CN102702377A

CN102702377A - 鸡枞菌多糖分离纯化方法及其注射液

Info

Publication number: CN102702377A
Application number: CN201210206102XA
Authority: CN
Inventors: 汪开毓; 王思芦; 陈德芳; 赵玲
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明公开了一种鸡枞菌多糖分离纯化方法，采用超声波法提取，20kHz的超声功率，在80℃、料液比为1∶20、提取40min，共提取2次得多糖粗提物，将多糖粗提物配成浓度为20％的溶液，-20℃冷冻，室温缓慢融化，3000r/min离心10min，除去聚沉物；重复冻融5次；将经过冻融的多糖溶液与Sevage试剂按4∶1比例混合，充分振荡30分钟，2000r/min离心10min，下层白色絮状沉淀为蛋白质层，收集上层多糖溶液。实验结果表明，一定剂量TAP可显著提高试验动物的体液免疫及细胞免疫能力，效果优于同剂量的APS。

Description

鸡枞菌多糖分离纯化方法及其注射液

技术领域

本发明涉及的是一种鸡枞菌多糖分离纯化方法及其注射液。

背景技术

自从1969年日本学者千原首次报道香菇多糖具有抗肿瘤活性以后，真菌多糖引起越来越多的关注，成为一个非常活跃的研究领域。药用真菌多糖被称为生物反应调节物(Biological response modifier，BRM)，因其具有广泛的生物学活性如免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化、抗病毒等作用。鸡枞菌多糖具有易溶于水不溶于乙醇的特性，可通过水提醇沉的方法获得。但这些多糖含有较多杂质，如游离蛋白质、色素以及一些低分子物质，包括寡糖、一些单搪、盐分等，因此必须将粗提多糖进行纯化并鉴定其纯度，为下一步的研究做准备。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种鸡枞菌多糖分离纯化方法及其注射液。

本发明的技术方案如下：

一种鸡枞菌多糖分离纯化方法，采用超声波法提取，20kHz的超声功率，在80℃、料液比为1∶20、提取40min，共提取2次得多糖粗提物，将多糖粗提物配成浓度为20％的溶液，-20℃冷冻，室温缓慢融化，3000r/min离心10min，除去聚沉物；重复冻融5次；将经过冻融的多糖溶液与Sevage试剂按4∶1比例混合，充分振荡30分钟，2000r/min离心10min，下层白色絮状沉淀为蛋白质层，收集上层多糖溶液；重复上述步骤3次；向除蛋白后的多糖溶液中加入氨水，调pH值到9，50℃保温，不停搅拌，边搅拌边加入10％H₂O₂直至溶液呈浅色为止；将脱色后的多糖溶液装入透析袋，透析袋的截留分子量＞8000，以蒸馏水流水透析24小时，40℃减压浓缩至100mL，加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心10min，将沉淀于40℃鼓风干燥后称重。

鸡枞菌多糖注射液，将精制鸡枞菌多糖以生理盐水配制为20mg/mL的多糖溶液，调pH＝7.0，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌条件下分装，4℃保存。

本试验结合畜禽生产实践将TAP注射液结合疫苗使用，以免疫动物的抗体消长规律、白细胞总数及分类计数、免疫器官指数等指标的变化综合考察了不同剂量TAP的免疫增强效果，结果表明一定剂量TAP可显著提高试验动物的体液免疫及细胞免疫能力，效果优于同剂量的APS。

附图说明

图1提取温度对TAP粗多糖含量的影响；

图2提取液料比对TAP粗多糖含量的影响；

图3提取时间对TAP粗多糖含量的影响；

图4提取次数对TAP粗多糖含量的影响；

图5两种提取方法对TAP粗多糖含量的影响；

图6葡萄糖标准曲线；

图7为TAP对口蹄疫抗体的影响(n＝6)；注：相同时间的柱形图上标不同大小写的同一字母表示差异显著(P＜0.05)，标不同字母表示差异极显著(P＜0.01)；

图8为TAP对新城疫抗体的影响(n＝10)；注：相同时间的柱形图上标不同大小写的同一字母表示差异显著(P＜0.05)，标不同字母表示差异极显著(P＜0.01)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1鸡枞菌多糖分离纯化工艺研究

1试验材料

1.1主要药品与试剂

鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)子实体干品购自西昌市凉山山珍销售处，重蒸苯酚，透析袋(截留分子量8000～14000)，胰蛋白酶，葡萄糖，浓硫酸，氢氧化钠，无水乙醇，氯仿，正丁醇，过氧化氢等为国产分析纯。

1.2主要仪器

DU800紫外可见分光光度计(BeckmanCoulter，Inc)，AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，格兰仕微波炉(格兰仕电器有限公司)，超声波清洗机(泰能设备有限公司)，RE52-99型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，Fw177型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，SW-420-2S型恒温水箱(金坛市新航仪器厂)，CSIO1-IE电热鼓风干燥箱(中外合资重庆四达试验仪器有限公司)，MYIO电磁搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)等。

2方法

2.1鸡枞菌粗多糖提取工艺的单因素研究

2.1.1温度对粗多糖得率的影响

将鸡枞菌于50℃烘干至恒重，粉碎至80目，称取5份2.00g鸡枞菌粉，按照料液质量比1∶20加入40mL蒸馏水，分别在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下提取1h，只提取1次，通过抽滤将各份滤液分别浓缩后定容至20ml，加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心10min，将沉淀于40℃烘干后称重，计算多糖粗提率。

2.1.2液料比对粗多糖得率的影响

称取5份2.00g鸡枞菌粉分别以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液(重量比，克：克)比加入蒸馏水，在2.1.1确定的最佳提取温度下提取1次，通过抽滤将各份滤液分别浓缩后定容至20ml，加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心10min，将沉淀于40℃烘干后称重，计算多糖粗提率。

2.1.3提取时间对粗多糖得率的影响

称取5份2.00g鸡枞菌粉在以上试验确定的最佳液料比和温度下提取1次，提取时间分别为1、2、3、4、5h，按2.1.1方法提取粗多糖，计算多糖粗提率。

2.1.4提取次数对粗多糖得率的影响

称取5份2.00g鸡枞菌粉在上述方法确定的最佳提取温度、时间及料液比分别提取1、2、3、4、5次，按2.1.1方法提取粗多糖，计算多糖粗提率。

2.2鸡枞菌粗多糖的提取工艺正交试验

由于各提取因素之间有相互交叉影响，为全面考察热水浸提法提取鸡枞菌多糖的工艺参数，根据单因素试验的结果及有关资料，对上述四因素，即提取温度、料液比、提取时间、提取次数进行正交试验设计，采用L₉(3⁴)正交试验设计提取工艺并测定鸡枞菌多糖粗提率。各因素水平设计见表1。

表1因素水平表

2.3超声波法与热水浸提法的粗多糖提取率比较试验

根据2.2结果，参考最佳提取温度、料液体积比和提取次数，将2.00g鸡枞菌粉5份置于恒温水浴箱；另取5份置于超声波清洗机内，温度设置同恒温水浴箱，超声功率为20kHz；分别在提取20min，30min，40min，50min，60min后，通过抽滤将各份滤液分别浓缩后定容至20ml，加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心10min，将沉淀于40℃烘干后称重，计算多糖粗提率。

2.4试验用精制多糖制备

取250g鸡枞菌干粉，按最佳提取温度、提取次数、料液比、在最佳提取时间超声提取多糖，并按以下方法对其进行纯化，最后对其进行定性和定量分析。

2.4.1冻融法除蛋白

将多糖粗提物配成浓度为20％的溶液，-20℃冷冻，室温缓慢融化，3000r/min离心10min，除去聚沉物；重复冻融5次。

2.4.2Sevage法除蛋白

将氯仿和正丁醇配制成体积比为4∶1的混合液即为Sevage试剂。将经过冻融的多糖溶液与Sevage试剂按4∶1体积比例混合，充分振荡30分钟，2000r/min离心10min，下层白色絮状沉淀为蛋白质层，收集上层多糖溶液；重复上述步骤3次。

2.4.3H₂O₂脱色

向除蛋白后的多糖溶液中加入氨水，调pH值到9，50℃保温，不停搅拌，边搅拌边加入10％H₂O₂直至溶液呈浅色为止。

2.4.4透析法去除小分子杂质

将脱色后的多糖溶液装入透析袋，以蒸馏水流水透析24小时，40℃减压浓缩至100mL加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心10min，将沉淀于40℃鼓风干燥后称重。

2.4.5多糖定性试验

取适量精制多糖样品，加蒸馏水配成1mg/mL的溶液，取1ml加入15％α-萘酚乙醇溶液2ml，混匀后，沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5mL，试管内出现蓝紫色的环，则判断有多糖存在。甲醇法：取多糖样品一定量，加蒸馏水配成1mg/ml的溶液，取1ml加入0.2ml0.5mol/mL的NaOH，甲醇1ml，出现白色混浊现象，则判断有多糖。

2.4.6鸡枞菌多糖的糖含量测定

糖类与强酸加热产生糠醛或糠醛衍生物，与显色剂缩合成有色络合物。制作葡萄糖标准曲线，精密称取葡萄糖，配成浓度为1mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0mL、0.01mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL于7支试管中，加蒸馏水至2mL，然后向各试管中加入6％苯酚溶液1mL，摇匀后迅速加入5.0mL浓硫酸，混匀后静置10min，置沸水浴中15min，冷却后于分光光度计490nm处测定吸光值(OD₄₉₀)。以OD₄₉₀对糖含量X(mg/mL)作图，并进行线性回归。将鸡枞菌精制多糖样品50mg溶于25mL蒸馏水中，取0.02mL按上述方法测得OD₄₉₀，利用回归方程及以下公式计算鸡枞菌干粉含糖率。

3结果与分析

3.1单因素对粗多糖含量的影响

在料液比、提取时间与次数不变时，鸡枞菌多糖(Termitomyces albuminosuspolysaccharide，TAP)获得量随着提取温度的升高而增加。2.00g鸡枞菌粉在60℃时提取到0.118g粗提多糖，提取率仅为5.9％；与之相比，70℃时提取率升高了27.1％，80℃时升高了39％，90℃～100℃随温度升高提取率增加的速率变小，在100℃时达到最大值0.17g，结果见图1。浸提温度升高可加剧水分子的运动，并对细胞壁破坏加剧使多糖容易溶出，但高温对多糖及蛋白类物质可能有变性作用，破坏其结构和功能，同时为节约能源，选择80℃作为最佳提取温度。

从图2可知，其他条件不变的时，当料液比为1∶30，粗多糖得率最高为9.25％，随着溶剂量的继续增大，多糖的提取量反而减少，结果表明多糖在适量的水中溶出量已达到平衡，过多的溶剂在浓缩及醇沉时可能造成多糖的损失，故选择料液1∶30作为最佳料液比。

由图3可知，当提取时间为1～3h时粗多糖得率随着提取时间延长有明显的提高，2h时为9.8％，3h时达到最大值为11％，继续延长提取时间则多糖得率开始下降，这可能与粗多糖中部分成分在长时间的较高温度下发生变性或分解有关，因此提取时间不宜太长，选择2小时作为最佳提取时间。

由图4可知，提取2次粗多糖得率显著增加，比仅提取1次得率提高了42.2％，但当进一步增加提取次数后，粗多糖含量并没有明显提高，反而略有下降，表明在以上提取条件下提取2次后粗多糖的溶出已到达上限，若继续增加提取次数使提取液总体积增加，在后续浓缩及醇沉时可能造成损失，因此从提取效率及节能方面考虑，最佳提取次数为2次。

3.2粗多糖提取工艺参数的正交试验结果

由于各因素之间有相互交叉影响，为全面考察热水浸提法提取鸡枞菌粗多糖的工艺参数，根据单因素试验的试验结果，对提取温度A、提取时间B、料液比C、提取次数D进行正交试验设计，采用L₉(3⁴)正交试验提取并计算鸡枞菌粗多糖的含量，对结果进行方差分析，结果见表2～3。

由表2可知，R_A＞R_C＞R_D＞R_B表明各因素对鸡枞菌粗多糖提取量的影响程度为提取温度＞提取液料比＞提取次数＞提取时间；因素A的K2＞K3＞K1，水平2比其他水平好；因素B的K1＞K2＞K3，因素C的K2＞K3＞K1，因素D的K2＞K3＞K1；因此，最佳提取工艺为A₂B₁C₂D₂，即在80℃、料液比为1∶20、提取1h，共提取2次。仅对A、C、D三因素对粗多糖得率影响进行方差分析，结果表明，F_A＝94.29在F_0.05～F_0.01间，对粗多糖得率差异显著，F_C、F_D值均小于F_0.05，差异均不显著。

表2多糖提取工艺正交试验

表3提取因素对多糖得率影响的方差分析

3.3超声波法与热水浸提法提取粗多糖效果比较

根据3.2结果，将2.00g鸡枞菌粉分别置于恒温水浴箱及超声波清洗机内，在80℃、料液体积比为1∶20，共提取2次的条件下进行不同时间的粗多糖提取，结果见图5。20kHz的超声功率下，提取20min，多糖得率为7.55％，比同时间热水浸提得率3.55％高出了4％；随着提取时间的延长，40min时超声波法提取率达到最大值11.65％，随后得率下降，可能与超声波作用下水分子的剪切力造成了部分粗多糖成分被破坏，降低了提取率有关；热水浸提法多糖得率随提取时间延长而提高，60min时提取率达到最大值8.45％，仍低于超声波法的9.45％。在本试验条件下的超声提取时间以40min为宜，可显著缩短粗多糖的热水浸提时间。

3.4精制多糖制备

通过超声波法结合最佳提取工艺，从250g鸡枞菌粉中共提取到21.53g粗多糖，经过反复冻融后和Sevage法除蛋白后，得到黏性较强，易溶于水、褐色的多糖部分，再经过脱色和透析后得到浅褐色的膏状多糖。经过纯化后得到16.72g精制多糖，得率为6.69％。

3.4.1定性试验

结果表明，将精制多糖加蒸馏水配成1mg/mL的溶液，取1mL加入15％α-萘酚乙醇溶液2mL，混匀后沿管壁缓缓加入浓硫酸0.5mL，试管内出现蓝紫色的环；另取1mL加入0.2mL0.5mol/mL的NaOH、1mL甲醇，则出现白色混浊现象，因此鸡枞菌水提取物经过醇沉及除蛋白等方法纯化后得到的是多糖类物质。

3.4.2糖含量测定

结果表明，葡萄糖标准曲线的回归方程为y＝56.803X-0.0084，R²＝0.9992，见图6。测得2mg/ml的精制多糖溶液OD₄₉₀＝0.253，根据回归方程可得出50mg精制多糖的含糖量为46.085mg，即精制多糖中糖占92.17％，剩下的7.83％为与多糖结合在一起的糖蛋白；根据鸡枞菌干粉的精制多糖得率为6.69％，代入以下公式可求得鸡枞菌干粉含糖量为6.17％。

此外，本试验使用截留分子量＞8000的透析袋对TAP进行蒸馏水流水透析，可有效去除寡糖、单糖及其他杂质分子，进一步提高了TAP纯度。

实施例2

TAP注射液的制备

将精制TAP以生理盐水配制为20mg/mL的多糖溶液，调pH＝7.0，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌条件下分装，4℃保存。

鸡枞菌多糖作为免疫佐剂对疫苗免疫效果的影响

鸡枞菌多糖(TAP)具有较强的增强正常及免疫抑制小鼠细胞免疫和体液免疫的作用，可促进体外培养小鼠T、B淋巴细胞增殖、调节CD4⁺与CD8⁺平衡、增加细胞因子分泌及相关mRNA的表达。为了探讨TAP注射液用于临床的免疫调节效果，本试验以黄芪多糖注射液为阳性对照，观察了TAP注射液对猪口蹄疫油乳剂灭活疫苗、鸡新城疫弱毒苗的免疫增强效果及其与TAP剂量的关系，旨在筛选TAP的最佳临床使用剂量，为将TAP注射液作为新型免疫佐剂应用于生产实践提供理论依据。

1试验材料

1.1主要药品与试剂

鸡枞菌多糖注射液(多糖含量为20mg/mL)，黄芪多糖注射液(多糖含量为20mg/mL江苏华东贝尔生物药业，批号20101203)，猪O型口蹄油佐剂疫灭活苗(中牧兰州生药厂，批号1101001)，猪O型口蹄疫正向血凝试验诊断试剂(中国农业科学院兰州兽医研究所，批号：抗原110123，阳性血清110318，阴性血清110112，稀释液110410)，新城疫活疫苗(La Sota株)(青岛宝依特，批号：20110712)。新城疫标准阳性抗原(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，批号：100112)，3.8％柠檬酸三钠、生理盐水。

1.2主要仪器

离心机(上海安亭科学仪器厂)，96孔V型反应板(上海医疗器械三厂)，1～100μL八道移液器，恒温箱，超净工作台96孔微量板，微量振荡器(江苏太仓实验设备厂)，生化培养箱(上海跃进医疗器械公司)，FX9800动物血细胞分析仪(南京普朗医用设备公司)

1.3试验动物

28日龄杜×长×大三元杂交仔公猪30头，由四川西昌市某猪场供试；1日龄青脚麻鸡125羽，购自四川西昌市某鸡场。

2方法

2.1TAP对猪口蹄疫灭活苗免疫效果的影响

2.1.1动物分组与处理

将供试仔猪随机分为5个组，即空白组、黄芪多糖(APS)组、TAP高中低剂量组，每组6头；各组于28日龄按疫苗使用说明进行首免，在首免同时连续3d耳后肌肉注射给药，空白组注射生理盐水0.1mL/kg、APS组注射0.1mL/kg，TAP高中低剂量组分别注射0.2mL/kg，0.1mL/kg，0.05mL/kg；试验期间饲养管理条件一致，首免后30d各组进行二免，同时连续给药3d，剂量同上。分别于首免后21、28、58、88、118d前腔静脉采血，分离血清，-20℃保存待测。

2.2.2正向间接血凝试验检测口蹄疫抗体效价

检测样品前将冻干的血凝抗原，每瓶加稀释液5ml，摇匀后置4℃冰箱内静置7d。检测时将待检血清放置于恒温水浴锅中56℃灭活30min。在血凝板上每孔加入稀释液50μL，于每排第1孔加入待检血清50μL，混匀，倍比稀释至第9孔，混匀后取出50μL丢弃，此时待检血清在每排1～9孔的稀释度依次为：1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512；取阴性血清50μL以稀释液倍比稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃，使阴性血清对照孔稀释度为1∶2～1∶16；取阳性对照血清50μL，以稀释液倍比稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃，此时阳性血清稀释倍数为1∶2～1∶4096；在被检血清各孔、阴性及阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原25μL，将血凝板置于微量振荡器上振荡lmin后放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，若血球均匀无沉积孔底，盖上玻板，静置于室温下2h判定结果。

判定标准：将血凝板放在白纸上，先观察阴性血清1∶16对照孔和稀释液对照孔，无凝集现象，红血球全部沉于孔底或呈25％红细胞发生凝集为合格。阳性血清1∶2～1∶256各孔，应出现50～75％红细胞发生凝集为合格。在对照孔合格的前提下，最后观察待检血清孔，以呈现50％红细胞发生凝集的血清最大稀释倍数为该份血清的抗体效价，抗体效价以log2表示。

2.2.3TAP对免疫仔猪外周血白细胞的影响

各组分别于首免后21、28、58d采血抗凝，使用全自动血细胞分析仪检测样品中白细胞总数，中性、单核细胞、淋巴细胞的数量。

2.2TAP对鸡新城疫弱毒苗免疫效果的影响

2.2.1动物分组与处理

125羽1日龄雏鸡饲养至12日龄，随机分为5组，每组25羽，按新城疫活疫苗使用说明进行滴鼻，同时连续3d颈背部皮下注射给药，空白组注射生理盐水0.3mL/kg、APS组注射0.3mL/kg，TAP高中低剂量组分别注射0.3mL/kg，0.2mL/kg，0.1mL/kg；首免后14d各组使用相同疫苗进行二免，同时连续给药3d，各组剂量同上。分别于首免后7d、14d、21d、28d、35d翼下静脉采血，分离血清，-20℃保存待测。

2.2.21％鸡红细胞悬液制备

由新城疫非免疫鸡心脏或翅静脉采血，按抗凝剂与全血比例为1∶2的加入3.8％柠檬酸钠，迅速混匀，2000r/min离心10min，用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜，向红细胞沉淀加入生理盐水，慢慢混匀，2000r/min离心10min，弃去上清液，再加生理盐水混匀，如此反复离心3次，最后一次离心后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥；使用时用移液器吸取1ml红细胞泥，然后加入99ml的生理盐水，即为1％红细胞悬液，现用现配。

2.2.3血凝(HA)试验测定抗原效价

用微量移液器向96孔V型反应板的每孔加生理盐水25μL，加入待测抗原25μL于第1孔中并挤压5次混合，吸出25μL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，弃去25μL；将1％鸡红细胞悬液依次加入各孔，每孔25μL，置于微量振荡器上振荡1min，室温静置30min后观察结果。

判定标准：将反应板倾斜成45度角，沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或不完全被抗原凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被抗原所凝集。能使鸡红细胞完全凝集的抗原最高稀释倍数为该抗原红细胞凝集效价。

2.2.44单位凝集价抗原校正

根据2.2.3抗原效价检测结果配制相应比例的抗原稀释液，即4单位抗原。以微量移液器向反应板的第2孔至第6孔加生理盐水25μL，第1孔不加；取4单位抗原25μL分别加入第1、2孔中，从第2孔开始挤压5次混合，后吸出25μL至第3孔，依次倍比稀释到第5孔，弃去25μL；将1％鸡红细胞悬液依次加入1～6孔，每孔25μL；将反应板于微量振荡器上振荡1min，室温静置30min后观察结果。

判定标准：第1、2、3孔为完全凝集，第4孔红细胞为50％沉淀，第6孔为对照完全沉淀，如果出现以上结果，表明所配4单位凝集价抗原准确，校正成立。

2.2.5血凝抑制(HI)试验检测新城疫抗体效价

每排孔检查1份血清，各孔加入25μL生理盐水，取待检血清25μL置于第1孔中混匀，倍比稀释至第11孔后弃去25μL；每孔加入4单位凝集价的抗原25μL，置于微量振荡器上振荡1min，混合均匀。室温静置20min；每孔各加25μL1％红细胞悬液，置于微量振荡器上振荡1分钟，混合均匀，室温静置30min观察结果。结果判定，以100％抑制凝集的血清最大稀释度为该血清的抗体效价。

2.2.6免疫器官指数检测

于首免后7d、14d、21d每组均随机抽取5只鸡处死，分离其脾脏和法氏囊，称重后按以下公式计算免疫器官指数。

免疫器官指数＝免疫器官重量(mg)×1000/体重(g)

2.3数据分析

采用SPSS13.0分析软件进行数据统计处理，方差分析组间差异。

3结果与分析

3.1TAP对口蹄疫油佐剂灭活苗免疫效果的影响

结果见表4和图7，对接种疫苗前的母源抗体检测表明，21d时随机抽取的样本母源抗体为4.8±0.72 log2，同时进行首免，首免后21d空白组、APS组及TAPL组的抗体效价均无显著差异(P＞0.05)，而TAP中高剂量组的抗体水平均显著高于空白组，且以高剂量TAP效果最佳。首免后30d进行二免，在二免前即首免后28d抗体水平检测表明，各组抗体水平均呈上升趋势；APS可提高抗体效价5.80％，但与空白组比无显著差异(P＞0.05)；低剂量TAP效果优于APS，该组抗体水平显著高于空白组(P＜0.05)，抗体效价提高10.14％；且随着TAP剂量增大，中高剂量TAP对抗体水平的影响无显著差异(P＞0.05)，但均显著高于空白组(P＜0.01)和APS组(P＜0.01)，其中高剂量TAP效果最好，与空白组比可提高抗体水平达26.09％。

首免后58d，各组抗体水平均达到了峰值，且由高到低的顺序依次为TAPH＞TAPM＞TAPL＞APS＞空白组，TAP各剂量组均显著高于空白组(P＜0.05或P＜0.01)，低剂量TAP与APS组差异不显著，各TAP剂量组间差异不显著，表明TAP具有明显提高猪抗体水平的作用，并且其对抗体水平的提高作用与剂量成正比。首免后88d仅高剂量TAP组的抗体水平高于同期其余各组，此时其余各组间抗体水平已无明显差异(P＞0.05)，表明高剂量TAP提高抗体水平的作用时间最长，并随着时间延长这种作用逐渐消弱，到118d时各组抗体水平与空白组比均无显著差异(P＞0.05)。

表4TAP对口蹄疫抗体的影响(

n＝6)1g2

注：相同时间的列上标不同大小写的同一字母表示差异显著(P＜0.05)，标不同字母表示差异极显著(P＜0.01)，下表同。

3.2TAP对免疫仔猪外周血白细胞的影响

由表5可知，与空白组相比，在首免后21、28及58d，APS可分别显著提高仔猪外周白细胞总数62.45％(P＜0.01)、78.11％(P＜0.01)和28.33％(P＜0.01)；低剂量TAP对白细胞总数的影响与APS无显著差异，但随着TAP剂量增大，使白细胞总数增加越显著，表现出剂量依赖性；与APS组比较，中剂量TAP可使白细胞总数在首免后21、28及58d分别提高16.09％(P＜0.01)，14.58％(P＜0.01)和3.32％(P＞0.05)；与各组相比，高剂量TAP均能显著提高白细胞总数(P＜0.01)，在首免后21、28及58d分别高出空白组125.91％(P＜0.01)，143.99％(P＜0.01)和65.78％(P＜0.01)。

表5TAP对免疫仔猪外周血白细胞的影响((

n＝6))10⁹/L

由表6可知，在首免后21、28d，APS可分别显著提高仔猪外周血中性粒细胞比率79.67％(P＜0.01)和97.85％(P＜0.01)；低剂量TAP对中性粒细胞比率的影响与APS无显著差异，随着TAP剂量增大，提高中性粒细胞比率的作用越显著，与空白组相比高剂量TAP在首免后21d使中性粒细胞比率提高130.78％(P＜0.01)，首免后28d提高135.06％(P＜0.01)，显著优于APS的作用(P＜0.01)；在首免后58d与空白组比，APS及中剂量TAP分别使中性粒细胞比率提高29.01％和30.78％，差异均显著(P＜0.05)，低剂量TAP与空白组差异不显著；高剂量TAP可使中性粒细胞比率提高60.97％，显著高于其余各组(P＜0.01或P＜0.05)。

表6TAP对免疫仔猪外周血中性粒细胞、单核细胞的影响((

n＝6))10⁹/L

由表7可知，在首免后21、28及58d，APS与低剂量TAP均可提高仔猪外周淋巴细胞数，其中APS在首免后21d时可显著提高淋巴细胞数39.09％，而在首免后28、58d均与空白组相比差异均不显著；中剂量TAP在首免后21～28d可提高显著淋巴细胞数，效果优于APS和低剂量TAP，但随着时间延长，淋巴细胞数逐渐减少，至首免后58d，除高剂量TAP组的淋巴细胞数仍保持较高水平外，空白组与APS、中、低剂量TAP组间差异不显著。在不同的检测时间，高剂量TAP组淋巴细胞数始终显著高于其余各组，与APS组相比，在首免后21、28及58d时可分别提高淋巴细胞数57.84％(P＜0.01)、77.30％(P＜0.01)和35.88％(P＜0.01)。

表7TAP对免疫仔猪外周血淋巴细胞的影响(n＝6)10⁹/L

由表5～7可知，APS和TAP均可提高外周血白细胞总数、中性及单核细胞量、淋巴细胞量，以上血液生理指标在检测时间段内以首免后21d达到峰值，7d后各指标水平显著下降，经过二免及再次给药后各指标水平再次升高，并随时间延长而逐渐降低；高剂量TAP能使以上各指标维持在较高水平，并在首免后58d内均显著高于APS与空白组。

3.3TAP对鸡新城疫弱毒苗免疫效果的影响

由表8、图8可知，各时段APS组的抗体水平均高于空白组，但差异均不显著；在二免前，即首免后7～21d内，TAP各剂量组均能显著提高抗体水平(P＜0.01)，并随时间延长抗体水平逐步提高；首免后21d，中剂量TAP效果最好，使抗体水平高于空白组62.79％，且与其余各组差异均显著(P＜0.01)；首免后21d进行二免，使各组抗体水平在首免后28d均达到峰值，中剂量TAP使抗体水平显著高于其余各组(P＜0.01)，而APS与TAP高低剂量组差异不显著(P＞0.05)，TAP对抗体生成的促进作用在中剂量最显著，表明TAP对该弱毒苗的免疫调节作用可能具有双向调节作用，以中剂量效果最佳。首免后35d，TAP高中低剂量组抗体水平均显著高于空白组，分别将抗体水平提高了18.33％，45％和23.33％，表明中剂量TAP对ND抗体水平有持久而显著的提高作用。

表8TAP对新城疫抗体的影响(

n＝10)log2

3.4TAP对鸡免疫器官指数的影响

由表9可知，首免后7d，与空白组相比，APS组脾脏指数差异不显著，而法氏囊指数有提高(P＜0.05)；中剂量TAP可提高脾脏指数12.96％(P＜0.01)，高剂量TAP则可提高9.26％(P＜0.05)；APS可显著提高法氏囊指数7.14％(P＜0.05)，TAP各组均能不同程度的提高法氏囊指数，其中中剂量效果最佳，使法氏囊指数升高14.29％，与APS组比差异显著(P＜0.05)；首免后14d，中剂量TAP组的脾脏指数和法氏囊指数分别比空白组提高了11.76％(P＜0.01)和14.40％(P＜0.01)，但不同剂量的TAP组间差异均不显著，且以中剂量组效果最好；首免后21d，中剂量TAP组的脾脏指数和法氏囊指数分别比空白组提高了20.34％(P＜0.01)和19.05％(P＜0.01)，不同TAP剂量对脾脏指数影响差异不显著，但随着剂量增大呈现双向调节的趋势，中剂量TAP对法氏囊指数提高作用显著高于低剂量TAP(P＜0.01)和高剂量TAP(P＜0.05)，而低、高剂量TAP组间差异不显著。

表9TAP对鸡免疫器官指数的影响((

n＝5)

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种鸡枞菌多糖分离纯化方法，其特征在于，采用超声波法提取，20kHz的超声功率，在80℃、料液比为1∶20、提取40min，共提取2次得多糖粗提物，将多糖粗提物配成浓度为20％的溶液，-20℃冷冻，室温缓慢融化，3000r/min离心10min，除去聚沉物；重复冻融5次；将经过冻融的多糖溶液与Sevage试剂按4∶1比例混合，充分振荡30分钟，2000r/min离心10min，下层白色絮状沉淀为蛋白质层，收集上层多糖溶液；重复上述步骤3次；向除蛋白后的多糖溶液中加入氨水，调pH值到9，50℃保温，不停搅拌，边搅拌边加入10％H₂O₂直至溶液呈浅色为止；将脱色后的多糖溶液装入透析袋，透析袋的截留分子量＞8000，以蒸馏水流水透析24小时，40℃减压浓缩至100mL，加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心10min，将沉淀于40℃鼓风干燥后称重。

2.采用权利要求1所述的方法制备的鸡枞菌多糖制备鸡枞菌多糖注射液，其特征在于，将精制鸡枞菌多糖以生理盐水配制为20mg/mL的多糖溶液，调pH＝7.0，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌条件下分装，4℃保存。