JP2002538942A - 液体−液体分配を使用する分離方法 - Google Patents

液体−液体分配を使用する分離方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、予め決定した化合物の分離の方法であって、ｉ)少なくとも相の１つが熱分離性ポリマー(Ｉ)を多く含んでおり(相１)、他の相が少し含んでいる(相２)、２相システム(システムＡ)において化合物を分配すること、ii)当該化合物を含む１つの相(相１または相２)を回収すること、iii)必要ならば、ステップiiで回収した相から当該化合物を単離すること、を含み、ａ)ポリマー(Ｉ)は、ミセル形成熱分離性ポリマーであること、そしてｂ)相２が、熱分離性ポリマー(Ｉ)の曇点を低下する少なくとも１つの試薬、例えばポリマー(Ｉ)に不適合なポリマー(II)または塩を含み得ること、を特徴とする方法である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、熱分離性ポリマーを含む少なくとも１つの相を含む水相システムの
分離に関する。分離される化合物は、例えば、脂質、ペプチドおよび／または炭
化水素構造を有する生物学的性質(生体分子)であり得る。
【０００２】 （背景技術） 典型的な水性の２相システムは、ＰＥＧ／デキストランおよびＰＥＧ／塩シス
テム(ＰＥＧ＝ポリ(エチレングリコール))である。前者のシステムは、ポリマー
−ポリマー不適合性から得られるシステムであり、後者は、塩によるポリマーの
塩析から得られるシステムである。ＰＥＧ／デキストランシステムは、巨大分子
、膜、細胞粒子および細胞(Albertsson, Partition of cell particles and mac
romolecules, 3rd ed., Wiley, New York; and Walter et al. (Ed.), Aqueous
two-phase systems, Meth. Enzym. 228 (1994(Academic Press, London))の小規
模の分離に使用される。ＰＥＧ／塩システムは、大規模の酵素抽出に主に使用さ
れる(Cordes et al., Meth. Enzymol. 228 (1994) 600-608 (Academnic Press,
London)。
【０００３】 より新しい２相システムは、温度上昇により下げる水中での溶解度を有するポ
リマーを利用する(熱分解性ポリマー)。この場合、２つの巨視的相(ポリマーは
下相に多く、水は上相に多い)は、曇点(cloud point)がある程度高いポリマーの
溶液の加熱により得られ得、すなわち、その温度は、相が分離し始める温度であ
る。所定のポリマーの水溶液の曇点は、ポリマー濃度ならびに添加された他の成
分(例えば、曇点−低下試薬)の量および型に依存する。最も低い曇点は、最低臨
界溶液温度(ＬＣＳＴ)と呼ばれる(Saeki et al., Polymer 17 (1976) 685-688)
。この現象はまた、非イオン性界面活性剤、例えばTriton X-114、C12E05の水溶
液中に生ずる。生物工学における熱分離性の適用は、概説されている(Galaev et
al., Enzyme Microb. Technol. 15 (1993) 354-366)。もし特記しなければ、Ｌ
ＣＳＴは、純粋なポリマーおよび純水からなるシステムの最も低い曇点をいう。
【０００４】 多くの熱分離性ポリマーには、エチレンオキシド群が含まれる。そのようなＰ
ＥＧは一例であるが、その曇点は、生体物質の分離用の熱分離工程での使用には
温度が高過ぎる(約１００℃)。エチレンオキシド(ＥＯ)−プロピレンオキシド(
ＰＯ)ランダムコポリマーは、最も低い曇点を有する。Ucon 50 HB-5100およびBr
eox 50A 1000は、５０％ＥＯおよび５０％ＰＯ群を構成するランダムコポリマー
である(ＥＯＰＯ−ポリマー)。両方のコポリマーは、５０℃のＬＣＳＴを有する
。
【０００５】 種々のＥＯ／ＰＯ比を有する有するポリマーの相システムが、タンパク質の分
離において研究されてきた(Harris et al., Biosep. 2 (1991) 237-246; Alred
et al., J. Chromatogr. 659 (1994) 289-298; Persson et al., J. Chromatogr
. 711 (1998) 97-109; Berggren et al., J. Chromatogr. A 718 (1995) 67-79;
Johanssson et al., Biochim. Biophys. Acta 1290 (1996) 289-298)。ＥＯお
よびＰＯ単位(Pluronics)のブロックからなる熱分離性ポリマーおよび酵素の分
離におけるその使用が述べられている(Tani et al., Analytical Science 13 (1
997) 925-929)。Taniらにより使用されたポリマーは、中央に親水性ＥＯブロッ
クおよび末端部分に疎水性ＰＯブロックを有する、またはその逆を有する(ＥＯ
ＰＯブロックコポリマー)。
【０００６】 本発明者の二人(Folke TjerneldおよびJosefine Persson)はまた、ＷＯ９８１
１１２７およびＷＯ９８１１４０の発明者であり、その何れもが、熱分離性ポリ
マーを含む水性２相システムにおけるアポリポタンパク質の精製について述べて
いる。
【０００７】 種々の疎水性および実効荷電(net charge)を有するアミノ酸およびオリゴペプ
チドの分配は、水／Uconシステムで研究されている(Johansson et al., Biosep.
5 (1995) 269-279; Johansson et al., Biochim. Biphys Acta 1335 (1996) 31
5-325)。
【０００８】 これまでに使用されている熱分離性ポリマーの不利な点および本発明の目的 熱分離性ポリマーを含む相システムにおいて、これまでの相は、通常、水相に
独占的に分配される殆どのタンパク質と共に、比較的高濃度のポリマー(４０％
を超える)を含む。ａ)ポリマー相にわずかなポリマーが存在するシステムを有す
ること、ｂ)相間を行き来して分離される化合物を目的とすることができること
、そしてｃ)熱分離性ポリマーの再利用を促進する分離工程を有すること、が利
点となり得る。
【０００９】 定義 ポリマー：ポリマーなる語句を本発明で使用する場合、他に強調しなければ、
水溶性／水混和性ポリマーをいう。さらにポリマーなる語句は、異なるかまたは
同等であり得る２０以上のモノマー単位を含むことを意味する。
【００１０】 熱分離性ポリマーは、温度の上昇によって下げる水の溶解度を有するポリマー
をである。
【００１１】 曇点−低下試薬(cloud point-decreasing agents)は、ポリマー−水溶液に加
えたとき、当該溶液の曇点を下げる化合物である。
【００１２】 曇点−上昇試薬(cloud point-increasing agents)は、水中の熱分離性ポリマ
ーの溶液に加えたとき、溶液の曇点を上げる化合物である。
【００１３】 不適合なポリマー。本発明の明細書において、両ポリマーを水と混合するとき
、２つの水相が形成され得るならば、１のポリマーは他のポリマーと不適合であ
ることをいう。当該定義にはまた、第１のポリマーが一方の相において優勢的に
生じ、第２のポリマーが他方の相に優勢的に生じることを含む。
【００１４】 ミセル形成および非ミセル形成ポリマー 熱分離性ポリマーのミセル形成特性は、ポリマー濃度が純水およびポリマーか
らなる溶液中で変化するとき、曇点変化に反映する。図１参照：Breox PAG 50A
1000(International Speciality Chemicals Lt, Southampton, U.K.)が僅かに凹
状に湾曲し、実験で使用したＨＭ−ＥＯＰＯポリマーが激しく凹状に湾曲してい
ることは、Breoxがミセルを形成せずＨＭ−ＥＯＰＯポリマーがミセルを形成す
ることを部分的に反映している。単純性のため、および本発明の好ましい様式の
文書において、ミセル形成熱分離性ポリマーは、ＬＣＳＴの濃度に対して水と混
合し、この温度を低温から高温に温度上げるとき、２つの相(その両方は、少な
くとも７０％、８０％程の水濃度を有する)を得ることができるポリマーである
。これらポリマーの多くは、ＬＣＳＴで明白な最小を示す。ＨＭ−ＥＯＰＯポリ
マー(ミセル形成)のカーブを図１のBreox(非ミセル形成)と比較する。非ミセル
形成ポリマーは、ミセル形成ポリマーの定義とは対応しない水溶性／水混和性ポ
リマーである。上記および下記のパーセンテージの値は、特記しなければ、ｗ／
ｗに基く。
【００１５】 非ミセル形成ポリマーは、通常、ミセル形成ポリマーと非親和性であり、この
ため非ミセル形成ポリマーはしばしば水とミセル形成ポリマーの混合物に対して
曇点低下試薬として作用し、そして逆に、水と非ミセル形成ポリマーの混合物に
ミセル形成ポリマーを導入しても同様に作用する。
【００１６】 本発明 上記定義のようにミセル形成する熱分離性ポリマーを選択した場合に上記考察
した目的に直面することが、現在知られている。したがって、本発明は、予め決
定した化合物の分離の方法であって、 ｉ)少なくとも相の１つが熱分離性ポリマー(Ｉ)を多く含んでおり(相１)、他の
相が少し含んでいる(相２)、２相システム(システムＡ)において化合物を分配す
ること、 ii)当該化合物を含む１つの相(相１または相２)を回収すること、 iii)必要ならば、ステップiiで回収した相から当該化合物を単離すること、 を含む方法に関する。
【００１７】 当該方法の特徴は、 ａ)ポリマー(Ｉ)は、ミセル形成熱分離性ポリマーであること、そして ｂ)相２が、熱分離性ポリマー(Ｉ)の曇点低下性の試薬、例えばポリマー(Ｉ)に
不適合なポリマー(II)または塩を含み得ること、 である。
【００１８】 ポリマー(II)は、通常の場合、相２に優勢に存在する。
【００１９】 ２相システムは、１つまたはそれ以上の更なる水溶性ポリマーを含む更なる水
性液体相を含む多相システムの一部となり得る。
【００２０】 一方の相がポリマーを多く含み、他方の相がポリマーを少し含んでいるという
表現は、一方の相が他方よりもポリマーを多く含む(しばしば５倍よりも多い)と
いうことのみをいう。
【００２１】 ２相は、分離される化合物を含むサンプルを含む必要な成分をシステムの曇点
よりも低い温度で予め混合し、次いで、システムの曇点を超える温度に増加する
ことにより、得られ得る。他には、最終システムの上記曇点を超える温度で所定
の２相システムの成分を混合する。
【００２２】 ポリマーの再利用 相のポリマーは、当該方法の第２回目のステップ(ｉ)において、それぞれ、ポ
リマー(Ｉ)およびポリマー(II)として再利用され、使用される。これは、有意な
量の分離されるべき化合物および／または他の望ましくない成分を含まない場合
に、直接相の再利用により、行われ得る。他に、更なる分離ステップを実施する
ことが好ましい。 例えば、 ・ポリマー(Ｉ)：相１は、例えば、水および／または１つもしくはそれ以上の曇
点低下剤を添加することにより、および／または形成され相１を基礎とする相シ
ステムの曇点よりも高い温度に上げることにより、第２の相分離ステップに付さ
れる。この相分離ステップは、相１：１(ポリマー(Ｉ)を多く含む)および相１：
２(ポリマー(Ｉ)を少し含んでいる)を生じる。必要ならば、ステップ(ｉ)で分離
されるべき成分を分配に向かわせることができる、および／または望ましくない
成分を相１：２に向かわせることができる、緩衝性物質および物質を加える。次
いで、望ましいならば、相１：１は、あるいはポリマー(Ｉ)に関し更なる富化の
後、再利用され得る。 ・ポリマー(II)：ポリマーIIが熱分解性ポリマーである場合、相１と同じ原理を
相２の再利用に適用し得る。例えば、水および／または曇点低下試薬を加え、或
いはその後、ポリマー(II)中に一方の多く含む相および一方の僅かに含む相への
相２の分離を行うために(それぞれ、相２：１および相２：２)温度を上げ得る。
望ましいならば、相２：１は、再び再利用され、当該方法の第２回目のステップ
(ｉ)において、ポリマー(II)として使用し得る。ポリマー(Ｉ)および／またはポ
リマー(II)が再利用される場合、第２回目のステップ(ｉ)においてシステムＡに
更なる量の各ポリマーを供する必要がある。
【００２３】 熱分離性ポリマー(Ｉ)(ミセル形成ポリマー) システムＡのポリマー(Ｉ)の総量は、通常、ほぼ５０％である。本発明の最も
重要な利点の１つは、ポリマー(Ｉ)の我々の選択が２０％未満、さらに１０％未
満(ｗ／ｗ)の濃度とし得ることである。
【００２４】 有用なミセル形成熱分解性ポリマーは、９０℃以下、好ましくは５０℃以下、
例えば４０℃以下または２０℃以下であるＬＣＳＴを典型的に有する。オリゴ−
またはポリペプチド構造を有するタンパク質および他の化合物は、しばしば、熱
感受性であり、そのため、４０℃以下または２０℃以下のＬＣＳＴを有するポリ
マーが必要となる。他方では、脂質または炭化水素を有する化合物は、しばしば
、より熱に安定であり、９０℃までまたはそれよりも高いＬＣＳＴを有するミセ
ル形成熱分離性ポリマーの使用を可能である。より低いＬＣＳＴを有するポリマ
ーは、実質的な理由(加熱の必要が少ない)のためにより高いＬＣＳＴを有するポ
リマーに好ましい。
【００２５】 適当なポリマーの選択は、試験することにより、例えば、上記のような曇点を
有する熱分解性ポリマーを純水と混合し、種々のポリマー濃度の曇点を決定し、
図１に示し相当する実験部分で述べられるような相の図を構成することにより、
行うことができる。
【００２６】 試験されるべきポリマーの初期選択は、既知熱分解性ポリマー、例えば、Gala
evら(Enzyme Microbiol. Technol. 15 (1993) 354-366)により得られるものの中
に存在する多くの構造を含む水溶性の熱分解性ポリマー群であり得る。
【００２７】 本発明に適当なミセル形成ポリマーの鍵となる特徴は、同一または異なる親水
性モノマー単位からなる中央ポリマー部分であり、末端がそれぞれ疎水性基から
なることであると考えられている。親水性モノマー単位(炭素、水素および酸素
原子のみを含む)は、酸素原子数と炭素原子数との間で、少なくとも１／４、好
ましくは少なくとも１／３となる割合を示す。疎水性末端基(酸素、炭素および
水素原子を含む)は、酸素原子数と炭素原子数との間で、多くとも１／５の割合
を示す。親水性および疎水性基の他の型の場合、同様の法則が親水性および疎水
性についてそれぞれ適用される。
【００２８】 ポリマーの中央部分は、直線状であるかまたは分枝状の鎖であり得る。中央部
分は、多くの異なるまたは同一のサブユニットからなり、それぞれは、親水性モ
ノマー単位の直鎖と、他のサブユニットと２価架橋(divalent bridge)(サブユニ
ット部分ではなく全体でポリマーに水不溶性を付与するわけではない)で結合す
る各サブユニットでできている。当該架橋は、直線状、分枝状または環状の２価
Ｃ２−６−炭化水素基、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｏ−、−
Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＲ１−、−ＣＯＯ−、−ＮＲ２Ｒ３−、−ＳＯ２Ｎ
Ｒ１−、−ＯＣＯ−、−ＮＲ１ＣＯＮＲ２−、−ＮＲ２ＣＯＯ−[式中、Ｒ１−
３は、水素、ならびに１−１２炭素原子を含む低級炭化水素、例えばＣ１−１２ −アルキル、−アリールアルキルおよび−アルキルアリールから選択される]か
ら選択される１つまたはそれ以上の構造エレメントを含み得る。
【００２９】 好ましい変形物では、モノマー単位は、例えば、ランダムまたはブロックコポ
リマーのような、またはホモ重合体のような、ポリマー(Ｉ)の中央部分かサブユ
ニット(それぞれ、ランダムまたはブロックＥＯＰＯポリマー)の何れかのような
、エチレンオキシドおよび直線状または分枝状プロピレンオキシドから選択され
る。
【００３０】 疎水性基は、同一であっても異なっていてもよい。それらは、例えば、１−４
の炭素原子が、上記で架橋連結サブユニットとして与えられた任意の構造性エレ
メントで置換された、１０−３０ＳＰ３−混成炭素原子を含む炭化水素基群から
選択され得る。
【００３１】 適当なポリマーの合成がＥＰ２６０４３０に記載されている。
【００３２】 ポリマーの水溶液用の曇点低下試薬 この試薬は、一方または両方の相(水溶性)に溶解できる塩、または非ミセル形
成および／またはポリマー(Ｉ)に非適合であり、相２中に主に存在する第２ポリ
マー(II)であり得る。また、低分子量水溶性非イオン性化合物は、曇点低下剤と
して作用し得る。
【００３３】 適当な塩は、塩化物、臭化物、酢酸、リン酸(ＰＯ４ ３−；ＨＰＯ４ ２−；Ｈ
２ＰＯ４ −)、硫酸(ＳＯ４ ２−)などの水溶性のナトリウム、カリウムおよびア
ンモニウム(Ｒ４Ｒ５Ｒ６Ｒ７Ｎ＋、この場合、Ｒ４−７は、水素、ならびにＣ
１−３０アルキル、アリール、アラルキルおよびアルキルアリール(alkaryl))塩
から選択され得る。
【００３４】 ポリマー(II)は、例えば、低いミセル形成傾向を有することにより、ポリマー
(Ｉ)に不適合であるポリマーから選択され得る。例は、セルロース、デキストラ
ン、デンプンなどのようなポリサッカライドであり、それは、必要ならば、末端
を生ずることなくエチレンオキシドとプロピレンオキシドの間でランダムまたは
ブロックコポリマー、ポリエチレングリコールを適当に誘導および／または断片
化し得る。ポリマー(II)は、例えば、Galaevら(Enzyme Microb. Technol. 15 (1
993) 354-66)により得られたもののから選択される、ポリマー(Ｉ)に不適合であ
る熱分離性ポリマーであり得る。登録商標Breox、UconおよびPluronicsで販売さ
れているポリマーについての上記考察もまた参照。
【００３５】 ポリマー(II)の熱分離性形の水溶液のための曇点低下試薬は、ポリマー変形型
がポリマー(II)に不適合性であることを除き、ポリマー(Ｉ)と同じ系列に沿って
選択され得る。
【００３６】 曇点上昇試薬 例は、脂肪族アルコールであり、荷電界面活性剤などである。この型の試薬は
、通常、システムの曇点を上げるために加えるのではなく、それらが有する幾つ
か他の性質を利用するために加えられる。例えば、荷電界面活性剤が、分離され
るべき化合物の特定相への好ましい分配に使用され得る。
【００３７】 種々の相の間で分離されるべき化合物を向かわせる方法 化合物の分配は、化合物の電気的荷電に依存し得る。荷電がｐＨ依存の場合、
相システムのｐＨは、発明の方法のステップ(II)で回収される相への化合物の最
大分配を達成するように調節され得る。ｐＨ依存荷電を有し得る化合物の実例は
、オリゴ−またはポリペプチド構造を示す化合物である。
【００３８】 分配係数は、温度に依存する。そのため、温度は、当該方法のステップ(II)で
回収される相への化合物の最大分配が達成されるように変化され得る。
【００３９】 ステップ(II)で回収される相への最大分配を達成するための第３の要因(third
alternative)は、化合物との結合能を有し、それゆえ、ステップiiで回収され
る相中へ分離される(改善された分配)化合物を安定化する物質を相システム中に
組み込むことである。実例は、界面活性剤および塩である。
【００４０】 最大分配には、ｐＨ、温度および／または分離されるべき化合物と結合する物
質を、最適または最大量の化合物が望ましい相に分配されるように適用させるこ
とが含まれる。結合している物質の場合、これには、型および量が含まれる。
【００４１】 分離されるべき化合物が、電気的に荷電している場合、その分配は、存在する
対イオンの型に依存する。可溶性塩の添加は、しばしば、システムの対イオンプ
ロファイルを変化させ、そのため、また分離されるべき化合物の分配を変化させ
得る。
【００４２】 分離されるべき化合物が陽性に荷電している場合、比較的大きい(低濃度の荷
電)陰イオンを含む塩は、より疎水的な相、この場合相１(ポリマー(Ｉ)中に多く
含まれる)への分配を改善し得る。典型例は、ハリドイオン(Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ − など)、ＳＣＮ−、ＣｌＯ４ −および例えばカルボン酸陰イオン基、スルホン
酸陰イオン基(例えばドデシルスルホン酸)、スルホン酸陰イオン基、ホスホン酸
陰イオン基、リン酸陰イオン基を含む陰イオン性界面活性剤を含む塩である。
【００４３】 分離されるべき化合物が陰性に荷電している場合、比較的大きい(低濃度の荷
電)陽イオンを含む塩は、より疎水的な相への分配を改善し得る。典型例は、一
般式Ｒ４Ｒ５Ｒ６Ｒ７Ｎ＋[式中、Ｒ４−７は、例えば、水素ならびにＣ１−３
０アルキル、アリール、アラルキルおよびアルキルアリールから選択され得る]
の陽イオンを含むアルキルアンモニウム塩である。アンモニウム成分は、第一級
、第二級、第三級または第四級アンモニウムイオン、例えばセチルトリエチルア
ンモニウム、ドデシルトリエチルアンモニウム、トリエチルアンモニウムおよび
他の陽イオン界面活性剤であり得る。
【００４４】 最も低濃度の熱分離性ポリマー(Ｉ)(＝相２)を有する相への荷電化合物の分配
を改善したい場合、分離されるべき化合物に対し可能性ある対イオンが少量であ
り、高濃度の荷電を有する水溶性塩を選択すべきである。この場合、陽性荷電化
合物の分離に使用する典型的な塩は、ＰＯ４ ３−、ＨＰＯ４ ２−、Ｈ２ＰＯ４ − 、ＳＯ４ ２−、ＡｃＯ−のような陰イオンを含み、陰性荷電親水性ポリマーは、
例えば、デキストラン、デンプンおよびカルボン酸基、スルホン酸基、サルフェ
ート基、ホスホン酸基、リン酸基のような陰イオン含有基を含む。この場合、陰
性荷電化合物の分離に使用される典型的な塩は、陽イオンが第一級、第二級、第
三級および／または第四級アンモニウム基(−＋ＮＲ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４[式中、Ｒ１ −４ は、ＨおよびＣ１−１２アルキル基、好ましくはＨまたはあるＣ１−１２ア
ルキル基から選択される])を示す親水性ポリマーである塩である。
【００４５】 また他の型の化合物は、望ましい相への分配を改善するために添加され得る。
典型例は、分離されるべき化合物に対する親和性対応物であり、その対応物は、
例えば、ポリマー、または界面活性剤のような相に優先性を有する任意の他の成
分への共有結合により、望ましい相への改善された分配を有するように誘導され
る。
【００４６】 ステップ(ii)で回収される相および更なる処理 この相は、添加成分がどのように選択されるかに依存する相１または相２の何
れかであり、この結果は、分離されるべき化合物の分配で生ずる。特定の環境下
では、例えば、粗開始サンプルが異なる相に優先性を有する２つの望ましい化合
物を含むとき、相１および相２の両方が回収され、更に処理される。
【００４７】 本目的が、純水型でステップ(ｉ)で分離される化合物である場合、ポリマー(
ポリマー(Ｉ)またはポリマー(II)のいずれか)中の少ない相、すなわち水相中に
化合物が存在するため相システムの成分を選択することが、しばしば有利点とな
る。これは、当該化合物を相２へ向かわせることを意味し、この場合、相２：２
または相１：２に対しポリマー(II)中に多く含まれる。これを達成するため、上
記と同じ原理が、ポリマー(Ｉ)および／またはポリマー(II)の再利用を伴うかま
たは伴わずに適用され得る。
【００４８】 ステップ(ｉ)で回収される相へ分離される化合物は、さらに、例えば、更なる
２相分離(例えば上記概要のように)により、電気泳動、液体クロマトグラフィー
(イオン交換、生体親和性などのクロマトグラフィー)、沈殿、密度勾配遠心分離
、抽出などにより処理され得る。
【００４９】 本発明は、ここでは、優先日に意図された最善の様式を提供する実験部分によ
り解説される。
【００５０】 実験部分 物質および方法 物質：使用するＨＭ−ＥＯＰＯポリマーは、ジイソシアン酸イソホロンの各イ
ソシアネート基を有する各鎖の一端基の反応から誘導される中央基に隣接するエ
チレンオキシドおよびプロピレンオキシド鎖のランダムコポリマーである。残り
の端の両方には、Ｃ１４Ｈ２９アルキル基が存在する。合成の場合、ＥＰ２６０
４３０参照。使用するポリマーの分子質量は、約７５００−８０００Ｄａであっ
た。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーは、Akzo Nobel, Stenungsund, Swedenから得た。
脂肪酸遊離ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)は、Boehringer Mannheim, Mannheim, G
ermanyから得、ニワトリの卵のリゾチームは、Sigma Chemicals Co, St Louis,
MO, U.S.A.から得た。精製されたアポリポタンパク質Ａ−１は、Pharmacia & Up
john, Stockholm, Swedenから頂き、それは、組換え体変異体、Milanoであり、
通常のモノマー型とは対照的な二量体である(Persson et al., J. Chromatog. 7
11 (1998) 97-109)。すべての塩は、分析用の品質である。Millipore水をすべて
の溶液に使用した。リン酸トリエチルアンモニウムのストック溶液を、リン酸を
トリエチルアンモニウムに滴下することにより調製した。トリエチルアンモニウ
ムリン酸塩溶液塩は、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートと略する。ヒトの血漿およびE.
coli抽出物はPharmacia & Upjohn, Stockholm, Swedenから頂いた。ヒトの血漿
は、通常のモノマー型のアポリポタンパク質Ａ−１を含んでいた。
【００５１】 相の図 ポリマー濃度に対する温度の相の図を、異なる温度でシステムを分離し、相の
上部および下部、それぞれのポリマーの濃度を測定することにより作成した。ポ
リマー濃度は、屈折率の測定により決定した。屈折率測定器は、Carl Zeiss, Ob
erkochen/Wuertt., Germanyであった。屈折率測定は、４℃で行った。
【００５２】 当該システムの曇点は、水浴中でマグネットスターラーで攪拌しながら一方の
相を加熱することにより決定した。曇点は、溶液が濁り出す温度とした。加熱速
度は、１℃／分未満であった。
【００５３】 塩分配の研究 塩の分配は、タンパク質遊離システムにおける伝導率測定で測定した。ポリマ
ー濃度は４％(ｗ／ｗ)であり、システム中の塩濃度は５０ｍＭであった。Ｎａ−
ホスフェートを含む当該相システムは、２２℃で分離し、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェ
ートおよびＮａＣｌＯ４を有するシステムは、２７℃で分離した。ｐＨ７のＮａ
−ホスフェートおよびＥｔ３ＮＨ−ホスフェートは陰イオンＨ２ＰＯ４ −および
ＨＰＯ４ ２−を含む。当該サンプルを、水浴中で一晩静置し、分離した。使用す
る伝導率測定器はMetrohm 644 (Herisan, Switzerland)であった。すべてのシス
テムについて２つ調製し、平均値をとった。
【００５４】 タンパク質分配試験 純粋ＢＳＡ、リゾチームおよびアポリポタンパク質Ａ−１の分配の全ての実験
において、塩濃度は５０ｍＭであり、緩衝液濃度は１０ｍＭであった(リン酸ナ
トリウムｐＨ７.０)。リン酸ナトリウムを本システム中で塩として使用したとき
、総ホスフェート濃度は６０ｍＭであった(即ち５０ｍＭ塩＋１０ｍＭ緩衝液)。
ポリマー濃度は４％(ｗ／ｗ)であり、タンパク質濃度は１ｍｇ／ｍｌであった。
８ｇシステムを調製し、０−４℃で注意深く混合した。これらの温度で全てのシ
ステムは１相であった。冷システムの各々から７ｇを回収し、目盛り付ピペット
に入れ、それの上下をパラフィルムで密封した。システムが入ったピペットを必
要な溶液温度の水浴に浸した。最初にシステムを試験温度で平衡化し、再混合し
、分離した。システムを２−３時間放置した。上部および底部相の容量を読んだ
。相を注意深く分離し、分析した。全てのシステムのデュプリケートを調製した
。
【００５５】 ヒト血漿からのアポリポタンパク質の精製 熱分離性ポリマーを血漿に純粋成分として添加した。システムの総質量は６.
０ｇであり、４％(ｗ／ｗ)ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーおよび３ｇヒト血漿を含んだ
。あるシステムには１００ｍＭ ＮａＣｌＯ４を添加した。システム中の総タン
パク質濃度は１５ｍｇ／ｍｌであった。システムのｐＨは、２２℃で混合システ
ムで測定して７.８であった。システムを２６℃で８０分、水浴中で分離した。
【００５６】 E. coli抽出物からのアポリポタンパク質の精製 組換えアポリポタンパク質Ａ−１、変異型MilanoをE. coli発酵で発現させた
。アポリポタンパク質Ａ−１はペリプラズム空間に運搬され、続いて発酵ブロス
中に得られた。細胞を凝集および続く遠心により除去した。アポリポタンパク質
Ａ−１を含む上清を、１００００Ｍｒカットオフの膜を使用した限外濾過で８倍
に濃縮した(Persson et al., J. Chromatog. 711 (1998) 97-109)。限外濾過後
のアポリポタンパク質の濃度は２.５ｍｇ／ｍｌであった(Bradford (Anal. Bioc
hem. 72 (1976) 248-254)にしたがって決定)。このE. coli抽出物中の緩衝液は
２０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡおよび０.１％ Tween 80であった。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー水システムに
おける精製を、７.０ｇシステムで行った。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー濃度は４％(
ｗ／ｗ)であり、E. coli抽出物１.０ｇを３.７ｇの上記緩衝液に加えて添加した
。システム中の総タンパク質濃度は４ｍｇ／ｍｌであり、アポリポタンパク質Ａ
−１濃度濃度０.４ｍｇ／ｍｌであった。システムのｐＨは混合システムで測定
して７.５であった。
【００５７】 タンパク質および酵素測定 相システムにおける純粋タンパク質の測定を、１ｇサンプルと、サンプルにお
ける熱分離を予防する１ｍｌ ５０％(ｖ／ｖ)メタノールの混合により行った。
この混合物のタンパク質濃度は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度で測定した。リゾチー
ムをShugar(Shugar, Biochim. Biophys Acta 8 (1952) 302-)にしたがった活性
測定により測定した。使用したスペクトロフォトメーターはUV-2101 PC(島津株
式会社、京都、日本)であった。分配係数はＫ＝Ｃｔ／Ｃｂ(式中、ＣｔおよびＣ ｂ は各々上部および底部相のタンパク質濃度である)である。システムのｐＨは
分離後除去した上部相で測定した。
【００５８】 ヒト血漿からアポリポタンパク質Ａ−１を精製したとき、タンパク質の分配は
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での上部および底部相の分析により定量的に測定した。Phas
t System(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を使用し、ゲルは均
質２０％ＳＤＳゲルであった。ゲルをCoomassie R350で染色し、濃度計での走査
により分析した(Personal Densitometer SI, Molecular Dynamics, Sunnyvale,
Ca, U.S.A.)。
【００５９】 E. coli抽出物を分配したときのアポリポタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡで測
定した(Persson et al., J. Chromatog. 711 (1998) 97-109)。ビオチン抗体接
合体を使用し、更に、アルカリフォスファターゼ結合したアビジンに結合させた
。アルカリフォスファターゼをマーカーとして使用し、吸収を４０５ｎｍで測定
した。
【００６０】 収率を： 収率＝(Ｃｔ Apo×Ｖｔ)／(ＣApo×Ｖ) (式中、Ｃｔ Apoは上部相中のアポリポタンパク質Ａ−１の濃度およびＶｔは上部
相の容量、ＣApoは出発物質中のアポリポタンパク質Ａ−１の濃度およびＶはシ
ステムに添加した物質の容量である) として計算した。システムにおけるアポリポタンパク質の精製係数は： 精製係数＝(Ｃｔ Apo／Ｃｔ)／(ＣApo／Ｃ) (式中、Ｃｔは上部相中のタンパク質濃度およびＣは出発物質中のタンパク質の
濃度である) として計算した。
【００６１】 結果 水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステム 水／ＥＭ−ＥＯＰＯポリマー(■)および水／Breox PAG 50A 1000システム(●)
に関する温度対ポリマー濃度相ダイアグラムを図１に示す。相分離は温度の上昇
により誘導する。共存曲線の上で溶液相は二つの肉眼で見える相に分離する。形
成された層は両方とも水性であり、一つはポリマーに富み、他方はポリマーが少
ない(図１)。共存曲線の最小である低臨界点は３％ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーおよ
び１４℃である。数個の試験された熱分離性水／ポリマーシステムとは異なり(S
aeki et al., Polymer 17 (1976) 685-; Karlstroem, J. Phys. Chem. 89 (1985
) 4962-; Johansson et al., Macromolecules 26 (1993) 4478-; およびNystroe
m et al., Langmuir 11 (1995) 1994-2002)、水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシス
テムは相分離のポリマー濃度への強い依存性を示し、即ち、共存曲線が明白な凹
状上部形を有する。ポリマー富化相はＥＯおよびＰＯの他の熱分離性ランダムコ
ポリマーと比較して、高濃度の水を含む(Johansson et al., Macromolecules 26
(1993) 4478-; およびJohansson et al., Biochim. Biophys Acta 1290 (1996)
)。１７から３０℃の間で、ポリマー富化相中のポリマー濃度は５−９％であり
、水相中でポリマー濃度は１％以下である。水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステ
ムは先に試験された熱分離性水／Ｕｃｏｎシステムよりも、より高い粘性を示す
。ポリマーの相対的に高い粘性は、注意深い混合および長い平衡時間を必要とす
る。試験した全てのシステムにおいて、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相は下部相であ
り、水相は上部相であった(図２および図３)。
【００６２】 塩分配 全ての試験した例において、塩は水相に強く分配し、Ｋは１以上であった。塩
の分配係数はＮａ−ホスフェート(Ｋ＝１.３８)からＥｔ３ＮＨ−ホスフェート(
Ｋ＝１.２７)およびＮａＣｌＯ４(Ｋ＝１.１８)で減少した。ＨＭ−ＥＯＰＯポ
リマー相はより疎水性の相であり、塩の相対的疎水性は低い分配係数で増加する
。これは、試験した塩でＮａＣｌＯ４が最も疎水性であり、Ｎａ−ホスフェート
が最も親水性であることを示す。
【００６３】 タンパク質の分配における異なる塩の効果 上記の方法において記載した組成のシステムに関して、ＮａＣｌＯ４含有シス
テムの曇点は１４℃、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェート含有システムは１３℃およびリ
ン酸ナトリウム含有システムは９℃であった。ＮａＣｌＯ３およびＥｔ３ＮＨ−
ホスフェート含有システムを２６℃で分離した。リン酸ナトリウム含有システム
を２２℃で分離した。各システムを曇点の約１３℃上で分離した。これを行うこ
とにより、システムは臨界点から同じ距離になり、相の容量比は非常に類似とな
った。したがって、相は比較可能になった。このセクションにおいて、全ての分
配試験はｐＨ７.０で行った。
【００６４】 ａ)陰性に荷電したアポリポタンパク質Ａ−１、ｐＩ５.６−５.７(Brouillette
et al., Biochom. Biophys. Acta 1256 (1995) 103-109)は、Ｋ値０.０２以下で
ポリマー富化相に強く分配した。最強の分配がシステムにおけるＥｔ３ＮＨ−ホ
スフェートで得られた(Ｋ＝０.００５)。ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相への最も弱
い分配は、システムにおけるＮａＣｌＯ４で得られた。
【００６５】 ｂ)陰性に荷電したＢＳＡ、ｐＩ５.０(Righetti et al., J. Chromat. 220 (198
1) 115-194)は、アポリポタンパク質Ａ−１と比較してより水相に分配した。Ｎ
ａＣｌＯ４含有システムが、水相への最も強い分配を提供した。Ｅｔ３ＮＨ−ホ
スフェートとリン酸ナトリウム含有システムの間の分配係数は僅かな差しかなか
った。
【００６６】 ｃ)リゾチーム、ｐＩ１１.０(Righetti et al., J. Chromat. 220 (1981) 115-1
94)は、ＮａＣｌＯ４が存在するとき、ポリマー富化相に最も強く分配した(Ｋ＝
０.６)。ポリマー富化相への優勢は、しかし、この場合、アポリポタンパク質Ａ
−１よりも弱かった。ＢＳＡの場合には、塩Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートとリン酸
ナトリウムは同様の分配係数を提供し、リゾチームは水に分配された。酵素活性
の有意な損失はこれらのシステムで見られなかった。上部および底部相で一緒に
記録されたリゾチーム活性は、ＮａＣｌＯ４、Ｅｔ３ＮＨ−ホスフェートおよび
Ｎａ−ホスフェートシステムで１０２、１０３および１０３％であった。
【００６７】 分配における異なる層分離温度の効果 温度は相中のポリマー濃度に強く影響する(図１参照)。結果は、アポリポタン
パク質Ａ−１の分配係数が、温度によりどのように変化するかを示す。システム
組成は４％(ｗ／ｗ)ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー、６０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ
７.０、およびアポリポタンパク質Ａ−１の濃度は１.０ｍｇ／ｍｌであった。ア
ポリポタンパク質Ａ−１は試験した全ての温度でポリマー富化相に優勢であった
。ポリマー富化相への最も強い分配がＫ値０.０２で２２から３２℃の間で得ら
れた。４０℃を越えてもタンパク質はまたポリマー富化相に分配したが、強度は
低かった(５０および６０℃でＫ＝０.５−０.６)。
【００６８】 ＢＳＡの分配におけるｐＨの効果 これらの実験におけるシステムの組成は４％(ｗ／ｗ)ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー
、１００ｍＭ ＮａＣｌＯ４、１０ｍＭ緩衝液および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡであ
った。使用した緩衝液はクエン酸ナトリウム(ｐＨ３.０)、酒石酸ナトリウム(ｐ
Ｈ５.０９およびリン酸ナトリウム(ｐＨ６.０および７.０)であった。分離後に
上部相で測定したｐＨ値は各々３.３、４.３、５.０および６.０であった。非荷
電(ｐＨ５.０)および陰性荷電(５.０を越えるｐＨ)ＢＳＡは、水相により分配し
た。ＢＳＡの等電点以下の分配係数の劇的な減少があった、ｐＨ＝５.０でＫ＝
１.９、ｐＨ４.３でＫ＝０.０３およびｐＨ３.３でＫ＝０.０１。異なる塩の低
いｐＨでの効果を比較するために、唯一の塩としてＮａ−ホスフェート(１００
ｍＭ)を有する水／BermodolシステムにおけるＢＳＡの分配を行った。ｐＨは４.
３であり、このシステムのＫ値は１.２±０.１であった。したがって、フォスフ
ェートからＣｌＯ４ −へのアニオンの変化は、ポリマー富化相への非常な分配を
もたらした。
【００６９】 逆抽出 ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相から水相への逆抽出の技術を純粋アポリポタンパク
質Ａ−１で試験した(図２の原理参照)。このタンパク質を４％ＨＭ−ＥＯＰＯ−
水システムに分配し、２７℃で分離した。システム中の塩および緩衝液は２０ｍ
ｍ Tris−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１５０ｍｍ ＮａＣｌｍ１０ｍＭ ＥＤＴＡお
よび０.１％ Tween 80であった。アポリポタンパク質Ａ−１は、２７℃でＨＭ
−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配した(Ｋ＝０.０１５±０.００５)。９６±のア
ポリポタンパク質Ａ−１がこの相で検出された。上部水相を回収し、等量の１０
ｍＭ Tris−Ｈｃｌ緩衝液ｐＨ８.５および１００ｍＭのＮａＣｌＯ４と交換し
た。システムを混合し、再び５０℃で２０分分離させた。この処理の後、先にＨ
Ｍ−ＥＯＰＯポリマー相に分配していたタンパク質の９４±１％が、新規水相に
分配係数Ｋ＝４.０±１.０で逆抽出された。したがって、タンパク質の総回収は
９０±１％であった。
【００７０】 ヒト血漿からのアポリポタンパク質の精製 ヒト血漿を、水／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーシステム中での分配によるアポリポ
タンパク質Ａ−１の単離のためのタンパク質溶液として使用した。１００ｍＭ
ＮａＣｌＯ４の添加をしたシステム、および余分の塩を添加しなかった他のシス
テムを試験した。アルブミン、ｐＩ４.８(１８)はヒト血漿で優位なタンパク質
であり、ヒトアルブミンはＢＳＡと非常に類似した分配行動を有すると予期され
た。したがって、ＮａＣｌＯ４を直接水相のアルブミンに添加した。相分離を２
６℃で８０分行った。
【００７１】 ゲル電気泳動からの結果は、アポリポタンパク質Ａ−１が殆ど排他的にポリマ
ー富化相に分配され、アルブミンは水相に優勢に分配されたことを示す。ＮａＣ
ｌＯ４の添加ありまたはなしのシステムで比較したとき、総タンパク質の分配に
殆ど変化はなかった、各々Ｋ＝５.６±０.５およびＫ＝４.７±０.５。アポリポ
タンパク質Ａ−１に関して、対応する分配係数は各々０.０９±０.０１およびＫ
＝０.０８±０.０１であった。約７の精製係数が、アポリポタンパク質Ａ−１の
、水／ＥＭ−ＥＯＰＯシステムにおけるＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相への抽出によ
り達成された。
【００７２】 E. coli抽出物からのアポリポタンパク質の逆抽出による精製 E. coliの無細胞発酵溶液からの組換えアポリポタンパク質の精製を試験した
。E. coli抽出物を４％水／ＥＭ−ＥＯＰＯポリマーシステムに分配した。シス
テムにおいて、２０ｍＭ Tris−ＨＣｌ ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、
１０ｍＭ ＥＤＴＡおよび０.１％ Tween 80を使用した。システムを６０分、
３０℃で水浴中で２相に分離させた。表４において、第１の抽出システムにおけ
るアポリポタンパク質の分配係数を示し、Ｋ＝０.０４±０.０１である。アポリ
ポタンパク質はＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配し、より親水性の汚染タン
パク質は、水相に分配された。アポリポタンパク質Ａ−１は、ＨＭ−ＥＯＰＯポ
リマー相への分配により約７倍(７±２)精製され、この相からのタンパク質の回
収は９５％以上であった。
【００７３】 純粋アポリポタンパク質Ａ−１のために開発された逆抽出の技術を、E. coli
抽出物からのアポリポタンパク質Ａ−１の精製に使用した。アポリポタンパク質
Ａ−１をＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に抽出し、汚染タンパク質を水相と共に除去
した。Tris−ＨＣｌ ｐＨ８.５および１００ｍｍ ＮａＣｌＯ４を含む新しい
水相を添加した(図２参照)。５０℃での熱分離の後、アポリポタンパク質Ａ−１
は、水相にＫ＝６.０±１で抽出された。逆抽出は９５％以上の収率で、７±２
の精製係数で行うことができた。アポリポタンパク質Ａ−１の総回収は９０％以
上であった。
【００７４】 ２ポリマー２層システム 分離実験において、水、ＨＭ−ＥＯＰＯおよびBreox PAG 50A(International
Speciality Chemicals Ltd, Southhamptoin, U.K.)から形成される２層システム
を試験した。Breox PAG 50A 1000は等量のエチレンオキサイドおよびプロピレン
オキサイドのランダムコポリマーであり、相対的に高い曇点(１０％濃度でＬＣ
ＳＴ５０℃)を有する。温度をコポリマー曇点以上に上げることにより、両方の
コポリマーを相分離することが可能である。図３参照。ＰＥＧ／デキストランシ
ステムと比較して、相対的に低い濃度のコポリマーが２層の形成に必要である(
各コポリマー２％(ｗ／ｗ))。Breox／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーから成る水性２相
システムは、タンパク質の分離に使用できる。ＢＳＡとリゾチームの分離は、Ｐ
ＥＧ／デキストランシステムと類似の方法における塩添加により指示できる。両
親媒性アポリポタンパク質Ａ−１はＨＭ−ＥＯＰＯポリマーにより形成されたミ
セルと相互作用し、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配する。上部Berox相お
よび底部ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相の熱分離後、水溶液中のタンパク質の回収お
よびコポリマーの再利用が可能である。熱分離後、９７.５％のＨＭ−ＥＯＰＯ
ポリマーおよび７３％のBeroxコポリマーが回収できた。アポリポタンパク質Ａ
−１は、無細胞E. coli発酵溶液からＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に抽出できた。
再利用コポリマーのシステムは、３つのポリマー再利用の間、類似の精製係数を
示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】 水／ＨＭ−ＥＯＰＯシステム(●)および水／Berox ＰＡＧ 50A 1
00(■)に関する実験的に測定した相ダイアグラム。
【図２】 水／ポリマー水性２相システムにおけるタンパク質精製。標的タ
ンパク質(白色点)をポリマー相(ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー)にポリマーの曇点を越
える温度(ＣＰＴ、１４℃)で分配する。汚染タンパク質(黒色点)は主に水相に分
配する。相を分離し、逆抽出のために新規水相をポリマー相に添加する。ｐＨ(
および／または塩)を変え、熱分離を第１抽出よりも高い温度で行う。標的タン
パク質は水相に逆抽出し、ポリマーは再利用される。
【図３】 熱分離性ポリマーを有する水性２相システムにおけるタンパク質
分離およびポリマーの再利用。最初に、ポリマーBreox PAG 50A 100およびＨＭ
−ＥＯＰＯポリマーから成る水性２相システムを混合する。相分離後、上部Breo
oxおよび底部ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相を単離し、ポリマーの曇点を越える温度
の水浴に移す。これは水相およびポリマ富化相の形成を導く。水相の回収後、ポ
リマーを回収し、新規水性２層システムに再使用できる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１月８日（２００１．１．８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】 種々のＥＯ／ＰＯ比を有する有するポリマーの相システムが、タンパク質の分
離において研究されてきた(Harris et al., Biosep. 2 (1991) 237-246; Alred
et al., J. Chromatogr. 659 (1994) 289-298; Persson et al., J. Chromatogr
. 711 (1998) 97-109; Berggren et al., J. Chromatogr. A 718 (1995) 67-79;
Johanssson et al., Biochim. Biophys. Acta 1290 (1996) 289-298)。ＥＯお
よびＰＯ単位(Pluronics)のブロックからなる熱分離性ポリマーおよび酵素の分
離におけるその使用が述べられている(Tani et al., Analytical Science 13 (1
997) 925-929および14 (1998) 875-888)。Taniらにより使用されたポリマーは、
中央に親水性ＥＯブロックおよび末端部分に疎水性ＰＯブロックを有する、また
はその逆を有する(ＥＯＰＯブロックコポリマー)。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】 本発明に適当なミセル形成ポリマーの鍵となる特徴は、同一または異なる親水
性モノマー単位からなる中央ポリマー部分であり、末端がそれぞれ疎水性基から
なることであると考えられている。親水性モノマー単位(炭素、水素および酸素
原子のみを含む)は、酸素原子数と炭素原子数との間で、少なくとも１／４、好
ましくは少なくとも１／３となる割合を示す。疎水性末端基(酸素、炭素および
水素原子を含む)は、酸素原子数と炭素原子数との間で、多くとも１／５の割合
を示す。相当する法則が他の型の親水性および疎水性基の親水性および疎水性、
それぞれに適用される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】 ＥＰ２６０４３０は、適当なポリマーを含む構造の定義に該当するポリマーに
ついて記載している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】 ２ポリマー２層システム 分離実験において、水、ＨＭ−ＥＯＰＯおよびBreox PAG 50A(International
Speciality Chemicals Ltd, Southhamptoin, U.K.)から形成される２層システム
を試験した。Breox PAG 50A 1000は等量のエチレンオキサイドおよびプロピレン
オキサイドのランダムコポリマーであり、相対的に高い曇点(１０％濃度でＬＣ
ＳＴ５０℃)を有する。温度をコポリマー曇点以上に上げることにより、両方の
コポリマーを相分離することが可能である。図３参照。ＰＥＧ／デキストランシ
ステムと比較して、相対的に低い濃度のコポリマーが２層の形成に必要である(
各コポリマー２％(ｗ／ｗ))。Breox／ＨＭ−ＥＯＰＯポリマーから成る水性２相
システムは、タンパク質の分離に使用できる。ＢＳＡとリゾチームの分離は、Ｐ
ＥＧ／デキストランシステムと類似の方法における塩添加により指示できる。両
親媒性アポリポタンパク質Ａ−１はＨＭ−ＥＯＰＯポリマーにより形成されたミ
セルと相互作用し、ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に強く分配する。上部Berox相お
よび底部ＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相の熱分離後、水溶液中のタンパク質の回収お
よびコポリマーの再利用が可能である。熱分離後、９７.５％のＨＭ−ＥＯＰＯ
ポリマーおよび７３％のBeroxコポリマーが回収できた。アポリポタンパク質Ａ
−１は、無細胞E. coli発酵溶液からＨＭ−ＥＯＰＯポリマー相に抽出できた。
再利用コポリマーのシステムは、３つのポリマー再利用の間、類似の精製係数を
示した。 製品名：Breox、Ucon、Triton、Tween、Metrohm、Phast SystemおよびCoomass
ieは商標登録されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フォルケ・チャーネルド スウェーデン、エスエー−216 17マルメ、 ステンシュヴッズガータン29番 (72)発明者 ヨセフィーネ・ペション スウェーデン、エスエー−226 42ルンド、 スカルプフュッテヴェーゲン10アー番 (72)発明者 ハンス・オロフ・ヨハンソン スウェーデン、エスエー−431 44メルン ダル、メラネンクスガータン19番 Ｆターム(参考） 4D056 AB20 AC20 AC22 AC30 BA01 CA10 CA17 CA22 CA25 CA39 DA01 DA05 4H045 AA20 CA11 CA40 EA61 GA20

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 予め決定した化合物の分離の方法であって、 ｉ)少なくとも相の１つが熱分離性ポリマー(Ｉ)を多く含んでおり(相１)、他の
    相が少し含んでいる、２相システム(システムＡ)において化合物を分配すること
    、 ii)当該化合物を含む１つの相(相１または相２)を回収すること、 iii)必要ならば、ステップiiで回収した相から当該化合物を単離すること、 を含み、 ａ)ポリマー(Ｉ)は、ミセル形成熱分離性ポリマーであること、そして ｂ)相２が、熱分離性ポリマー(Ｉ)の曇点低下性の少なくとも１つの試薬、例え
    ばポリマー(Ｉ)に不適合なポリマー(II)または塩を含み得ること、 を特徴とする、方法。
  2. 【請求項２】 熱分離性ポリマー(Ｉ)が、９０℃以下、好ましくは７０℃以
    下、例えば３０℃以下または２０℃以下である、より低い臨界溶液温度(ＬＣＳ
    Ｔ)を有することを特徴とする、請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 １つまたはそれ以上の当該少なくとも１つの曇点低下試薬が
    ポリマー(Ｉ)に不適合な水溶性ポリマー(II)であることを特徴とする、請求項１
    −２の何れかに記載の方法。
  4. 【請求項４】 ポリマー(II)が、セルロース、デキストラン、デンプン、末
    端が誘導化されていないエチレンオキシドとプロピレンオキシドの間のランダム
    またはブロックコポリマー、およびポリエチレングリコールの水溶性型から選択
    されることを特徴とする、請求項３の方法。
  5. 【請求項５】 相１および相２が、互いから物理的に分離しており、その場
    合、相１において熱分離性ポリマー(Ｉ)が、および／または、存在するならば、
    相２においてポリマー(II)が、再利用され、システムＡにおいて当該方法の第２
    回目の実施に使用されることを特徴とする、請求項１−４の何れかに記載の方法
    。
  6. 【請求項６】 相１が、ステップ(ii)で回収される相であり、その相が有意
    な量の分離されるべき化合物を含んでいる場合に、次いで、相１をさらなる相分
    離に付して当該化合物を熱分離性ポリマー(Ｉ)の少ない相に向かわせ(相１：２)
    、必要あれば、ポリマーが多い相(相１：１)を再利用することを特徴とする、請
    求項１−５の何れかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 相２が、ステップ(ii)で回収される相であり、曇点低下剤が
    ポリマー(II)であり、相が有意な量の分離される化合物を含む場合に、次いで、
    相２をさらなる相分離に付して当該化合物をポリマー(II)の少ない相に向かわせ
    (相２：２)、必要あれば、ポリマー(II)が多い相(相２：１)を再利用することを
    特徴とする、請求項１−５の何れかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 分離される化合物が、ｐＨ依存電荷を示し、相１と相２との
    ｂ)分配は、荷電に依存し、当該システムのｐＨは、ステップ(ii)で回収される
    相に分離される化合物を最大分配するように選択されることを特徴とする、請求
    項１−７の何れかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 温度が、ステップ(ii)で回収される相に対して分離される化
    合物の最大分配を達成するように選択されることを特徴とする、請求項１−７の
    何れかに記載の方法。
  10. 【請求項１０】 １つまたはそれ以上の物質が、システムＡ中に存在し、そ
    の物質は、分離される化合物の、ステップ(ii)中に回収される相への分配の改善
    能を有することを特徴とし、当該物質は、ステップ(ii)において回収される相へ
    分離される化合物の最大分配を達成するように型および濃度に関して適応させら
    れていることを特徴とする、請求項１−９の何れかに記載の方法。
  11. 【請求項１１】 分離される化合物が電気的に荷電しており、少なくとも１
    つまたはそれ以上の物質が化合物の分配を改善する対イオンを含む塩であること
    を特徴とする、請求項１０の方法。
  12. 【請求項１２】 少なくとも１つの当該物質が、相１の親和性を有する界面
    活性剤であることを特徴とする、請求項１０−１１の何れかに記載の方法。
  13. 【請求項１３】 分離される化合物が、オリゴ−またはポリペプチドまたは
    タンパク質のようなペプチド構造を示すことを特徴とする、請求項１−１２の何
    れかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】 熱分離性ポリマー(I)が、同一または異なり得る親水性モ
    ノマー単位の中央ポリマー部分を呈示するものから選択され、各末端が疎水性基
    であることを特徴とする、請求項１−１３の何れかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】 各親水性モノマー単位が、少なくとも１／４、好ましくは
    少なくとも１／３である、酸素原子数と炭素原子数の間の割合を示し、疎水性基
    において多くとも１／５である酸素原子の数と炭素原子の数との間の割合を示す
    ことを特徴とする、請求項１４の方法。
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