暂定其保存期为12个月；同时，批内和批间重复性都较好，质量稳定。
表1.荧光抗体-40℃保存不同时间的检测结果
注：判定标准：-：50个视野未见荧光灶；+：10视野见1-2个荧光灶；++：1个视野见1-2个荧光灶；+++：1个视野见5个以上荧光灶。
5.番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂的应用
5.1鹅细小病毒(GPV)抗原在细胞或组织中的定位
实验例
按直接免疫荧光试验(DFA)操作方法，将荧光抗体适当稀释后，分别取GPV、MPV、MDRV、ARV、PMV等感染细胞和正常对照细胞，每孔加1∶150稀释的荧光试剂30ul，进行DFA试验。结果显示：MDEF细胞感染GPV初期可在细胞核中见到弱阳性荧光，感染后36小时在胞核中出现较强的亮绿色荧光，随后荧光逐渐出现于整个细胞并随细胞崩解而向胞外扩散；而其它病毒感染细胞及正常MDEF细胞均未见荧光。表明GPV免疫荧光试剂可用于GPV感染细胞的鉴定和抗原定位。
表2.应用免疫荧光试验(DFA)鉴定GPV抗原
Figure BSA00000572303900051
注：判定标准同表1
6.2小鹅瘟病的快速诊断
实验例
按直接免疫荧光试验(DFA)操作方法，检测12份人工感染GPV番鸭组织冰冻切片样品，结果显示：供试的GPV感染番鸭肝脾胰等组织中可见强阳性的荧光病灶(见图1)，而健康对照番鸭组织均为阴性(见图2)；从表3也可知，DFA对人工感染鸭的阳性检出率为92.9％(13/14)，阴性率7.1％(1/14)；而应用间接免疫荧光(IFA)方法检测的阳性率为85.7％(12/14)，阴性率为14.3％(2/14)。两者的符合率为92.9％，同时DFA比IFA省时(DFA需时40分钟，IFA需时80分钟)，敏感性更高。表明GPV免疫荧光试剂可用于番鸭小鹅瘟病的快速诊断。
表3DFA和IFA检测人工感染番鸭组织冰冻切片
Figure BSA00000572303900052

Claims (2)

1.一种检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂,其特征在于, 制备番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂是应用抗鹅细小病毒杂交瘤细胞株D11株制备抗鹅细小病毒单克隆抗体，然后用抗鹅细小病毒单克隆抗体标记异硫氰酸荧光素制备检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂；所述的抗鹅细小病毒杂交瘤细胞株D11株，保藏在CCTCC，保藏日2011年4月15日，保藏编号：C201120。
2.一种权利要求1所述的检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂的制备方法，其特征在于,将蛋白浓度为10mg/mL抗鹅细小病毒单克隆抗体以透析法对0.1mg/mL异硫氰酸荧光素粉4℃标记24 h，经sephandx G-50层析柱纯化并适当浓缩，即为检测番鸭小鹅瘟病免疫荧光试剂。
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