CN102272144A - 采用单一聚合物相系统的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从液体富集一种目标化合物的方法，该方法包括通过在两个水相之间差别性分配进行的至少一个分离步骤。在本发明中，通过在热和其它条件下向水性生物技术溶液(例如发酵样品或生物分离过程流)中加入热致感应型自缔合(即混浊)亲水性聚合物，并且如果需要加入一些另外的盐形成这些相，其中溶液分离为一聚合物两相系统，伴随一相富集聚合物。目标化合物存在于不富集聚合物的相中，同时不同百分数但大量的杂质可差别性地分配至相界面或聚合物富集相。伴随较少改变或不改变的含目标物的相溶液可通过标准单元操作例如沉淀、色谱法和过滤得到进一步处理以进一步纯化目标物并除去任何残余的聚合物。
Description
技术领域
本发明涉及从液体富集一种目标化合物的方法，该方法包括通过在两个水相之间差别性地分配进行的至少一个分离步骤。其看来尤其很适合于抗体或抗体衍生的目标物，并且也可适合于其它用途如病毒疫苗处理。
发明背景
生物技术革命，包括现代生物制药的发展和人类基因组的绘制，由于分离方法如色谱法和电泳的发展已经成为可能。这样的方法可用于小规模与大规模中，并且已知为可变方法，用于多种物质包括生物物质。然而，它们在技术和设备方面都要求高。另外，一些方法如制备型电泳的缩放由于加热和冷却需求的非线性缩放导致需要更加复杂的设备。这样的复杂化也妨碍这样的方法的模拟及其经(小体积、微量滴定)高通量筛选方法的最佳化。
在聚合物水相系统中的相间分配为一种替代方法，其自20世纪50年代已得到研究，但是其商业应用受到缺乏提供良好容量(目标物溶解性)的经济上可行(廉价)相系统的严重限制。与分离方法例如絮凝、结晶和尺寸排阻一起；分配被认为是典型的分离技术。其涉及在两相之间差别性地分布目标物与其它物质。术语“分配”可指(a)液-固分配如在典型的捕获色谱法中；(b)在两个或更多个液相之间的分配(分别为双相和多相系统)；(c)在流动的液相与固定于固相载体表面的另一个液相之间分配；和(d)在液相和两相间相界面之间的颗粒分配。为了本专利申请的目的，分配(partition和partitioning)指如b、c或d的情况即在液相之间分配。在该定义中，目标物容量也不是(固)相表面积的函数，而是液相体积的函数。因此容量可能很高(见以下)。分配通常表达为与一相中的浓度：另一相中的浓度有关的系数(K)，并且对于溶质K通常遵循布朗斯台德方程式。因此预计K随着各种类型的相互作用(如静电和/或疏水相互作用)以指数方式变化，而且还对溶质大小即与液相相互作用的面积敏感。在界面分配的情况中(其中颗粒可通过界面张力保持在液-液相界面)，预计K随着界面张力以及相组成因子(phase compositional factor)而以指数方式变化。
典型的液-液两相系统为有机的和水性的两相系统，其通常在相间具有显著的极性差异以及显著的界面张力。这样的系统对于生物制品如蛋白质或细胞不是很有用，因为它们常常被显著非极性溶液和与混合具有显著界面张力的相系统有关的剪切损伤变性。对于生物制品更有用的是低张力、水性聚合物两相系统(aqueous polymer two phase-system)。已很好地认识到后者可包含一些外加的有机溶剂(例如乙醇)或其它有机添加剂，其被加入以增强目标物溶解性、减少液相极性、减少起泡、起杀菌剂作用等。
聚合物两相系统可通过在水溶液中混合某些亲水性和通常为中性的聚合物形成。这些聚合物包括葡聚糖(缩合葡萄糖)和聚乙二醇(PEG)；以及水溶性聚蔗糖(如FicollTM)和PEG；或者线性聚丙烯酰胺和PEG。每种聚合物的典型浓度为5-10％w/w。在这样的浓度下，熵与其它力常常驱使两相形成，这两相通常都大于90％(w/w)水，但是在极性、氢键特性、冰点等方面显示细微差异。这些相通常富集一种聚合物并具有低的界面张力。相密度差通过重力或离心驱使相分离。在生物技术领域，PEG和葡聚糖型两相系统的一个益处是目标蛋白质可向PEG富集、不太稠密的上相分配，而细胞碎片和一些杂质可分配(或沉积)至界面或互补的下相。
独立于加入并然后从生物过程流除去两种聚合物的挑战，葡聚糖和PEG及类似的二聚合物相系统的主要缺点为聚合物的成本。这对于葡聚糖——其为本身必须被纯化以用于生物处理相系统的天然生物制品，是尤其确切的。在减少这样的成本的努力中，科学家已经研究了两种途径。第一种途径为用淀粉或其它不太昂贵的聚合物替代葡聚糖。然而这样的聚合物通常不太纯、较少控制MW、形成更加粘的相，并且伴随发生属于它们自己的独特挑战(Josefine Persson，Dana C.Andersen，Philip M.Lester，Biotechnology and Bioengineering，第90卷，(2005)442-451)。另一方法是经由混合相对高浓度的PEG(10％w/w)与盐例如硫酸钾(3％w/w)形成的两相系统起作用。关于在这样的系统中的蛋白质分配参见Andrews，Nielsen，Asenjo，1996.和Azevedo等，2007(在以下更详细讨论)，而对于与质粒分配相关的新近综述参见F.Rahimpour，F.Feyzi，S.Maghsoudi，R.Hatti-Kaul，Biotechnology andBioengineering，95，627-637，2006)。遗憾的是增加的PEG和盐浓度产生负面影响方法成本的挑战。这些挑战包括粘性相、盐试剂成本、盐处理和设备腐蚀挑战以及与容量相关的目标溶解性问题。例如在这些系统中的抗体容量通常为1g/L，这意指以10g/L包含所表达抗体的(澄清)发酵液在分配之前必须稀释10倍。其也意指如果该相系统花费每升5美元来配制，那么它们增加至少1克5美元的商品成本。这样的稀释和过程体积、工艺时间和成本的相关增加是禁止性的。
一些亲水性聚合物呈现反向热溶解性，这样当温度升至高于一定的混浊温度(cloud temperature，Tc)(其与聚合物的低临界溶解温度(LCST)相关)时，它们自缔合并开始形成独特的聚合物富集相。普通文献提供了这样的聚合物的几个实例，包括用环氧乙烷(EO)和环氧丙烷(PO)单体基团的混合物形成的共聚物或嵌段共聚物(所谓的EOPO聚合物)，用EO、PO或类似基团修饰的多糖类(例如乙基羟乙基纤维素或EHEC)，或者采用N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAM)形成的聚合物。然而对于PEG(聚合的EO)在稀释缓冲溶液中的Tc为约100℃，并且因此不适合于大部分生物技术应用，对于EOPO和NIPAAM聚合物的Tc通常在更加生物技术有用的20-40℃范围内，其取决于溶液盐组成及其它因素。除了热致感应型聚合物(thermoresponsive polymer)以外，一些亲水性聚合物呈现pH依赖型自缔合(例如WO 2004/082801 A1)。WO 2004/020629(Tjerneld)涉及使用EOPO聚合物的反向热溶解性以进一步促进分离已经在二聚合物相系统中分配的质粒。在室温下，由EOPO和葡聚糖聚合物形成的二聚合物两相系统以与PEG和葡聚糖系统相同的方式形成。将不太稠密的EOPO富集上相与EOPO和葡聚糖水性聚合物两相系统分离。然后将EOPO富集相的温度升至约37℃(即高于Tc)以致于该上相经进一步相分离为水富集相和自缔合EOPO聚合物富集相。有利地，该水富集相应包含所要求的目标物。通常，这些种类的EOPO和葡聚糖系统就相聚合物组分回收和有效二步分配分离过程的设计而论提供有利条件。然而，缺点也为与采用生物起源且昂贵的葡聚糖聚合物的系统配方有关的成本费用。不太昂贵的聚合物例如淀粉聚合物可在这样的系统中替代葡聚糖(Persson等，2005)，但是仍然存在与必须加入然后从过程流除去两种聚合物相关的挑战。
在以上文献实例中，如同在普通文献中一样，相系统用于从澄清的进料纯化目标物，该澄清的进料通过使包含完整的或裂解的细胞和细胞碎片的相发酵液经离心形成。
在生物技术领域，用两种聚合物或在大量加入的盐的存在下用一种聚合物形成的水性聚合物两相系统引起广泛关注。这是因为它们在小及更大规模的分离中易于利用，而没有在按比例放大至更大体积时丧失有效性或引人注目地改变成本。而且，任何标准分离方法如基于电荷、基于疏水性、基于亲和性或基于尺寸的分离可在聚合物两相系统中进行。通常许多不想要的组分如细胞碎片、内毒素、核酸、病毒将趋向于可观地分配至PEG和葡聚糖或者PEG和盐两相系统中的下(分别为葡聚糖富集或盐富集的)相。因此，如果系统可发现提供良好的目标物分配至上(PEG富集的)相，可得到有效的初步分离和目标物浓缩。仍然存在四个主要障碍，涉及容量(即溶解性)、相组分成本、相组分去除和相组分对其它(下游)单元操作和设备的影响。后者尤其限制在现行标准工艺中容易地并入一些相系统作为上游单元操作。
在克服与标准色谱和/或过滤处理中界面连接有关的缺点和克服每个单元操作的单一理论分配步骤限制的努力中，液-液分配两相系统(如PEG-葡聚糖或PEG-盐)已经适合于通过将一相固定在能够优先润湿该相的色谱载体或其它固体载体上的色谱用途。然后将互补相泵送通过在流动与固定相之间提供反复平衡机会的柱子。这于20世纪80年代由在E.Merck，Darmstadt的W.Müller等(US4756834)进行了商业利用。
以上方法与其它成相聚合物的各种组合是可能的。US 5093254(Giuliano等)涉及水性两相蛋白质分配系统，其采用了聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为上相和麦芽糊精作为下相，并提供用于蛋白质分配的低成本系统。该系统也可采用氯三嗪染料的某些衍生物，其以非共价方式结合于PVP并用作待分离蛋白质的配体。已指出该系统的优势是它的成本效率，因为该染料可容易地结合于聚合物相而不必实施对于在先技术的PEG和羟丙基淀粉系统中形成共价键必需的色谱和溶剂提取。
许多现代生物制药基于单克隆抗体(通常为IgG形式)或相关抗体片段(Fab)或抗体的衍生物。如果计入在葡聚糖与PEG和相关的二聚合物双相系统中的血浆蛋白分配的研究，采用相系统用于纯化抗体已经研究了超过30年。针对通过分配的大规模抗体处理的可行性，采用更节省成本的PEG-盐及其它系统的研究，在文献中已经有了十年以上。
B.A.Andrews，S.Nielsen和J.A.Asenjo(Partitioning andpurification of monoclonal antibodies in aqueous two-phase systems(单克隆抗体在水性两相系统中的分配和纯化)，Bioseparation 6，(1996)306-313)研究了系统，并采用因子设计以发现一些他们认为对于抗体分配最佳的系统，如7％w/w PEG 1450、14％Na磷酸盐和12％NaCl。这样的系统给出为100的抗体分配K(上相与下相蛋白质浓度的比率)值。他们采用血清白蛋白、转铁蛋白及一些其它蛋白代表过程原料流杂质，并且证实了对抗体所示分配而言的差别性分配。另外，他们尝试了来自杂交瘤细胞培养物的单克隆抗体样品的小规模处理。正如Persson等2005和Azevedo等，2007那样，他们用离心澄清的(无细胞)样品溶液操作。在用杂交瘤产生的抗体样品的试验中，他们注意到用纯蛋白质样品得到的K值看来受到样品溶液复杂性的损害。然而，它们能够获得抗体于一相中的良好分配，并且显示采用多次提取(包括其中采用含有较低NaCl的系统将目标分子分配到互补相中的那些提取)提高纯度的能力。
Andrews等也注意到PEG盐系统通常对于蛋白质分配并且尤其是抗体分配仍保留的主要缺点，其(由于高盐浓度)为低蛋白质溶解性(通常为1g/L)。如果人们认为抗体和其它重组蛋白质可以10g/L或更高的水平表达，在分离过程早期采用这样的系统将带来过程体积的10倍增加，伴随处理规模、成本和时间的数倍增加。除了这些以外的成本将为与盐组分相关的那些成本，包括盐去除和泵及其它金属设备的可能腐蚀。十年后，Azevedo等(Ana M.Azevedo，Paula A.J.Rosa，I.Filipa Ferreira，M.Raquel Aires-Barros，Optimisation of aqueoustwo-phase extraction of human antibodies(人抗体的水性两相提取的最优化)，Journal of Biotechnology 132(2007)209-217)竭尽努力以发现适合于抗体的工业规模处理的PEG和盐系统。他们的最佳化方法发现了与Andrews等的那些方法相似的系统(即12％PEG 6000，10％Na磷酸盐pH 6，15％NaCl)，其当用于从浓缩的(并且澄清的)中国仓鼠卵巢(Chinese Hampster Ovary，CHO)细胞培养物上清液部分纯化Mab时总收率为88％，并且从杂交瘤培养物上清液部分纯化Mab时总收率为90％。然而，它们的目标蛋白质浓度仍然为约1g/L。
最近，Aires-Barros等(I.Filipa Ferreira，Ana M.Azevedo，Paula A.J.Rosa，M.Raquel Aires-Barros，Purification of human immunoglobulin Gby thermoseparating aqueous two-phase systems(通过热分离水性两相系统纯化人免疫球蛋白)，Journal of Chromatography A，1195(2008)94-100)已经研究了用于在包含MW 2000-5100的UCON
EOPO50/50共聚物(Dow Chemical)的系统中分配抗体的二聚合物热分离相系统。他们研究了将来自澄清的CHO培养物上清液的IgG(Ab为0.1g/L)在8％w/w UCON和5％葡聚糖T500系统的相间的分配，并且为了增强抗体分配进入上(EOPO聚合物富集的)相他们加入20％w/w三乙二醇-二戊二酸(TEG-COOH)和10mM Na磷酸盐pH 8。澄清的上清液可以50％加入到系统中(以达到以上最终聚合物和TEG-COOH浓度)。在一些实验中，加入多克隆IgG(GammanormTM，Octapharma AG)以增加目标蛋白质至约1g/L。两步(二聚合物两相分配，随后将上相热分离为聚合物富集和水富集相，参见以上)分配方法得到85％的抗体(其对于商业上有吸引力的方法是相对低的)，抗体纯度88％(其可能已经通过加入GammaNorm得到帮助)。Tc存在于约50℃，其要求在第二步提取中对相系统施加热。尽管这些系统提供较低盐浓度，但是它们也需要显著的TEG-COOH，因为在其不存在时，IgG在顶部UCON富集相(UCON和葡聚糖相系统的)的回收产量为低于50％(即K＜1)。
通常，热分离相已经正常地与葡聚糖(参见Aires-Barros等，以上)或类似多糖(Persson等，以上)一起用于两步方法中。因此，对于目标和杂质蛋白质(以及第二种聚合物)的选择性存在于第一个分配步骤，随后使用温度诱导的相分离(通常为EOPO聚合物富集相的)来分离目标物和聚合物为漂浮在自缔合聚合物富集的稠密相顶部的含目标物的水相。至于独立地采用热分离相(即一种聚合物但是较低盐浓度)系统，一般性常识为它们常常无用，因为它们不提供什么选择性，并且应该用于含有其它聚合物的系统。一个著名的国际研究小组推断出“水EOPO系统因此仅适合于分配疏水分子(如变性蛋白质或富含色氨酸的肽)或适合于通过选择性去除水的溶液浓缩物(类似的论点适用于胶束两相系统)”(Hans-Olof Johansson，GunnarFolkeTjerneld，Charles A.Haynes，J.Chromatography B，711(1998)3-17)。关于这样的应用，各种盐及其它添加剂对另一种EOPO聚合物(Breox 50A 1000，一种由50％环氧乙烷和50％环氧丙烷组成的无规共聚物，分子量数量平均3900，Specialty Chemicals，Southhampton，UK)相分离的影响由Cunha等(Maria Teresa Cunha，Folke Tjerneld，Joaquim M.S.Cabral，Maria Raquel Aires-Barros，Journal of Chromatography B，711(1998)53-60)进行了研究。
Teixeira等(Martinha Pereira，You-Ting Wu，Armando Venancio，JoséTeixeira，Biochemical Engineering Journal 15(2003)131-138)研究了内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)在由二聚合物系统中的UCON50-HB与聚乙烯醇或羟丙基淀粉或与相对高浓度的硫酸铵组成的系统中的分配。后一系统需要加热以实现两相的形成，但是从试剂成本和要预先加入到培养基(再次澄清)上清液以使最终系统的70％由澄清的培养液组成的试剂能力方面来说为最有前途的。UCON聚合物可以三步骤过程再循环，该过程中endo-PEG被浓缩10倍并且95％的酶活性得到回收。关于该项工作，两项观察结果值得注意。首先，对于实现两相形成必需的5％最小铵盐浓度(50g/L或约0.38M)仍然重要并且需要10％UCON。升高温度至40℃仅降低这些值至3％(0.23M)盐和5％聚合物。所以系统仍包含显著的加入的盐。第二，在高于30度的温度下，Texeira等注意到在他们的系统中的相反转(phase inversion)，使得顶部、贫聚合物的、不太稠密的相在室温下变为下相。这样的作用尽管令人关注，但是对于大规模处理，尤其是在包含常常沉降的细胞和细胞碎片的系统中可造成问题。除了以上指出的热分离相系统以外，存在广泛范围的包含疏水改性EOPO和类似聚合物的热分离胶束(micellular)系统(对于讨论参见以上H.-O.Johansson等，1998)。涉及以上二聚合物热分离水相系统的许多专利目前由G.E.Healthcare，General Electric公司持有。
PEG和盐两相系统分配细胞和细胞碎片至界面并因此能够采用相分配以达到部分澄清的能力已经公知了一段时间。
等直接在生物反应器中形成了7.5％w/w PEG 1500和14％磷酸钾两相系统并采用它们纯化大肠杆菌中的重组蛋白质(Kristina
Nilsson，Andres Veide，Recovery of extracellular human insulin-like growthfactor-I and II as a fusion protein from Escherichia coli culture broth byaqueous two-phase extraction(通过水性两相提取从大肠杆菌培养液回收细胞外人胰岛素样生长因子-I和II作为融合蛋白)，Bioseparation，3(1992-1993)241-250)，注意到约90％的细胞不在含目标物的相中。然而，间歇式离心仍然用于该方法中以实现完全相分离，并提倡以连续离心模式用于较大规模的应用。这样的聚合物-高盐系统具有比在低盐浓度下形成的聚合物-聚合物系统大得多的界面张力，并由于其相对高的界面张力可预计作用达到一定澄清。然而，从容量(目标物溶解性)来说由于所需要的高盐浓度它们大概仍然将受到限制。
等注意到加入到系统中的生物质影响了一些分配结果。因为涉及寻找用于重组蛋白质(尤其是抗体)处理的最佳化系统的大多数研究已经采用澄清的进料完成，找到的系统可能不是最佳的或者甚至对于澄清的进料作用。这是为什么在本工作中使用了几个非澄清进料的实例。
从以上讨论可见，两相分配具有象各种物质如包括来自复杂原料流的生物制药的蛋白质的初步处理(澄清和目标物部分纯化)方法一样多的前途，然而到目前为止某些挑战还未被克服。这些挑战包括试剂(聚合物和盐，或者两种聚合物)成本、与含目标物的过程流需要的稀释相关的容量问题、加入各种亲和性物质(例如TEG-COOH)以增加目标物分配的可能需要、在进一步的下游处理步骤之前或期间去除相系统形成物质，以及改进含目标物的相以使得进一步的下游处理能够进行。从简明易懂的观点来看，热致感应型聚合物和水系统(其不包括胶束形成或使用特殊的疏水改性热致感应型聚合物)可为最引人注目的，因为它们通常为中性并且在一些情况中为生物相容的。所以在含目标物的相中残余的聚乙氧基及其它聚合物可不仅仅视为相对惰性物质。它们可对以下处理提供一些益处：a.通过多步骤分配进一步处理，b.含目标物溶液的喷雾干燥(例如Jessica Elversson，AnnaMillqvist-Fureby，Aqueous two-phase systems as a formulation conceptfor spray-dried protein(对于喷雾干燥的蛋白质作为规化概念的水性两相系统)，International Journal of Pharmaceutics 294(2005)73-87)和，由于它们公知的防冻和抗氧化性能，c.含目标物的相溶液在进一步处理之前的低温中间存储。然而已经证实的常识和经验为，它们的形成需要相对高的聚合物和盐浓度，并且所形成的相不提供多少选择性，需要相当高的盐浓度并且可能无法实现澄清。
许多年以来，生物制药发酵、纯化和精加工/配制已被视为分别的处理领域。对此的主要原因是它们通常包含不同的单元操作和体积规模。这两者都与目标物质的浓度相关，并与在不同处理阶段中处理的过程体积逆相关。因此可能以1mg/mL发酵，经亲和性或离子交换的纯化将浓度升至大概30mg/mL，伴随精加工随后进行配制步骤，令目标物获得为100的液体(mg/mL)或固体(mg/g)形式。由此初始的处理步骤可能包括为配制步骤100X大的处理过程体积。这些特性现在变得模糊，抗体与其它生物制药在发酵进料中可达到30mg/mL，并且早期离子交换或其它纯化步骤达到100mg/mL。配制通常包括将蛋白质或其它生物制药与赋形剂如聚合物混合，这些聚合物包括DextransTM、聚乙二醇或PolysorbatesTM(聚乙氧基化的脱水山梨糖醇和月桂酸酯)及各种市售可得到的氧化乙烯或氧化丙烯的共聚物或嵌段共聚物如TergitolsTM或PluronicsTM。赋形剂可被荷电包括使用其它蛋白质(即荷电的两亲生物聚合物)如白蛋白。赋形剂在储存期间稳定生物制药，保持高浓度而不引起凝聚，并且使其能够在体内快速溶解和吸收。一些聚合物或其它赋形剂也可不仅增强药物递送而且可经例如辅药作用增强药物的药理作用。考虑到以上情况，自然的是，用生物相容的聚合物使溶液中的抗体或其它目标蛋白质或不溶性复合物固定化的任何分配、沉淀或其它单元操作方法，将不仅在生物制药的纯化方面而且在配制、储存、递送和功效方面具有重要性。尤其是作为聚合物(如以上指出的那些聚合物)通常存在于抗体及其它药理学配方中。一个关键点是任何一种商业可行方法必须能够处理包含相对高浓度(例如＞10g/L)的蛋白质或其它目标物的复杂进料，并且处理它们而没有显著的(即＞2X)稀释。以上考虑因素不仅适用于重组蛋白质、核酸及其它生物制药，而且适用于疫苗及其它生物治疗药物和生物颗粒。
疫苗，并且尤其是病毒疫苗引起一组令人关注的处理挑战，这通过流行性感冒疫苗的处理举例说明。许多流感疫苗在鸡蛋中制造。这提供了从病毒目标物除去卵白蛋白及其它杂质的令人关注的挑战。这通常经蔗糖密度梯度离心法完成。然而现代处理将越来越过多地转向在细胞(通常为MDCK或Vero肾脏细胞系)中处理病毒疫苗，这些细胞在悬浮培养物中或附着于培养物(其中细胞附着于胶质载体生长)生长。在两种情况中，所培养的细胞都感染病毒，该病毒增殖至细胞自然裂解或易于经各种化学或物理处理裂解的点。这两种情况中，最终结果均为包含各种较大(＞1微米)颗粒、细胞碎片、完整病毒(其为欲纯化的目标物)和病毒相关碎片如包含病毒蛋白的细胞膜碎片的复杂进料。在采用离心或其它方法除去细胞及相关碎片后，可使用蔗糖密度梯度将病毒相关部分分离成为完整的和碎片部分。这样的方法当然是数十年的老技术并且已经试图使用更新的分离方法如水性聚合物两相分配或柱色谱法。在超过十年前进行了包括病毒分配的大多数工作并且已经由Lena Hammar进行了综述(Lena Hammar，Concentration ofBiomaterials：Virus Concentration and Viral Protein Isolation(生物材料的浓缩：病毒浓缩和病毒蛋白分离)，第62章，第627-658页，在Methods in Enzymology(酶学中的方法)，第228卷，水性两相系统(Aqueous Two-Phase Systems)，H.Walter和G.Johansson编辑，Academic Press，纽约，1994中)，其中她指出“当包括从大体积纯化病毒和处理不稳定病毒时，水性聚合物系统中的提取保持引人注意的选择权”。Hammar和相关参考文献提供了分配广泛种类的不同医学重要性的病毒的许多实例。病毒的不稳定性质通常要求采用二聚合物(通常为PEG和葡聚糖)相系统，其比单一聚合物和高盐(例如PEG和磷酸钠)系统提供更低的界面张力。自然地，采用这样系统的病毒分馏遭受许多与通过分配处理抗体或其它大分子目标物相关的相同困难。这包括两种聚合物和向方法加入个别的分配步骤的成本。在离心澄清随后蔗糖密度梯度分馏之后，一些病毒产品的疫苗处理回收率可低至20％。在替代澄清和密度梯度步骤之一或二者的同时提供一样好或更好的回收率的廉价分配系统是合乎需要的，尤其是如果它可以一次性袋形式而不是在固定线离心机中实施。病毒疫苗分配处理的商业可行性也必须依赖提供优秀选择性的新型廉价系统。在本申请中达到了这样的目的。
发明简述
本发明涉及从液体富集一种目标化合物的方法，该方法包括通过在两个水相之间差别性分配进行的至少一个分离步骤。在本发明中，通过在热和其它条件下向水性生物制品溶液(如发酵样品或生物分离过程流)中加入单一类型的感应型自缔合(即混浊)亲水性聚合物和任选地加入一些另外的盐形成这些相，其中溶液分离为一聚合物、两相系统，伴随一相富集该聚合物。目标化合物存在于不富集聚合物的相中，而不定百分比但大量的包括细胞或细胞碎片的杂质差别性分配至相界面或聚合物富集相。同样，该方法可对发酵液或其它复杂的含生物质的溶液实施，以允许通过进一步标准分离操作(如色谱法)直接进一步处理含目标物的相的方式，得到显著程度的澄清和纯化。
发明者已经发现其中市售热致感应型聚合物(如Breox)可直接加入到含有少量(0.1M或更少的Na磷酸盐)加入盐的未澄清的发酵液中，并且在生物反应器培养温度下，实现由自缔合聚合物富集相和含目标物的水相组成的两相系统的形成的情况。几种目标蛋白质(如在未澄清CHO进料(培养液)中的抗体、在大肠杆菌培养液中的绿色荧光蛋白，或抗体片段)已经显示几乎完全回收到不含细胞碎片的上相中。宿主细胞蛋白、核酸颗粒杂质不同程度分配至聚合物富集相或相界面。由于其相对低的盐浓度，含目标物的相然后可直接用于常用的下游处理步骤如过滤或色谱法中，其中残余的聚合物不会对目标物纯化呈现负面影响，并且以不需要增加或显著改变单元操作的方式与目标物分离。
该系统在处理其中目标蛋白质超过10g/L的含浓缩细胞的溶液是成功的。该分配步骤可在一次性或固定的生物反应器或其它容器中和以毫升-数千公升的规模进行，并成本有利地实现初步澄清、初步的目标物纯化和若干过程体积减少。它经得起用多次提取形式再循环或使用聚合物的检验。它适合用于广泛种类的复杂生物制品溶液如培养液或者甚至奶或血浆；以及用于高通量工艺开发或分析、各种试剂盒形式及各种目标物。在由培养的真核细胞的流行性感冒病毒疫苗的制造中，该系统可在允许回收具有商业利益的病毒部分的条件下实现细胞碎片的澄清和蛋白质分配。因此该系统也可用于处理大量的病毒及其它胶状和纳米-微米级颗粒。
附图简述
图1.涉及在具有和不具有如本发明的分配步骤的方法中纯化单克隆抗体或类似重组蛋白质的简化工艺流程图。
图2.展示按照本发明的分配步骤可如何减少各种重组发酵进料中的非目标蛋白质的SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶。A.MW标准，B.粗制Mab进料1，C.含有Mab进料1的0.2M NaP系统上相，D.粗制Mab进料2，E.含有Mab进料2的上相0.2M NaP系统，F.含有Mab进料2的上相0.1M Na柠檬酸系统。泳道B-F的主要条带涉及单克隆抗体。
图3.展示按照本发明的分配步骤可如何减少重组单克隆抗体(Mab)发酵物(进料2)中非目标蛋白质和上相中的Mab可如何直接载荷到亲和性(MabSelectSure)柱的非还原SDS聚丙烯酰胺电泳凝胶(凝胶梯度8-25％)。
图4.含Mab的相直接施用至基于蛋白质A的MabSelectTM Sure亲和柱。然后也运行粗制进料样品作为对照。注意尽管粗制进料可被置于基于蛋白质A的亲和柱上，但是通常不这样做，因为它导致柱子堵塞。
图5.首先用按照本发明的一聚合物热分离水相系统处理的Mab的CaptoTM MMC多模式色谱(multimodal chromatography)。A.流通(flow through)，B.洗脱物，C.CIP。
图6.对来自图5中亲和色谱的洗脱和其它馏分在Superdex上的尺寸排阻色谱分析。不同曲线对应于表示流通、洗脱物和就地清洗(CIP)的图5的峰A、B和C。也包括进料。从左至右的峰代表MW渐减的蛋白质。进料和洗脱物含有明显抗体的仅有样品。
图7.显示从表9中系统4的水富集上相MabSelect Sure亲和捕获mAb的色谱图。洗脱物峰被自动积分。柱为在标准条件下运行的标准HiTrapTM 5ml床体积柱。
图8.显示存在由较小峰表示的单克隆抗体(Mab)的进料中Mab浓度的MabSelect Sure亲和色谱分析。第二个A215nm峰为Mab。在正常MabSelect操作条件下使用标准1ml HiTrap柱。
图9.由系统3上相举例说明的(表9和10)(与图8比较)在典型的水富集相中基于MabSelect柱的mAb浓度分析。第二个A215nm峰为含mAb的洗脱物。在正常MabSelect操作条件下使用标准1ml HiTrap柱。
图10.显示在MabSelect Sure上分配和亲和性纯化后以浓缩和表观固有形式存在的Mab的基于MabSelect亲和柱的分析，其由样品系统3上相举例说明(参见表9和10)。对于该分析，在正常MabSelect操作条件下使用标准1ml HiTrap柱。
图11.通过直接向包含细胞发酵培养基的WaveTM袋加入成相聚合物和盐于40℃下形成两相系统。在该实例中，将袋置于长轴垂直位置以助于目测，并由此床高度可模拟在较大体积条件下得到的床高度。可见白细胞层自发地集中于相界面。
图12.通过插入WaveTM袋的管分离含Mab目标物的上相，在该实例中该袋为垂直的长轴位置。当袋在长轴垂直位置时通过在袋右下角的管收集下相。
图13.在重复试验中作为所加入聚合物浓度的函数的病毒和各种杂质的回收率。
发明详述
本发明涉及水性聚合物两相系统用于分离生物分子或目标化合物的有利用途，该目标化合物意指化合物以及分子和细胞，即期望从液体分离的任何实体。
因此，本发明涉及从液体分离一种或更多种生物分子或目标化合物的方法，其包括在容器中混合亲水性聚醚、至少一种盐及包含该至少一种生物分子或目标化合物的液体；温和搅拌所得到的液体混合物直到形成至少两相；和，任选地从其中一相回收所期望的生物分子或目标化合物。
用于本发明中使用的液体混合物和多相系统的聚合物为水性的，意为它们在与水混合时形成水相。另外，如技术人员理解的那样，在本文上下文中，术语液体“混合物”仅指本文定义的组分的组合。在该条件下，可从相图推论这样的液体混合物作为一、二或更多相存在。本发明液体混合物的一个有利条件是，由于在含目标物的相中具有很低(通常为＜3％w/w)的聚合物浓度，它们使得这些相看来，比许多通常研究的聚合物-盐或二聚合物相系统更不粘稠、视觉上更加澄明和更易于进一步处理。
在一个有利的实施方案中，亲水性聚醚为包含环氧乙烷单元的合成聚合物。在一个有利的实施方案中，环氧乙烷聚合物选自包括聚乙二醇(PEG)的水溶性聚醚；以无规共聚物形式(例如Breox或UCON聚合物)或嵌段聚合物(例如Pluronic
聚合物)存在的环氧乙烷环氧丙烷(EOPO)、含有乙氧基的多糖和异丙基丙烯酰胺改性聚合物。如同本领域技术人员将认识到的那样，这些聚合物可包括各种改性形式如PEG的单甲氧基形式。在一个有利的实施方案中，亲水性聚醚为EOPO。如同技术人员已知的那样，EOPO在高于其混浊温度(Tc)时分离为两相并因此看作是热分离聚合物。
在一个实施方案中，亲水性聚醚的分子量在900-100000Da、如1000-20000Da的范围内。在一个实施方案中，分子量在其热致感应型聚合物可市售得到的400-1000000Da的大范围内。
由于用作表面活性剂及其它应用，关于热致感应型聚合物的相分离所知甚多。因此，基于相图数据和任选的非常简单的常规实验，技术人员可容易地判断由本发明液体混合物形成多相系统(如两相系统)的适当条件如pH和温度。在一个实施方案中，本发明液体混合物的pH值接近于中性。温度可在4-50℃范围内，如室温-约40℃，用于形成适合于生物处理的两相系统。注意到一些热分离聚合物如聚乙二醇具有接近于100℃的Tc值。
如同技术人员应理解的那样，选择本发明的合成聚醚以在足够的盐(通常为200mM)存在下能够形成水性两相系统。如果含目标物的溶液如培养液包含盐如0.15M NaCl，其可能仅需要加入50-100mM Na磷酸盐或其它盐。以类似的方式，如果含目标物的溶液如培养液已经在Tc或高于Tc(例如37℃)，实现相分离可能几乎不需要或不需要加热。从本发明液体混合物形成的两相系统可包含其它的荷电和非荷电基团包括结合亲和性配体的聚合物。
该新型一聚合物两相系统与典型的聚合物-聚合物和聚合物-盐两相系统相比较的一些优势显示在表1中。
在本系统的一个具体实施方案中，总的盐浓度在1-500mM范围内，如在100-300mM范围内。如同技术人员应理解的那样，形成两相系统所需要盐的量将受到聚合物MW、浓度和物理状态的影响。
在一个有利的实施方案中，盐选自NaCl、Na2PO4、KPO4、NaSO4、柠檬酸钾、(NH4)2SO4、柠檬酸钠、乙酸钠及其组合。也可使用其它的盐例如乙酸铵。
本发明液体混合物的总聚合物浓度可对于每一种设想的用途最佳化。例如，公知蛋白质及其它大分子可通过加入相对大量的水溶性聚合物从溶液中沉淀出来。因此，如果本发明的系统用于蛋白质分离，太高的总聚合物浓度将无法具有达到有成本效益的分离的足够的蛋白质溶解性。因此，在对于分离生物分子和/或颗粒为有利的本发明液体混合物的一个实施方案中，总聚合物含量构成总系统的约4-20％(w/w)，但是在相分离之后，一个相中的聚合物浓度通常可仅为1-3％w/w，聚合物的大部分在聚合物富集相中自缔合。
表1：典型二组分和新型一组分聚合物水相系统分配作为单元操作的主要操作属性比较
+＝是，-＝否，和？＝可能，HTPD＝高通量方法开发，CHO＝中国仓鼠卵巢细胞，HCP＝宿主细胞蛋白质，KL＝1000升
相系统本身可根据它们的用途和需要复合和混合。所述相和相混合物相对低的粘度与界面张力意指可以多种标准方法如通过磁力搅拌棒搅拌、一次性(WAVETM)生物反应器袋来回摇摆或固定式反应器中的标准机械搅拌桨实现混合。
在一个实施方案中，相系统包含聚乙二醇(PEG)聚合物改性的亲和性配体。这样的聚合物作为EOPO自缔合物被排除于EOPO聚合物富集相以外。这样的PEG-亲和性配体可用于增强目标物转移至贫聚合物相。存在许多已知的PEG-亲和性配体包括一些其为市售PEG-脂肪酰基表面活性剂(如Brij和Mrij
系列的那些表面活性剂)的疏水性配体。在一个具体实施方案中，多相系统包含一种或更多种色谱配体。这样的色谱配体可用作应用本发明液体混合物分离生物分子或化合物时的手段，在该情况中配体可结合特定目标化合物分配所述目标化合物至受益于配体的相中。在一个实施方案中，配体为亲和性配体，其能够通过如受体与配体或抗体-抗原之间的“锁/钥”型高度特异性相互作用结合目标分子。示例性的亲和性配体为例如蛋白质A或基于蛋白质A的配体。在一个有利的实施方案中，亲和性配体被改性以便于它们分配至特定的相中。在另一个实施方案中，加入改性的亲和性配体以将相互作用的目标物分配至贫聚合物相中。
在本方法中分离的生物分子或目标化合物可为例如蛋白质、肽、核酸、细胞、病毒或以上任何一种的任何部分、片段或融合产物。因此，在一个实施方案中，目标化合物为抗体如单克隆抗体或其片段或融合产物。示例性的抗体片段为例如Fab片段。在另一个实施方案中，目标化合物为核酸如DNA或RNA，例如质粒、基因组DNA、适体或寡核苷酸。在一个另外的实施方案中，目标化合物为细胞，如真核或原核细胞，例如成体细胞或祖细胞。因此，在本方法的一个实施方案中，生物分子为抗体，优选为单克隆抗体。在另一个实施方案中，目标化合物为Fab片段。
在一个实施方案中，从贫聚合物相分离生物分子或目标化合物。在一个有利的实施方案中，贫聚合物相为至少两相的上相。
在一个方面，本发明为分离一种或更多种生物分子或目标化合物的多步骤方法，其中采用在包含亲水性聚醚和至少一种盐的多相系统的相之间分配进行进料的澄清，该澄清之后进行至少一个捕获步骤例如亲和色谱法。有利地，分配步骤也减少经澄清的目标物富集相中的宿主细胞蛋白质(HCP)及其它杂质水平。进料可为其中已经产生生物分子或目标化合物的任何液体如发酵液或生物流体，包括细菌和真核细胞发酵培养物。如果需要，该方法包括在本发明的两相系统中澄清之前裂解细胞以释放生物分子或目标化合物的步骤。
在一个有利的实施方案中，在进行了发酵的容器中形成水性两相系统，如在发酵容器中形成。
在另一个有利的实施方案中，目标物富集相为贫聚合物相，其优选地为至少两相的上相。在发酵容器或一次性容器中，用除去下相和相界面，剩下可用于进一步处理的含目标物的上相，可更加便利地实现上相的收集。
在另一个实施方案中，在不富集聚合物的相中约1-3％的残余聚合物可对目标蛋白质或其它物质提供一些保护作用。例如溶液中聚醚的防冻和抗氧化作用两者均为公知的。残余聚合物可因此具有作为赋形剂或更好促进被纯化试剂的功效这两种用途。在另一个实施方案中，在含目标物的相中任何残余的聚合物可助于进一步的下游处理例如增强US2007213513(GE Healthcare)的捕获色谱法方面。
因此在一个实施方案中，新型水性两相系统提供了简单和有效的进料澄清以及目标化合物或生物分子的初步浓缩(体积减少)和纯化(非目标物浓度减小)。这可在各种容器(如塑料微量滴定板外加固定式金属或一次性塑料发酵容器)中在宽泛的液体等级范围，毫升(克)-千公升(公吨)实施。我们的结果表明目标物可在仅包含残余的(通常1％)生物相容的聚合物的水相中以很高的水平回收，这样的聚合物不会负面影响以普通方式进行的进一步下游处理或需要显著改变标准单元操作或相关程序。
如上讨论的方法对于以不需要稀释它们并且不需要过度的盐浓度或者在极粘的溶液中得到目标化合物的方式分配目标化合物和生物分子是有效的，这样的方法可容易地与其它从叠层碟式离心(stackeddisk centrifugation)至色谱法和过滤的常用分离步骤顺列连接。因此，包含目标生物分子或化合物的相进一步进行伴随较小改变或没有改变的液相色谱法的至少一个步骤。
在图1中给出了显示新方法可如何使用的一个可能流程。在左边可见可在例如Mab纯化中使用的普通三次色谱步骤分离方法。在发酵以及细胞裂解(如果需要)之后，将发酵进料离心以除去细胞和细胞碎片。然后过滤并在施用至亲和柱之前进行缓冲液变化(buffer change)。然后洗脱和进行低pH病毒灭菌并在另一次缓冲液变化之后进行两次另外的色谱步骤，如离子交换后进行另一次离子交换或疏水作用色谱法。在一些情况中，以上非亲和性步骤中的一个步骤可用混合模式的色谱步骤替代。在右边为本发明一个建议的工作流。可见相系统如何在进料中形成(获得进料盐和温度的双重使用)，快速实现细胞和细胞碎片的初步去除(澄清)，以及各种杂质如非目标宿主细胞蛋白质(HCP)、核酸、内毒素和病毒的一些可能减少(取决于相系统)。含目标物的上相可直接施用至亲和柱，不过使用简单的深层过滤将提高柱寿命。该方法以普通方式继续，除非包括基于分配的纯化步骤上游也可减少其它纯化步骤的数目或者使得这样的步骤能够以流通而不是捕获方式运行。预计过程流中残余的聚醚聚合物不会不利地影响色谱效能(例如US2007213513)。
在一个实施方案中，液相色谱法包括亲和色谱法如结合于蛋白质A配体。蛋白质A色谱法为公知的方法，并且在本文上下文中理解为包括吸附于包含重组或天然蛋白质A、保持其对抗体的选择性的蛋白质A的部分或任何其它改性形式的蛋白质A的任何树脂。市售可得到的蛋白质A树脂包括例如MabSelect系(GE Healthcare)。其它亲和性方法包括固定化金属亲和色谱法(IMAC)。
该色谱步骤之后可进行一个或更多个另外的色谱步骤和任选地进行用于病毒去除的步骤。在一个实施方案中，该色谱法之后进行亲和色谱法、离子交换或疏水作用色谱法(HIC)。阴离子交换剂、阳离子交换剂和HIC树脂为公知和市售可得到的。
在另一个实施方案中，亲和色谱法之后进行多模式离子交换色谱法。多模式离子交换也为公知的，并且使用包含多于一个官能团如接近疏水基团的离子交换基团的配体。示例性的实例为CaptoTM MMC和CaptoTMAdhere(GE Healthcare)。
在另一个实施方案中，初始的亲和色谱步骤可用一个或更多个与离子交换、疏水相互作用或混合模式相互作用相关的目标物尺寸排阻步骤或可能的捕获或流通(色谱或过滤或类似)步骤替代。
基于聚醚聚合物的一聚合物两相系统对于用于涉及Mab、Fab及其它目标物的大规模生物处理操作是理想的。它们消除或减少对于基于离心的澄清的需要。澄清和一些初步的纯化与浓缩可在可直接施用(伴随任选的过滤)至色谱捕获介质的相中起作用。
所述系统对于成本(一种聚合物、低盐)及其它方面(目标物溶解性)提供显著的有利条件，表明其对于代替对于采用离心或其它用于澄清的活动进程的需要插入在发酵与捕获色谱法之间可以是理想的。这样的分配看来大体是合适的并且可处理蛋白质稠密和粘性的进料。当然，该分配方法也可用于在采用基于离心或过滤的澄清的方法中提高目标物回收率。
在另一个方面，本发明为从液体分离至少一种抗体的方法，该方法包括在包含合成的亲水性聚醚和至少一种盐的多相系统中分配的步骤。
在本发明方法的一个有利实施方案中，抗体为单克隆抗体，其从系统的贫聚合物相回收。因此，在一个具体的实施方案中，用于分离抗体如单克隆抗体的多相系统为包含约4-20％EOPO，并存在100-500mM盐的水性聚合物两相系统。
本发明提供了用于从发酵物或包含杂质的其它复杂进料分离抗体如单克隆抗体的有利方法。
在一个实施方案中，本方法包括形成如以上描述的两相系统，随后除去富集热分离聚合物如EOPO的相。
在另一个方面，本发明涉及如以上描述的液体混合物或多相系统在分离至少一种目标化合物如生物分子、细胞或颗粒中的用途。
在另一个方面，分配步骤用于初步澄清和纯化(细分馏)与病毒或其它纳米-微米尺寸颗粒处理相关的进料或其它复杂溶液。
在另一个方面，包括向进料或其它含目标物的溶液中加入一种热分离聚合物的本发明的分配步骤，可被重复以进一步纯化特定目标物。这样的重复分配步骤可在完全相同条件下或在不同条件下起作用。后者可允许连续纯化某些蛋白质或其它馏分。
在另一个方面，本发明涉及其中成相聚合物可以自缔合聚合物富集相的形式回收并再循环的方法。
在又一个方面，本发明为用于分离至少一种目标化合物如单克隆抗体的试剂盒，该试剂盒包含如以上描述的液体混合物或多相系统。在一个有利的实施方案中，本试剂盒包含至少一种聚合物，其为以水溶液或干燥形式存在的合成聚醚。
本发明的其它特征和优势将由以下实施例和权利要求而清楚。
实施例
A.与细胞、抗体及其它大分子相关的实施例
综合实验
1.1材料
化学品
Breox 50A 1000(等于共聚物环氧乙烷
和环氧丙烷(EOPO)) Mw 3900参见以下。
聚氧化乙烯100硬脂酸酯 Mw 5450Sigma，参考P-3690(Polyoxyethylene 100 Stearate)(Myrj59)
Gammanorm(多克隆IgG)(pI约为7) Octapharma Batch C19A8601
牛血清白蛋白(BSA)(约为pI 5.6) Sigma，A7638
肌红蛋白(约为pI 7) Sigma，M1882
用于本研究的所有其它化学品属于分析级并且购自E.Merck，Darmstadt或Sigma Aldrich。
除非指明，EOPO聚合物指Breox 50A 1000，其为由50％环氧乙烷和50％环氧丙烷组成、具有3900道尔顿分子量(数均)的无规共聚物。它对于一些用途得到FDA批准，并且得自International SpecialtyChemicals(Southampton，UK)，该公司目前为cognis(www.cognis.com)的部分。
单克隆抗体和发酵样品
纯化的单克隆抗体(Mab)
采用以下两种专有Mab(Mab 01和Mab 03)。
Mab 01
用蛋白质A和阴离子交换色谱纯化。浓缩10x
在CHO细胞中产生并贮存于甘油磷酸盐pH 7.8和5.2mS/cm。
浓度为4.4mg/ml，MW估计为150kDa，pI估计为9。
Mab 03
用蛋白质A和阴离子交换色谱纯化。浓缩10x
在CHO细胞中产生并贮存于磷酸盐缓冲的生理盐水pH 5.8和16.2mS/cm。
浓度为5.8mg/ml，MW估计为150kDa，pI估计为7。
实际的进料样品
四种“实际的”未过滤、未澄清的Mab发酵进料得自基于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的发酵物。它们包含不同的Mab并且称为进料1、2、3和4。绿色萤光蛋白(GFP)在大肠杆菌中表达。
1.1方法
通过混合适当量/体积的以下列出的储备液，在10ml Sarstedt管中直接制备每个水性两相系统(ATPS)(除非另外指出)。每个系统的最终体积为5ml。将混合物涡旋约30秒并然后于40℃下在水浴中静置约15分钟使之形成相。
储备液：
实施例1：Na磷酸盐浓度和pH对ATPS形成的影响
通过混合适当量/体积的储备液，在10ml Sarstedt管中直接制备基于一种聚合物(EOPO)的水性两相系统(ATPS)。每一系统的最终体积为5ml。将混合物涡旋约30秒并然后在水浴中加热至约40℃持续约15分钟，用于相的形成。
制备基于8％EOPO、150mM NaCl和50-200mM Na磷酸盐缓冲液在pH 4、6、7和8的ATPS。在水浴中于40℃下培育约15分钟后，在所有所研究pH下形成两相系统。
在另一组实验中，使用在pH 7下的不同浓度Na磷酸盐缓冲液制备包含150mM NaCl的8％EOPO的ATPS。
结果表明：
(1)当采用低浓度的Na磷酸盐(20mM)时不形成两相系统。然而，当Na磷酸盐浓度增加至50mM时，形成两相系统。
(2)与来自用100-300mM Na磷酸盐制备的其它系统的体积比为4相比，用50mM Na磷酸盐制备的ATPS得到更高的相体积比(5.25)。
这表明应能够开发基于EOPO的两相系统，其盐浓度足够低，使其张力(同渗浓度)适合于分配活细胞而不使它们裂解。这在以下应用中是重要的，其中：(1)希望主要使用在生长培养基中的等渗缓冲盐由加入的EOPO浓缩物形成两相系统，和(2)澄清包含转运出活细胞的目标蛋白质的酵素并处理细胞而不使它们裂解和释放宿主细胞蛋白(HCP)和(3)情况比如(2)，其中细胞保持连续培养或者以完整形式处理。
因为Ucon
聚合物非常类似于Breox EOPO，它们可代替BreoxEOPO使用(参见以下)，伴随与Tc变化相关的温度的较小改变。现存的许多其它类似聚合物包括Pluronic聚合物。试验了Pluronic L-81(10％EO & 90％PO，Mwt 2700)，并当在水或磷酸盐缓冲液中的聚合物浓度为10-20％时，于室温下成功形成两相系统。这对于在操作者希望将发酵物冷却至室温(例如以阻碍蛋白酶活性)的环境下使用可以是重要的。
实施例2：抗体浓度或者含GFP的经裂解的大肠杆菌细胞浆的使用对ATPS形成和的蛋白质相分配的影响
按照在实施例1中的描述制备基于一种聚合物(EOPO)的ATPS。表2显示在不同条件下的四种系统，其中多克隆IgG Gammanorm或含重组绿色荧光蛋白(GFP)的经裂解的大肠杆菌细胞浆样品被测试。
表2：多克隆血浆IgG和来自大肠杆菌的GFP的相分配
K＝CA280上相/CA280下相。Gnorm＝在165mg/ml下的GammanormIgG浓缩物(Octafarma)，所以25mg与152微升相关。NaP＝pH 7的Na磷酸盐。GFP以裂解的大肠杆菌细胞浆的形式存在。
结果表明：
(1)当采用低浓度的Na磷酸盐(20mM)时，在所研究的条件下不形成两相系统。然而，当Na磷酸盐浓度为200mM时，形成两相系统。
(2)由含有8％-10％w/w EOPO系统的贫聚合物上相中得到来自Gammanorm多克隆人抗体的总吸收的90-100％。
(3)于490nm下测量的所有GFP活性处于系统4的上相。大肠杆菌细胞碎片在单位重力(g)下分配至界面。当在3000xg下将试管离心5分钟时，所有的细胞碎片沉积至该管底部而在所分离的相中没有任何扰动。
研究了EOPO浓度对相体积比的影响和目标物回收率。用5mgGammanorm、5-14％Breox EOPO聚合物和150mM NaCl加上200mMNa磷酸盐缓冲液(pH 7)制备系统，最终体积为5ml。在40℃下，相体积比与EOPO浓度相反地减少，在5％EOPO时比率为11.5和在14％EOPO时体积比为2.33。在相形成之后，分离这些相并在280nm下由分光光度计监测每个相的吸光度。计算上相中每一种蛋白质的分配系数(K)和％浓度(C/o)。所有系统显示高的K值(＞200)和100％目标物回收率。该结果具有实际意义，因为Breox和相关聚合物相对廉价，所以，如果能够达到流体(其中目标蛋白质被回收)体积的显著减少，可准许从6％-12％EOPO系统移除，并且在过程早期达到目标物浓缩。
为了研究蛋白质在基于EOPO的ATP系统中的溶解性，在5mlATPS系统(8％EOPO、200mM Na磷酸盐(pH 7.4)和150mM NaCl)中采用不同量的Gammanorm实施一系列实验。在相形成之后，分离这些相并在280nm下由分光光度计监测每一个相的吸光度。上相中每种蛋白质的分配系数(K)为高的(＞200)。在这些条件下的EOPO系统导致实际上100％Gammanorm回收率。在用20％EOPO系统进行的另一组实验中，在给出＞97％回收率的相同盐条件下，容量达到20g/L。结果表明该EOPO系统具有高容量。这对于PEG/盐(约1g/L)和PEG/葡聚糖(约5g/L)系统两者相比非常有利。
为了通常为有用的，该方法应对细胞培养基起作用。我们研究了是否细胞培养基会在EOPO-ATPS中影响相形成。用8％EOPO、150mM NaCl和200mM Na磷酸盐的5ml ATPS试验细胞培养基(2.6ml)。结果显示对于所有所试验的细胞培养基(Ex-cell CA CHO-3 Sigma126K8042；BD CHO参照220229；Power CHO-1-CP Lonza 070920和CA OPTI CHO参照12681-011-(Invitrogen))形成了两相系统。这是对用大肠杆菌培养液/浆和用向含蛋白质的溶液中直接加入EOPO加上盐进行成功研究的补充。然而为了加速处理，与加入干燥粉末相比，加入浓缩的储备液可能更好(参见以下)。
实施例3：基于柠檬酸盐的EOPO一聚合物ATPS
磷酸盐适合于含有Breox聚合物的相系统形成，部分地因为它们以相对低的盐浓度(例如一些PEG和盐两相系统的十分之一)形成系统，并且也因为所形成的系统看来提供良好的目标蛋白质回收率和一些对非目标蛋白质的选择性。然而，磷酸盐购买昂贵并且处理也昂贵。相比之下柠檬酸盐不太昂贵并且更加生态友好。这里在新系统的制备中试验了Na柠檬酸盐缓冲液。如在表3中显示的，使用在不同温度下不同浓度的Na柠檬酸盐缓冲液(pH 7.0)制备包含8％EOPO和150mM NaCl的系统。
结果显示：
·在约40℃的温度下，用50-200mM的Na柠檬酸盐浓度可形成两相系统。
·在室温下，用高于250mM的Na柠檬酸盐浓度可形成两相系统，但是伴随相序反向的相反转(聚合物相将处于上相并且水相处于底部)。在这样的系统中水相IgG的回收率为约96％。
·与在40℃和较低Na柠檬酸盐浓度下制备的系统相比较，在室温下用高于250mM的Na柠檬酸盐浓度制备的系统得到较低的相比率。
这证明采用Na柠檬酸盐作为主要盐之一可产生合适的EOPO系统-尽管可加入一些磷酸盐以增强较高的pH下的缓冲能力。所提到的相反转先前已经被报导(M.Pereira等.Biochemical Engineering Journal15(2003)131-138.)，其中作者观看到经离心的发酵样品上清液中多半乳糖醛酸酶(非Mab)在30和40℃下用Ucon-(NH4)2SO4系统的分配。
表3：在不同的盐浓度和温度下基于柠檬酸盐的EOPO ATPS形成
*IgG回收率作为C/Co x 100％计算
于40℃和室温下采用100-250mM Na柠檬酸盐缓冲液，估算在基于柠檬酸盐的EOPO ATP系统中NaCl浓度对相形成的影响。结果显示，当采用100-200mM Na柠檬酸盐缓冲液时，于40℃下NaCl对相形成没有什么影响。然而，当采用250mM Na柠檬酸盐缓冲液时，对于室温下相形成需要至少150mM NaCl的浓度。在基于8％EOPO的系统中用两种不同的未澄清Mab实际过程进料(2和3)试验pH变化的影响。来自上相的部分经蛋白质A色谱分析法分析Mab含量，表明采用100mM Na柠檬酸盐和150mM NaCl在pH 7-8下Mab回收率大于98％。自然地，其它盐的存在可影响以上结果。
实施例4：在EOPO ATPS中的HCP分配
pH和疏水亲和性配体的影响：
在这些试验中，在8％EOPO、150mM NaCl和200mM Na磷酸盐，pH 6和8或pH 8并包含8μM Myrj 59表面活性剂(被加入以担当PEG-烷基疏水亲和性配体)的5ml系统中分配粗制Mab进料1。在40℃下水浴中培育约15分钟后，分离这些相并分析HCP的含量(表4)。结果表明，用更高pH(pH 8)下的缓冲液可得到更好的HCP减少。
表4：作为pH和Myrj 59的函数的HCP减少
在该研究中，从pH 6至8存在HCP上相分配的显著减少(即在下相分配中增加)-根据HCP浓度。疏水亲和性配体在pH 8仅具有小的影响，其可能是由于所分析的HCP实体为相对非疏水性蛋白质。
pH对基于Na柠檬酸盐的EOPO ATPS中HCP分配的影响：
对粗制进料和经ATPS处理的Mab进料测量HCP数据。结果(参见表5)表明：
·发生13-23％的HCP减少。
·HCP减少随着缓冲液的pH增加而增加。
·HCP减少随着聚合物浓度的增加而增加。
这些结果与以下观念一致：在疏水性和碱性蛋白质(如许多抗体)偏向于贫聚合物相、同时HCP混合物的一些组分(其通常包含几种不同的酸性和荷负电蛋白质)较大程度地分配至聚合物富集相方面，该系统表现得象许多其它系统。蛋白质分子量(和疏水性)也可能发挥作用。
表5：作为pH和聚合物浓度的函数的HCP减少
*由市售ELISA试验对照标准曲线测定的HCP。
实施例5：来自粗制进料的Mab的浓缩
从0.8g的100％EOPO聚合物、固体磷酸盐(87mg NaH2PO4、245mg Na2HPO4)和9.2ml的Mab进料2制备基于8％EOPO和200mM Na磷酸盐缓冲液、pH 7.4的约10ml ATPS。在混合并于40℃下在水浴中培育约15分钟后，形成了两相系统。这些相的总体积为9.5ml，由7.7ml水富集上相和1.8ml聚合物富集下相组成-得到相体积比为4.27。该体积比低于采用40％EOPO溶液和0.8M Na磷酸盐缓冲液制备的系统的体积比，后者的体积比为5.25。因此，Mab进料可通过由浓缩EOPO聚合物和固体磷酸盐制备的ATPS浓缩16％。
早先的结果表明相体积比与EOPO聚合物浓度相反变化。指出了从8％至12％Breox浓度的改变可减少含目标物的相体积而不影响回收率。我们采用Mab进料2研究了在具有不同盐类型(磷酸盐和柠檬酸盐)和盐浓度的12％EOPO聚合物的ATPS中Mab的回收率。采用蛋白质A色谱分析法分析测量了水富集相中的Mab回收率。结果显示：
·当系统包含100mM Na柠檬酸盐和150mM NaCl时，在7-8的pH范围下，对于两种Mab进料样品回收率均为约100％。
·与基于8％EOPO(4.0-4.1ml)的系统相比较，得到较小体积的水相(3.5-3.6ml)。这意指当增加EOPO浓度时，可得到更高的Mab浓度。
我们也在20％EOPO的聚合物浓度下试验了不同的盐条件。结果显示，采用100mM Na磷酸盐伴随采用或不采用150mM NaCl，含Mab的水相可被分别浓缩19和28％。
实施例6：采用磷酸盐和柠檬酸盐缓冲系统从粗制进料纯化Mab
在该组实验中，制备基于8％EOPO、150mM NaCl和不同浓度Na磷酸盐或Na柠檬酸盐缓冲液(并包含2.6ml的粗制Mab进料1或2)的10ml EOPO-ATPS。将250mM Na柠檬酸盐相反转系统保持在室温下。其它系统于40℃下在水浴中培育约15分钟，以使得这些相能够分离。经SDS page电泳(凝胶梯度为8-25％)分析来自一些系统的相的纯度(图2)。在ATPS实验后对于粗制和经回收的Mab的HCP数据呈现于表6中。从所得到的结果可作出结论：
·对于Na磷酸盐或Na柠檬酸盐缓冲液系统两者Mab都由ATPS而部分纯化(参见图2)。
·通过基于200mM Na磷酸盐系统的ATPS可得到大于20％的HCP减少并且由250mM Na柠檬酸盐缓冲系统达到约30％的HCP减少(参见表6)。
·与Na磷酸盐缓冲系统相比较，用250mM Na柠檬酸盐缓冲系统得到较小体积的水相(与8.2ml相比的6.5ml，参见表6)。这意指在Na柠檬酸盐系统上相中具有较高浓度的Mab。
表6：作为浓度和缓冲液类型的函数的HCP减少
+系统为10ml并且包含8％w/w Breox、150mM NaCl和粗制Mab进料2。一个系统包含经澄清的进料。++UHCP经市售酶联免疫分析法测定。*＝相反转(水富集下相)，**＝浓度效应。
再次可见相系统减少HCP的能力。在这些研究中，假定HCP进入下相或相界面。在后一情况中其可能已与细胞碎片结合。
实施例7：APTS系统的进一步表征
水相的电导率：
为了检验其对于后续的分离步骤例如亲和性或其它捕获色谱法的适合性，采用由8％EOPO、150mM NaCl以不同缓冲液浓度(Na磷酸盐或Na柠檬酸盐)制备的5ml ATPS并且伴随用或不用(2.6ml)粗制Mab进料测定水相的电导率。结果显示水富集(贫聚合物)的含目标物相的电导率为约30-40mS/cm。我们在以下证实了用APTS预处理的Mab(其具有约35电导率)可被直接施用至MabSelect Sure(蛋白质A相关的)亲和柱上用于进一步纯化。我们提出这些溶液也适合于疏水作用色谱法、尺寸排阻色谱法以及一些形式的混合模式色谱法(或捕获过滤法)。它们也可适合于一些形式的目标物流通离子交换或目标物捕获离子交换法。如果样品打算直接施用至离子交换柱，可能需要一些稀释。然而，最近已经显示，如果目标蛋白质如Mab或Fab为高度荷电的，其甚至在25mS/cm下可能达到良好的结合(例如C.Harinarayan等，Biotechnology and Bioengineering，95(2006)775-787)。
两相中聚合物含量的分析：
在由8％EOPO、150mM NaCl和200mM NaP或Na柠檬酸盐缓冲液制备的水和聚合物相中EOPO聚合物的含量经含碳总量(TOC)法分析。结果显示水相中EOPO聚合物的含量仅为约1％(w/w)。而聚合物富集相中该含量为约40％(w/w)。结果与对于10％(w/w)Breox 50A1000和水两相系统的文献值(Cunha等.Journal of Chromatography B，711(1998)53-60)进行适宜地比较，该文献中温度需要升至60℃以实现相分离，得到具有相体积比为8和上下相聚合物浓度分别为约3％和60％的系统。因此在当前的系统中，含目标物相(在过滤后将直接载荷到柱上)中的聚合物含量为Cunha等的三分之一；最可能地是由于包含200mM的磷酸盐或柠檬酸盐的盐类。而且包含40％EOPO的下相预计可具有比包含60％EOPO(w/w)的系统更大程度上分配非目标蛋白质进入的容量。
具有14％微团聚体的Mab样品的分离：
使人工富集于自缔合抗体(多体团聚体)的Mab样品在8％EOPO、150mM NaCl、200mM Na磷酸盐，pH 7中进行分配。结果表明团聚体浓度没有减少或增加。这或许不出人意外，因为在团聚体表面仍然存在提供高分配的Mab的表面特征。对于Mab二聚体(dimmer)预计具有类似的结果。因此分配理想地应与选择性的多板分离方法如MabSelect亲和性色谱法或Adhere多模式色谱法(Adhere multimodalchromatography)配对。分配将除去一些较大的团聚体，只要它们达到由相界面张力控制的尺寸，。
实施例8：采用ATPS和蛋白质A柱纯化Mab
使粗制Mab进料1(2.6ml Mab)受到用如以上描述的(8％EOPO、200mM Na磷酸盐，pH 7、150mM NaCl)系统的处理。从上相收集2ml馏分并施用到HiTrap MabSelect Sure柱上用于进一步纯化。所施用的样品具有约35mS/cm的电导率。柱子用磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS)pH 7.4预平衡并用60mM Na-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.4)洗脱。作为对照，在相同柱子上纯化不经EOPO-ATPS而是离心和过滤的类似量的粗制Mab进料1(电导率为12mS/cm)。经洗脱馏分的纯度用SDS page电泳分析。对于粗制的和经回收的Mab在ATPS和蛋白质A色谱实验之后的蛋白质回收率和HCP数据(来自市售ELISA)呈现于表7和8中。来自这些实验的结果表明：
·Mab经ATPS部分纯化，回收率为100％(图3，表7)。
·ATPS预处理的Mab样品可被直接施用至MabSelect(图4)。
·经ATPS可得到HCP超过20％的减少(用所研究的进料和ATPS系统)(参见表8)。
相信在来自ATPS和Sure处理的样品之间相对抗体条带位置的移动是由于(经洗脱)样品pH和电导率(即经Sure洗脱的样品的更低pH)的差异以及在ATPS样品中存在残余的聚合物。在聚合物富集下相样品中注意到的扩散非条带相信是由于分配至该相中的宿主细胞蛋白质与该相中的聚合物相互作用。
对于ATPS和进料样品两者，来自蛋白质A柱的该样品的回收率在60-70％范围内。这对于蛋白质A相对为低(通常100％为正常)，然而一些类型的Mab可显示这样的结果。不过ATPS分配得到100％回收率并且与Mab进料样品相比不改变柱的性能。
表7：在不同步骤期间由Mab Sure分析数据计算的Mab回收率
表8：在不同步骤期间的HCP减少
ATPS步骤减少施用至柱子的HCP载荷(表8)，但是在蛋白质A色谱法之后没有影响该减少。然而HCP载荷减少22％(在该情况中)在减少非特异性堵塞和增加柱寿命方面可有益于方法。
实施例9：采用ATPS和Capto MMC柱纯化Mab
在此的目的为证实来自ATPS的水富集、含目标物的相与随后包括多模式阳离子交换剂Capto MMC的色谱分析步骤相容。采用实际的Mab进料1未经澄清进料pH 7。Mab的大约pI为6.5并且其浓度为0.4mg/ml。在热致相分配之后，用水富集的含目标物的相载荷MMC。作为对照，采用通过离心澄清的进料。用于ATPS系统的组成为：8％EOPO、200mM磷酸盐pH 7.4、150mM NaCl。在两种情况中，在色谱法之前将载荷溶液pH调节至5。
将Capto MMC媒介物装填于Tricorn 5/100(床高度为约10cm并且总体积为约2ml)。样品为1ml含目标物的相(不进行离心)或经澄清的进料。对于所有操作的流速为1ml/分钟(300cm/小时)。mAb用pH-梯度洗脱。馏分体积为2ml。缓冲液A为50mM HAcetate pH 4.75和缓冲液B为50mM TrisHCl pH 9。采用在0.3ml/分钟下以PBS运行的Superdex 200 5/150GL柱经凝胶过滤进行分析。
初始实验显示相当变形的吸附作用峰，同时分析显示mAb在流通中渗漏。另外在洗脱液池中检测到一些杂质。因此我们稀释进料样品减半至约0.2mg/ml Mab。经稀释的样品进行ATPS和Capto MMC分离程序并通过凝胶过滤分析。分析显示mAb与Capto MMC介质的良好结合，因为在流通中没有mAb渗漏(图5和6)。
Capto MMC被提升为“高盐色谱法树脂”。这些结果显示CaptoMMC可以在与未稀释的含目标物上相相关的导电率下结合受试的mAb。增加pH至接近或高于蛋白质pI的点为洗脱已结合蛋白质的最有效方法。回收率为60-70％，类似于MabSelect结果。HCP减少为约90％，类似于进料结果但是低于MabSelect。
实施例10：采用ATPS和蛋白质A柱按比例放大的Mab纯化
在此我们显示本发明的分配不以增加团聚体形成、减少回收率或降低蛋白质A步骤的回收率与纯度这样的方式干扰mAb。因此ATPS可起结合澄清与分离步骤并减少可导致蛋白质A柱堵塞的较大颗粒或团聚体含量的作用。通过直接在发酵容器中(或酵素被转移至的容器中)形成ATPS，分配可为相同单元操作的部分而没有任何时间损失。作为第二步骤，含mAb的馏分(水富集相)以与以上提到的类似方式采用MabSelect Sure进一步纯化。
起始原料为经离心澄清的含Mab的CHO细胞发酵进料2。采用经澄清的进料是由于使其更加易于按照相分离动力学进行。Mab浓度为约0.4g/l。经凝胶过滤判断，进料样品包含15-20％(通过A280)抗体二聚体和团聚体。
除了其中采用100％EOPO聚合物与适当量的固体磷酸盐的系统5以外，通过混合适当量/体积的40％(w/w)EOPO聚合物储备液与0.8M缓冲液，直接在1升玻璃量筒中制备水性两相系统。通过加入进料将每一个系统的最终体积调节至800ml。混合每一个系统并，除了系统3保持在室温以外，然后于40℃下在人工气候箱(climate cabin)中培育。在经用于相形成的时间成相以后，记录每个相的体积和相体积比(参见表9)。然后从每个系统移出含mAb的水富集相用于进一步纯化。
表9显示来自各种两相系统的数据。一些框中包含两个数值。这是由于中间相的大小。可以用几种方法收集中间相。在系统5中，盐作为固体结晶加入至最终浓度。
表9：采用各种相系统随后通过蛋白质A亲和色谱进行一公升规模的Mab处理
| 系统 | 1 | 2 | 3* | 4 | 5** | 8 |
| ％EOPO | 8 | 8 | 8 | 12 | 8 | 8 |
| [PO4]mM | 200 | 0 | 0 | 0 | 200 | 0 |
| [柠檬酸盐]mM | 0 | 100 | 250 | 100 | 0 | 200 |
| pH | 8 | 7 | 7 | 7 | 8 | 7 |
| 温度 | 40 | 40 | 20 | 40 | 40 | 40 |
| mM NaCl | 150 | |||||
| 系统复合 | ||||||
| mL水相 | 650 | 650 | 550 | 520 | 690 | 680 |
| 100％EOPO的克数 | 64g | |||||
| mL 0.8M NaP，pH 8，＝[200]mM | 200 | |||||
| gNa2HP，＝[200]mM pH 8 | 25.7g | |||||
| g NaH2P，＝[200]mM pH 8 | 2.1g | |||||
| mL 0.8M NaCit，pH 7，＝[100或250]mM | 100 | 250 | 100 | 200 | ||
| gNaCl | 0 | 0 | 6.96 | 0 | 0 | 0 |
| ml加入的进料 | 440 | 540 | 390 | 460 | 736 | 440 |
| ml总体积 | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 | 800 |
| 相体积比(水富集相/聚合物富集相) | 4.3 | 4.6 | 1.45 | 1.9 | 5.6 | 5.5 |
| 混合和相分离时间(小时) | 0.5 | 1.5-2 | 3 | 0.5-1.5 | 1.5-2 | 1.5 |
EOPO指Breox 50 A 1000。*在这些高盐条件下，于室温下，伴随相密度反转发生相形成，因此含Mab的水富集相为下相。**在该实验中，聚合物和盐作为固体加入，其需要更长时间用于混合与分离。
可见这些800mL系统经30-120分钟的不同时间显示相分离。应该注意到相分离取决于相系统高度(深度)多于体积以致于具有20cm高度的1L系统可与具有20cm高度的500L系统以相同方式相分离。这是重要的，因为具有20cm高度的500L系统可在具有90cm半径的容器中处理。
蛋白质A色谱法
采用5ml HiTrap MabSelectSure实施色谱法。采用1ml HiTrapMabSelectSure柱和Superdex 200 5/150GL实施分析。样品为50ml进料或水富集相，缓冲液A：20mM磷酸钠在0.15M NaCl中，pH＝7.2，缓冲液B：50mM柠檬酸钠pH＝3.0。流速5ml/分钟(150cm/小时)和梯度为0-100％步进。收集流通和洗脱液用于进一步分析mAb、HCP和团聚体水平。将水富集相离心之后施用到随后的色谱分析步骤以使回收率估值及其它分析更加准确(与可在柱上堵塞的大团聚体不相关)。同样将该离心步骤看作与色谱法之前的深层过滤相当。
样品分析
采用MabSelectSure柱测量mAb的浓度。将50ul样品施用到1mlHiTrap MabSelectSure柱。将洗脱峰的面积积分并分别乘以进料和水相体积。通过比较面积单位的总数计算采用ATPS的提取的回收率。以相同方式计算MabSelectSure步骤的mAb回收率。样品：50ul进料或水相，柱：1ml HiTrap MabSelectSure，缓冲液A：PBS，缓冲液B：100mM柠檬酸钠pH＝3.0，流速1ml/分钟(150cm/小时)，梯度：0-100％B，步进。
二聚体和团聚体(以及MAb浓度)采用Superdex 200 5/150GL凝胶过滤柱测量。二聚体峰和单体峰面积通过UNICORN软件自动积分。比较来自进料和水相的二聚体总面积。样品：50ul进料或水相，柱：3ml Superdex 200 5/150GL，缓冲液：PBS，流速0.3ml/分钟(45cm/小时)。
结果
能够将水相直接施用至MabSelectSure柱上而不需任何稀释或改变pH或导电率(图7)。
采用MabSelectSure柱进行来自进料和水相的mAb浓度分析(图8)。在图8中，分析了粗制进料。如同可见到的那样，大部分蛋白质及其它280nm紫外吸收化合物直接通过柱。
图9显示系统3上相mAb浓度的分析(表9)。该色谱图与图8大体形状相似，这是所期待的。图10显示与通过亲和柱的上相相关的洗脱物样品的亲和性分析。由图8和9相比较，可见亲和柱对Mab(第二个峰)的浓缩作用。
表10显示来自表9中各种操作的结果。其显示来自两相提取的Mab回收率对于除了一种情况以外的所有情况为＞95％。在所研究的条件下并且对于该Mab样品，两相提取不太有助于HCP减少，其为少于10％。然而，在该种情况中选择系统以使Mab回收率最佳化。根据单体与二聚体之间的比例未变化判断，团聚体浓度不存在明显减少。
表10也提供了来自MabSelect Sure操作即来自MabSelectSure柱的洗脱物结果的汇总，其与起始原料进行了比较。起始原料为进料或不同的含目标物的水富集相。如同所期待的那样，回收率为几乎100％并且HCP减少为＞99％。二聚体/团聚体的减少不确定并且可能在分析方法变化的范围内。比较该步骤进料与洗脱物中二聚体/单体比率，存在差异。在进料中，于MabSelectSure步骤之前，该比例为0.17，相比之下于MabSelect Sure步骤之后为0.14-0.15。
表10：含Mab目标物的进料、水富集相和MabSelect Sure亲和色谱法洗脱峰的分析
*对应于表9的系统。在所有情况中总的系统体积为800ml。
+系统3于室温下形成两相，但是呈现相反转，因此含Mab目标物的水富集相为下相。
**39405ng/ml下的进料HCP相当于26096ppm。29415的系统1水富集相HCP相当于25358ppm。
当载荷系统5的水富集相时，MabSelect Sure亲和色谱法的Mab回收率为137％并且来自系统6的为76％。典型值为100％。
++在该分析中，在二聚体与较大团聚体之间没有区别。将比率乘以100得到与单体含量相比较的二聚物含量百分数值。通过尺寸排阻(凝胶过滤)色谱法(SEC)分析。从标准曲线计算单体浓度，得到方程式y＝663x-3，r＝0.995。
关于结果分析，采用运行Akta色谱单元(GE Healthcare)的MabSelectSure柱测量mAb浓度。将50μl样品施用至1ml HiTrapMabSelectSure柱。缓冲液A为150mM NaCl、10mM Na磷酸盐pH 7.2(PBS)，缓冲液B为100mM柠檬酸钠pH 3，流速1ml/分钟(150cm/小时)，伴随梯度为0-100％B，步进。将洗脱峰的面积积分并分别乘以进料体积和水相体积。通过比较面积单位的总数计算采用ATPS的提取的回收率。
以相同方式计算MabSelectSure步骤(在分配之后)的mAb回收率。在一些情况中，二聚体和团聚体(以及MAb浓度)采用Superdex 2005/150GL凝胶过滤柱测量。二聚体峰和单体峰的面积由UNICORN软件自动积分。比较来自进料和水相的二聚体总面积。样品：50μl进料或水相，柱：3ml Superdex 200 5/150GL，缓冲液A：PBS，流速0.3ml/分钟(45cm/小时)。采用GyroLab测量宿主细胞蛋白质(HCP)。
例如当回收率大于110％(洗脱系统5)和当对于洗脱系统8为76％时，两个结果作为异常值易于鉴别。多年的经验表明，在操作条件下对于所有的蛋白质A介质，回收率应总是接近于100％。
比较水相与起始原料中的HCP含量(表10)，在相对HCP-浓度中存在小的减少，即ATPS减少HCP含量。对于二聚体/团聚体减少，一些ATPS看来稍微增加了二聚体浓度。这些差异小并且它们可能处于分析方法扩展的范围内。
如所预计的那样，在MabSelectSure步骤之后存在HCP大的减少。回收率已分别经两种方法测量，“Sure”-法和经凝胶过滤。在它们之间存在差别，但是两种方法都显示了来自相系统和后续蛋白质A的高回收率。
实施例11：在基于Na磷酸盐和Na柠檬酸盐的ATPS中分配Fab
人们设想Mab蛋白质由于其相对疏水性及其通常的净正电荷常常偏向于含盐如磷酸盐或柠檬酸盐的EOPO和水ATPS的水富集相。已知GFP，其为完全疏水性，也显示高的K值大小，如由布朗斯台德方程式预计的那样，可起次要作用。该预测证实了系统不能差别性地分配分子团聚体、二聚体及单体Mab形式(参见以上)。幸运地是其也表明分配可能也适合于抗体Fab片段蛋白质(Fab)。在基于Na磷酸盐和Na柠檬酸盐缓冲液的EOPO-ATPS中，通过在系统制备期间向每个系统中加入0.5mg Fab，试验约55kDa MW的多克隆Fab(pI：5.5-9.5)的分配。在于40℃下成相之后，分离这些相并在280nm下经分光光度计监测每一个相的吸光度。计算分配系数(K)和每一Fab在上相中的％浓度(C/Co)x 100％(参见表11)。结果显示Fab在基于Na柠檬酸盐缓冲液的水相中的回收率更高(79％)，超过在基于Na磷酸盐缓冲液的类似相中的回收率(60％)。这些分配值低于在本报告中提到的对于Mab和多克隆Ig的典型值。不过所研究的系统对于Mab最佳化而对于Fab没有。另外Fab样品明显包含一些其pI十分酸性的蛋白质，所以不令人意外的是其分配K值可以更低。
表11：在基于Na磷酸盐和Na柠檬酸盐的ATPS中Fab的分配
实施例12：在基于EOPO的ATPS中的蛋白质选择性
于40℃下，在包含8％EOPO、200mM Na磷酸盐，pH 7.4和150mM NaCl的5ml系统中分配具有不同pI的蛋白质。系统中的总蛋白质浓度为1mg/ml。在相形成后，分离这些相并在280nm下经分光光度计监测每个相的吸光度。计算分配系数(K)并汇总于表12中。结果表明碱性蛋白质完全分配于水相中，同时大部分酸性蛋白质在上下相两者之间分配。即使多克隆Ig样品具有约7的平均pI，其呈现(如先前提到的)高的k值；或许是由于疏水性和大小。
表12：蛋白质在pH 7.4下于EOPO-ATPS中的分配
分配应与亲水性(每单位面积净电荷为阳性的蛋白质有助于水富集相)和疏水性(更加疏水的蛋白质在水富集相中因为自缔合的EOPO相把它们排除在外)两者有关。所研究的系统包含大量的Na磷酸盐和NaCl并且因此可能不出人意外的是大多数蛋白质显示显著的上相分配。然而即使对于这样的系统，一些选择性得到了证实。基于在此提到的其它结果，降低NaCl和Na磷酸盐至100mM NaCl并增加pH至8可降低α-乳清蛋白、BSA和肌红蛋白的K值并得到更加选择性的系统。然而这样的系统不能对目标物如抗体提供最好的回收率。在其中下相分配的蛋白质为目标蛋白质的情况中，其分配可通过改变盐、pH、包含疏水性亲和配体或在以上实施例中记录的其它变体得到增加。
实施例13：包含奶或血液的两相系统的形成
采用包含各种复杂生物相关样品例如植物、奶、血液等中的重组或天然蛋白质的两相系统的可能性导致研究以了解基于奶或血液的溶液是否可被处理。在包含奶的试验中，对于两相形成筛选了四种条件(参见表13)。注意到在一些条件下形成相系统但是相形成被脂肪物质的存在以及(可能地)被高钙水平复杂化。已知后者能够与含氧聚合物和磷酸盐螯合形成如将氯化钙加入到在磷酸盐缓冲的生理盐水中的PEG时形成的沉淀。结果表明该方法对于脱脂奶作用更好。
表13：含有奶的两相系统的形成
通过向7ml血液(其天然地包含约150mM NaCl)中加入Breox50A EOPO聚合物储备液和Na柠檬酸盐pH 7.4储备液，以在15ml加帽塑料圆锥管中产生以10％EOPO和体积10ml存在的约70％(v/v)血液等渗溶液，实施包含血液的试验。在37℃下轻柔地手动倒转混合后，在10分钟内混合物分离为两个液相和一个细胞区域。对于以该方式处理的血液样品可见良好的相形成、澄清和相分离(数据未显示)。
实施例14：包含Pluronic L81的两相系统的形成
Breox和Ucon聚合物为EO和PO的无规共聚物。Pluronic为形式(EO)x(PO)y(EO)x的嵌段共聚物。为了研究在基于Pluronic L81聚合物(10％EO & 90％PO，伴随总聚合物MW为约2700)的ATPS中Mab的回收率，采用Mab进料2以不同的盐类型(磷酸盐和柠檬酸盐)实施一些试验。Pluronic L81具有比用于大多数以上研究中的Breox聚合物更低的Tc并且可能适合室温下使用。当聚合物浓度为10-20％时于室温下形成两相系统，表明其它的热致感应型混浊聚合物也可适合于以本发明的方式使用。采用MabSelect Sure分析测量水富集相中Mab(进料2)回收率。基于EOPO的ATPS用作对照。结果呈现于表14中并且显示对EOPO系统Mab回收率高于92％和对于(未最佳化的)L-81系统Mab回收率高于86％。
表14：Mab在Breox或Pluronic L81聚合物的ATPS系统中的分配
一些5ml总体积的系统与Breox 50A 1000 EOPO聚合物复合并且一些与Pluronic L81复合。一些相在室温下分离并且其它相于40℃下分离。**在一些情况中，对于水富集(聚合物较贫)相发生相反转变为下相。
实施例15：在一次性生物反应器中的14公升规模分配
在此我们显示基于Breox(EOPO)聚合物的水性两相系统(ATPS)的用途，该Breox聚合物以浓缩物形式与盐直接加入到WAVETM袋中的10L Mab细胞培养物，使得能够以14公升规模去除细胞(澄清)而不需离心。注意在该研究中选择加入聚合物和盐储备液的方法是为了有助于容易混合，而不是为了使体积减少最佳化。因此，选择该相系统以实现快速分离和良好的Mab回收率。其没有最佳化以实现Mab回收率与宿主细胞蛋白质去除之间的平衡。感觉到基于以上实施例，如果可行的模型系统能够证实，试剂加入方法和关于HCP及其它杂质去除方面的系统最佳化应是简单直接的。
实际的进料4Mab细胞培养物在CHO细胞系中表达。培养持续时间为18天和培养容器WAVE生物反应器系统20/50具有20L袋和pH/Oxywell。培养基为具有5g/L水解物UF8804(Millipore)的PowerCHO2(Lonza)并在需要时供给葡萄糖和谷氨酰胺。在细胞平均生存能力降至40％以下时进料样品被定义为准备收获。加入聚合物-盐溶液时，WAVE袋的内容物温度稳定为42℃。
通过将储备液混合物泵送进入包含9.5kg Mab进料4的WAVE袋直接制备ATPS聚合物系统(参见图11)。
表15：制备ATPS需要的化学品和进料的量
*假定9.5kg进料＝约9.5L。通过将2kg EOPO溶于2kg MQ水中制备EOPO，50％(w/w)。
为了达到10％EOPO (w/w)、200mM Na磷酸盐，pH 8.0和150mMNaCl的最终浓度，按照表15预混合储备液。因此将总量为8.37L的该混合物加热至40℃并然后采用蠕动泵泵送至WAVE袋中具有几乎相同温度的进料。用于泵送聚合物混合物的时间为约50分钟。在使混合物在WAVE反应器上摇动约15分钟后，自反应器解开包含袋夹持器的WAVE袋并然后以长轴处于垂直位置地置于实验台上(参见图11)。这有助于目测相形成，而且使得袋的装管口指向袋的底部和顶部。它也调节相高度保持与在甚至更大的过程中可能期待的相高度更一致(参见以上讨论)。在5分钟后观察到两相系统的形成并且于30分钟后完成。如同在图12中所见到的那样，于界面形成了细胞碎片层。然后通过从WAVE袋的上部插入管，然后将该管连接至蠕动泵，将上相转移至不同的瓶中(参见图12)。然后，采用连接于变为WAVE袋下角(当WAVE袋被置于长轴垂直时)的管将下(聚合物)相转移至瓶中(参见图11)。
合并由不同瓶收集的上相物料(～13.5L)并然后采用连接于6英寸ULTA HC 0.2um滤器的6英寸ULTA 0.6um GF过滤。在过滤7公升物料后，用新的滤器替代该6英寸ULTA 0.6um GF，因为压力增加至2.5巴。用WAVE袋收集经过滤的物料并然后在4℃下保存。
采用MabSelect Sure分析测量在ATPS之后于贫聚合物上相馏分中的Mab回收率(参见以上)。对于粗制进料和在ATPS实验之后所回收Mab的Mab回收率和宿主细胞蛋白质(HCP)数据呈现于表16中。来自这些实验的结果显示Mab经ATPS被部分纯化，回收率为＞99％(表16)，显著除去了细胞碎片(图11和12)。通过用于该实验的水性聚合物两相系统没有得到显著HCP减少(表16)。
表16：Wave上相回收馏分中Mab和HCP的回收率
表格计算假定液相密度约为1。聚合物富集的下相为4.600Kg，宿主细胞蛋白质(HCP)为0.45μg/ml或总计2.07mg。HCP经市售ELISA试剂盒测定。假定最后馏分不完全，因为上相不能全部用所使用的简单方法回收。数据表明遗留约0.7％或少于100ml。
将多于8L的聚合物溶液泵送至包含9.5kg的Mab细胞培养物(进料4)的20L WAVE袋。于5分钟后已经观察到两相系统形成并且于30分钟后完成。在界面形成一层细胞和碎片。该ATPS细胞和碎片被成功除去并且目标Mab蛋白质在水性上相中几乎被完全回收。以与对于实际进料的较小规模研究相同的方式，在简单过滤之后，经澄清的含Mab的相可直接施用至MabSelect亲和柱而没有Mab或柱性能的任何损失。
实施例16：病毒和病毒疫苗处理
综合实验
病毒相关的实验包括将来自以上抗体发酵进料和相关实验的代表性系统应用于与病毒疫苗处理相关的实验。因此采用类似的聚合物、盐、系统和技术。采用两个品系的病毒实施两个实施例实验。第一个实验包括采用由CHO细胞蛋白质增大的经蔗糖梯度纯化的病毒进行分配；第二个实验为由经澄清和浓缩的病毒(来自相同来源)增大的实际病毒进料。
化学品、试剂和病毒储备液
BreoxTM 50A 10001，MW 3900，参见以上。
用于该项研究的所有其它化学品为分析级并且购自MERCK。
1用于本研究的BreoxTM为常见的工业表面活性剂并且可得自几种来源。类似的聚合物用于生物制药处理和配制中，其中它们提供多种功能。Breox 50A 1000为由50％环氧乙烷和50％环氧丙烷组成的无规共聚物。其分子量(数均)为3900Da并由KTH(生物技术部，Dept.ofBiotechnology)得自International Specialty Chemicals)(Southampton，UK)用于与用于提取膜蛋白质的Breox和清洁剂两相系统相关的较大研究(参见J.Chromatogr.B，第711卷，第53-60页，1998)。
Breox系的聚合物看来相当安全和生物相容并用于一些配方。
病毒材料
采用两个生物材料样品。第一个样品为由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞发酵物通过采用MabSelect亲和柱(GE Healthcare)流通(FT)产生的基于疫苗增大的CHO细胞的进料。FT包含很少或没有Mab但包含标准CHO宿主细胞蛋白质以及其它杂质。其富集40％经蔗糖梯度纯化的A/H1N1/新喀里多尼亚(New Caledonia)流感病毒的完整病毒部分，经甲醛处理，血凝素(HA)浓度为～200μg/ml。
第二个样品称为病毒进料，基于活性A/H1N1/所罗门群岛(Solomon Islands)流感病毒的粗制收获(在MDCK细胞中增殖)，HA浓度为～13.8μg/ml。为了更加易于分析结果，通过向51ml粗制收获中加入9ml经澄清和浓缩的A/H1N1/所罗门群岛流感病毒(～73μg/ml)增加病毒进料中的病毒浓度。病毒材料也包含10mM TRIS pH 7.4和0.15M NaCl。
分配方法
通过混合适当量/体积的以下在表17中列出的储备液，在15mlSarstedt管中直接制备每种水性两相系统(ATPS)溶液。ATPS基于100mm NaP(pH 7)和150mM NaCl中的8-12％EOPO系统。在加入病毒进料混合物之后，用PBS将每个系统的最终体积调节至10ml(参见表)。将混合物涡旋约30秒并然后在烘箱中于40-45℃下静置约1小时使之成相。然后分离所形成的相并按照以下提及的方法分析。
储备液：
BREOX 50A 1000，100％(w/w)：直接使用。
NaP(Na-磷酸盐，0.8M)：pH 7，通过混合适当量的0.8M NaH2PO4和0.8M Na2HPO4制备。
NaCl(5M)：通过将14.6g NaCl溶于50ml MQ水中制备。
表17：采用病毒进料混合物的包含100mm NaP，pH 7、150mM NaCl的10ml规模8-12％EOPO相系统的制备
分析
采用检测完整病毒颗粒的酶联免疫检测ELISA法(TAKARA)分析经蔗糖梯度纯化的病毒增大的CHO细胞样品的分配结果。这与用来自经蔗糖密度梯度纯化样品(以上)的完整病毒部分的病毒增大的CHO FT进料保持一致。
按照标准市售可得到的检测法分析实际疫苗进料样品结果。经Bradford检测法分析总蛋白质、经qPCR检测法(针对MDCK细胞基因组DNA)和PicoGreen
(分子探针)分析脱氧核糖核酸(DNA)、经使用基于表面等离子共振(SPR)检测法的BiacoreTM仪器(GE Healthcare)分析宿主细胞蛋白质(HCP)(采用针对MDCK细胞的兔多克隆Abs)和经Biacore SPR检测法分析病毒HA(参照C.Estmer Nilsson等，Vaccine28(2010)759-766)。Biacore HA检测法检测病毒HA蛋白质并因此也对包含病毒相关杂质(HA)的所有其它病毒和细胞碎片敏感。
如同先前所指出的那样，Breox EOPO聚合物在上相中的浓度为约1％(w/w)，而下相中预计高得多(例如70％)。亲水性聚合物例如EO(聚乙二醇)和葡聚糖对Bradford检测法的影响已经由几位作者包括Barbarosa等(在葡聚糖或聚乙二醇(PEG)与葡聚糖存在下采用Bradford方法的蛋白质定量(Protein quantification in the presence of dextran orpoly(ethylene glycol)(PEG)and dextran using the Bradford method)。Helder Barbosa，Nigel K.H.Slater，
C.Marcos，AnalyticalBiochemistry 395(2009)108-110)进行了研究，其推断出高于10％的PEG浓度导致检测灵敏度显著降低。
结果和讨论
对具有不同Breox聚合物浓度(8-12％w/w)的三种相系统在重复实验中进行了研究。系统与盐组合类似于对蛋白质处理研究了的那些组合。在加热高于40℃时于进料样品中易于形成两相。下相由于高浓度聚合物而难以分析，但是上相在加热之前因为是单一相系统而易于分析。在一些情况中，对于热敏EOPO嵌段共聚物(例如Pluronic
L81)得到类似结果(数据未显示)。综合的结果显示在图13中。可见全部三种EOPO聚合物浓度的实际病毒进料样品得到基本上类似的结果，上相中病毒HA为约20％(通过Biacore HA检测法)，上相中HCP为60-70％，上相中总(Bradford)蛋白质为70-80％，且上相中DNA少于5％。在其中进料为用细胞经澄清的CHO细胞进料增大的完整的经蔗糖梯度纯化的病毒的其它实验中，至上相的DNA分配(经PicoGreen
检测法测量)为70％，而完整病毒的上相分配经ELISA检测法分析为70-100％。DNA分配与WO2004020629中对基于EOPO二聚合物的系统所提到的一致。
数据显示，采用在进料中形成的单一感应型聚合物两相系统能够实现病毒进料的澄清和完整病毒颗粒的初步回收用于进一步处理。如同在Mab处理的情况中，上相将包含一些HCP和一些DNA以及病毒，但是应经亲和色谱法或其它方法受到进一步处理。实验表明，依所采用的检测法类型或进料而定，在病毒和在DNA分配系数方面存在显著的差异。这可能部分地是完整病毒和病毒碎片在相间的不均匀分配的作用。在包含细胞和病毒碎片的样品中，DNA分配进入上相有点出人意外的缺乏，这可通过DNA与细胞和病毒碎片相互作用引起DNA与碎片积聚在界面而部分地得到解释。
本文提及的所有专利、专利公布及其它公开的参考文献在此通过引用将它们整体结合到本文中，如同每个都已各自和具体地通过引用结合到本文中。尽管描述了本发明优选的例示性实施方案，本领域技术人员将意识到本发明的实施可不同于所描述的实施方案，这些实施方案仅为了示例性目的而提出，并且不构成限制。本发明仅通过所附的权利要求进行限定。
Claims (30)
1.从水性液体分离至少一种目标生物分子或化合物的方法，所述方法包括：
a.在容器中混合所述水性液体与热致感应型亲水聚合物，和如果必要时至少一种加入的盐；
b.在聚合物高于其浊点的条件下轻柔地混合得自(a)的液体混合物，以形成一聚合物两相系统，其中所述目标生物分子或化合物分配进入其中一相，并且优选该相不富集聚合物，而非目标化合物和颗粒不同程度地分配至相界面或聚合物富集相；和任选地，
c.通过与新的互补相混合使含目标物的相进行另一分配；
d.将目标生物分子从其所富集的相回收；和任选地；
e.从聚合物富集相将聚合物再循环回到分配单元操作。
2.分离一种或更多种目标生物分子或化合物的多步骤方法，其中通过权利要求1的方法对发酵物或类似的含生物质的进料进行澄清。
3.权利要求1的方法，其中所述聚合物为包含环氧乙烷作为其主要成分之一的聚醚，并且呈现在4-100℃之间的浊点。
4.权利要求3的方法，其中所述聚合物的分子量在900-100000Da范围内。
5.权利要求1的方法，其中热致感应型聚合物选自聚乙二醇(PEG)；包括Breox的环氧乙烷环氧丙烷(EOPO)共聚物，或包括EOPOEO嵌段共聚物PluronicTM的EOPO嵌段共聚物；或者乙氧基或其它氧基改性的多糖包括乙基羟乙基纤维素(EHEC)。
6.权利要求1的方法，其中聚合物在水溶液中自缔合的趋势主要不是热致感应的而是pH致感应的。
7.权利要求1的方法，其中加入盐的浓度在1-500mM范围内，优选在100-300mM范围内。
8.权利要求1的方法，其中所述盐选自NaCl、Na2PO4、KPO4、NaSO4、柠檬酸钾、柠檬酸钠、(NH4)2SO4和乙酸钠；或其任意组合。
9.权利要求1的方法，其中总的聚合物含量构成约4-20％(w/w)。
10.权利要求1的方法，其中所述两相系统为包含约4-20％EOPO的水性聚合物两相系统。
11.权利要求1的方法，其中所述两相系统为包含约5-15％EOPO的水性聚合物两相系统。
12.权利要求1的方法，其中在步骤(a)中pH约为中性。
13.权利要求1的方法，其中所述液体为发酵液。
14.权利要求1的方法，其中所述目标生物分子或化合物为蛋白质。
15.权利要求1的方法，其中所述目标生物分子或化合物为抗体。
16.权利要求1的方法，其中所述目标生物分子或化合物为多克隆抗体、单克隆抗体或抗体片段如Fab片段。
17.权利要求1的方法，其中所述目标生物分子或化合物由不富集聚合物的相分离。
18.权利要求1的方法，其中所述两相在显示优先分配于一相或另一相的疏水物或其它亲和性配体存在下形成，其中所述亲和性配体任选地为被聚合物改性的。
19.权利要求13的方法，其中所述容器为在其中进行了发酵的容器。
20.权利要求1的方法，其中所述混合和相形成在塑料袋中进行，所述塑料袋任选地连接至运动平台如摇动平台。
21.权利要求1的方法，所述方法进一步包括至少一个液相色谱法步骤。
22.权利要求21的方法，其中所述液相色谱法包括基于蛋白质A的亲和色谱法。
23.权利要求21的方法，其中所述液相色谱法之后进行一个或更多个步骤，所述一个或更多个步骤包括亲和色谱法、离子交换、疏水作用色谱法或多模式离子交换色谱法。
24.从液体分离至少一种抗体的方法，所述方法包括在两相系统的相之间分配的步骤，所述两相系统包含亲水性聚醚和至少一种盐。
25.权利要求17的方法，其中所述不富集聚合物的相为至少两相中的不太稠密的上相。
26.权利要求17的方法，其中所述不富集聚合物的相为至少两相中更稠密的相。
27.权利要求13的方法，其中所述容器为在其中进行了发酵的固定的常设金属容器或一次性的塑料容器。
28.权利要求13的方法，其中完整或裂解的细胞通过界面张力保持在液-液相界面。
29.权利要求1的方法，其中所述含目标物的相通过部分加入新的或再循环的聚合物及其它组分进行进一步的相分配。
30.用于基于非分离的处理的目标生物分子或化合物，所述基于非分离的处理包括低温储存或冻干，所述目标生物分子或化合物按照权利要求1的方法纯化，其中，残余聚合物的存在对所述目标分子提供了保护作用。
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