CN102453087A - 一种单取代peg-epo的纯化及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单取代聚乙二醇化促红素(m PEG-EPO)纯化工艺及制备方法，所述方法包括，将EPO、PEG、单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO及多取代PEG-EPO的混合物经疏水层析处理得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中纯化得到单取代PEG-EPO，最后用超滤方法进行浓缩和缓冲液置换。本发明的方法所得产物纯度可达到95％以上、得率不低于60％，在动物体内具有明显和持久促进红细胞生成功能，以及优于常规EPO的长效化作用。本发明制备的m PEG-EPO，能极大地提高m PEG-EPO的纯度指标，同时能有效降低生产成本和能耗。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞因子类蛋白的纯化工艺及制备方法，特别是涉及一种单取代PEG-EPO的纯化工艺及制备方法。
背景技术
常规EPO(促红素)是存在人体内的一种造血因子，1985年在体外基因克隆成功，1989年获准上市应用于治疗贫血类疾病的注射类药物。常规EPO是目前药用蛋白中应用最成功并且市场销售额最大的一种蛋白类药物，2006年全球销售额达139亿美元。但常规EPO在体内易被肾小体清除，半衰期短，病人需要频繁注射以维持有效药效浓度，而且EPO容易聚集导致抗原抗体反应。中国专利《聚合物/重组人促红素偶联物》申请号200710123683.X公开了一种PEG-EPO偶联物及其制备方法，并公开了EPO通过PEG(聚乙二醇)化后能有效提高体内半衰期。单取代PEG-EPO(m PEG-EPO)可以很好克服常规EPO的缺点，从而达到大大降低注射次数，以减少病人的痛苦和经济负担，提高病人的生活质量。正因为如此，目前世界上很多公司和科研院所正在积极研发m PEG-EPO。研发m PEG-EPO的一大难点是如何高效提取出高纯度m PEG-EPO(＞95％)，以符合医药申报要求。EPO和PEG反应后，反应混合物中含有游离PEG、未反应EPO，取代物包含单取代、二取代、多取代PEG-EPO等多种混合物。一方面，由于EPO和PEG分子量均较大，这些取代物性质非常接近，若层析种类、填料类型及层析条件选择不合适很难将它们有效分离。另一方面，反应液中常规EPO非常昂贵，所以要求纯化工艺得率不能太低(＞40％)，否则导致生产成本太高和能耗过大。这二方面导致从反应液混合物中纯化出高纯度m PEG-EPO(并且得率＞40％)显得非常困难，既是当今医药界的一个研究热点也同时是一大难点。
作为生物蛋白类药物，一般要求为单一组分，组分越简单越有利于药效、药理、安全等研究。即使含有微量的其它不明成份的蛋白质，对人体也会有潜在的极大危险。国家食品和药物管理局(FDA)一般对蛋白类新药纯度要求极高，一般纯度至少大于95％，对很多注射类药物更是要求大于98％。
从现有公开的专利技术主要采用阴/阳离子交换，或离子交换与凝胶过滤层析相结合(US 2002/0115833 A1，09/604938，11/386876；PCT WO2006/130799A2等)。但效果都不尽理想，离子交换难以达到所要求的纯度，离子交换和凝胶过滤层析结合面临放大困难、成本高、得率较低等问题(Conan J et al.，Chemical Engineering Science 61，924-939.2006)。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够得到高纯度且得率较高的单取代PEG-EPO的纯化及制备方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开了一种从EPO、PEG、单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO及多取代PEG-EPO的混合物中纯化单取代PEG-EPO的方法，所述方法包括，将混合物经疏水层析纯化得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中分离得到单取代PEG-EPO。
所述单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO、多取代PEG-EPO是指在EPO分子上分别偶联一个、两个或多个具有下式I所述结构的聚合物，
其中，P为聚乙二醇PEG，且P的分子量为30,000～40,000道尔顿。
在本发明优选的实施方式中，所述从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中纯化得到单取代PEG-EPO是指通过离子交换层析去除PEG得到高纯度的单取代PEG-EPO。进一步优选在进行离子交换层析之前，将单取代PEG-EPO与PEG的混合物进行脱盐处理。
所述方法优选还包括将离子交换层析得到的单取代PEG-EPO进行超滤浓缩和缓冲液的置换，以进行纯度检测和动物体内活性检测。
在本发明具体的实施方式中，所述疏水层析填料为含有Butyl(丁基)、Octyl(辛基)、Phenyl(苯基)、Alkyl(烷基)、Hexyl(己基)或Ether(乙醚基)等(如GE公司)疏水填料，所述疏水层析采用梯度洗脱，第一流动相含有0.05-0.25M的磷酸缓冲液，0.5-2M(NH4)2SO4，pH值为6.0-9.0，第二流动相含有0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH值为6.0-9.0。
所述离子交换层析可以为阳离子交换层析或阴离子交换层析；所述脱盐处理是采用脱盐柱进行脱盐层析，并且脱盐层析所用流动相与离子交换层析相对应的平衡缓冲液一致；或稀释降低电导率，所用稀释液与离子交换层析相对应的平衡缓冲液一致。
本发明进一步公开了一种单取代PEG-EPO的制备方法，所述方法包括将具有下式(II)所示结构的聚乙二醇衍生物与EPO混合反应至少2小时，反应pH值为7.0～7.5，所述聚乙二醇衍生物与EPO的摩尔比为10～25∶1，并将反应所得产物用上述方法纯化得到单取代PEG-EPO，
其中，P为聚乙二醇，且P的分子量为30,000～40,000道尔顿。
由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
本发明通过采用创新纯化工艺，能够从EPO、PEG、单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO及多取代PEG-EPO的混合物中纯化得到高纯度的单取代PEG-EPO，纯度通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)和SEC-HPLC(体积排阻高效液相色谱)检测大于95％，且得率大于60％。利用纯化获得的mPEG-EPO进行Bab/c小鼠体内动物实验，结果证明：m PEG-EPO具有比常规EPO体内活性更强，有效药效浓度时间维持更长，具有很好的长效化的作用。本发明的工艺方法能提高m PEG-EPO的纯度标准，同时能有效降低生产成本和能耗。
附图说明
图1为本发明实施例中EPO和NHS-PEG反应产物的SEC-HPLC分析检测图谱。
图2为本发明实施例的疏水层析图谱。
图3为本发明实施例脱盐层析图谱。
图4为本发明实施例的离子交换层析图谱。
图5为采用本发明方法得到的纯化产物进行SDS-PAGE(非还原型)纯度检测结果。
图6为采用本发明方法得到的纯化产物进行SEC-HPLC分析检测结果图谱。
图7至图9为采用本发明的方法得到的纯化产物m PEG-EPO进行动物体内活性检测结果图，图7为RET图，图8为RBC图，图9为RET％图。
具体实施方式
本发明公开了一种从EPO、PEG、单取代PEG-EPO(m PEG-EPO)、二取代PEG-EPO(di PEG-EPO)及多取代PEG-EPO(oli PEG-EPO)的混合物中纯化单取代PEG-EPO的方法以及一种制备单取代PEG-EPO的方法。本发明的多取代PEG-EPO是指三取代或三取代以上的PEG-EPO(oli PEG-EPO)。而单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO、多取代PEG-EPO则是指在EPO分子上分别偶联一个、两个或多个具有下式I所述结构的聚合物，
其中，P为聚乙二醇PEG，且P的分子量为30,000～40,000道尔顿。
将具有下式(II)所示结构的聚乙二醇衍生物与EPO混合反应至少2小时，能够获得PEG-EPO偶联物。其中反应pH值为7.0～7.5，所述聚乙二醇衍生物与EPO的摩尔比为10～25∶1。优选条件：反应时间为2.5小时，反应pH值为7.2，所述聚乙二醇衍生物与重组人促红素的摩尔比为25∶1，反应温度为室温。
其中，P为聚乙二醇，且P的分子量为30,000～40,000道尔顿
反应所得产物中，含有未反应的EPO、未反应的PEG、PEG降解产物、m PEG-EPO、di PEG-EPO以及oli PEG-EPO等混合物。采用本发明的纯化工艺和制备方法纯化后能够获得到高纯度、高得率的m PEG-EPO。
在本发明的纯化步骤，主要包括如下：
(a)疏水层析；(b)脱盐(置换缓冲液)；或稀释来降低电导率；(c)离子交换层析；(d)超滤浓缩并置换缓冲液。
疏水层析：
将EPO和PEG反应后得到的混合物经疏水层析处理，能够有效分离游离EPO、di PEG-EPO和oli PEG-EPO。
疏水层析(Hydrophobic chromatography，HIC)：是在较高浓度盐(如氯化钠，硫酸铵的条件下)利用蛋白质上的疏水基团和固定相上(一般为葡聚糖等)偶联的疏水性配基的结合强弱不同而分离蛋白质的层析方法。配基一般由非极性物质(如烃类、苯基等)等组成(常见疏水配基，见下表)。PEG是两性分子，发明人经研究发现，EPO连接PEG分子(1个或多个)后，偶联物PEG-EPO的疏水性会发生改变，这为疏水层析分离EPO和EPO偶联物提供了理论基础。疏水层析条件比较温和，不会引起蛋白变性问题。
表一：常见疏水填料配基
在本发明中，疏水层析所用的填料选用含有Butyl(丁基)、Octyl(辛基)、Phenyl(苯基)、Alkyl(烷基)、Hexyl(己基)、Ether(乙醚基)等(如GE公司)疏水填料。疏水层析采用梯度洗脱，第一流动相含有0.05-0.25M的磷酸缓冲液，0.5-2M(NH4)2SO4，pH值为6.0-9.0，第二流动相含有0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH值为6.0-9.0。所述疏水层析的流速为2-10ml/min。
经疏水层析后，能够分离获得蛋白纯度达到95％以上的m PEG-EPO，单步得率在85％以上。但产物中还含有大量未反应的PEG。因此需要通过其它步骤去除PEG。
置换缓冲液(脱盐)
PEG分子量约是35KD左右，所以采用超滤(截留分子量10KD左右)，并不能去除。PEG的除去可以采用如亲合层析(如蓝胶特异性结合EPO、EPO抗体亲和层析)的方法去除。同时，PEG呈带电中性，优选采用离子交换方法有效去除PEG。疏水层析目标产物中含有较高浓度的盐，所以在进行离子交换前，需对疏水产物的缓冲液置换成离子交换层析的平衡缓冲液。置换缓冲液可以采用脱盐柱、超滤或者用平衡缓冲液对疏水产物进行稀释以降低电导率，优选采用脱盐G-25柱对产物进行脱盐并进行缓冲液的置换。
脱盐层析属于凝胶过滤层析(Gel filtration chromatography，GFC)，又称分子筛层析(Size exclusion chromatography)。
凝胶过滤层析：使用有一定大小孔隙的凝胶作层析介质(如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)，利用凝胶介质的孔径对分子量和形状不同的物质进行分离的层析技术。由于各种分子的大小、形状不同，扩散到凝胶孔隙内的速度不同，因而穿过过层析柱的快慢不同而达到分离的目的。在脱盐层析中，一般采用交联葡聚糖做为介质(如典型脱盐填料G-25的交联葡聚)，孔径一般较小，而蛋白质分子比较大，直接从填料间的间隙穿出，因此保留时间短，先流穿出来。而盐分子比较小，在分离过程中，就会扩散到凝胶空隙内，因此保留时间长，后流穿出来，从而达到了对蛋白和盐分的分离，也就是达到样品脱盐的目的。
在本发明中，脱盐层析的填料可以选择如GE公司、Merck、Sigma等相关脱盐填料(要求球蛋白分离范围：0～10KD)。
流动相：选择与下一步离子交换层析相对应的平衡缓冲液，如选阳离子交换层析(如SP或CM)，可以选择10～100mM柠檬酸、乙酸缓冲液，pH3.1-5.0；如选阴离子交换层析(如DEAE或Q)，可以选择10～100mM Tris-HCl，pH 7.0-9.0等。
经脱盐层析后，可以很好去除疏水层析组分中的盐分硫酸铵，并且还置换了缓冲液，单步得率在90％以上。
离子交换
离子交换层析(Ion exchange chromagraphy)：是一类吸附性层析，利用待分离组分的带电性质(正、负和不带电)和带电强弱不同而对其进行分离。固定相配基按照带电性质不同分为阴离子和阳离子层析，如配基为二乙基氨基乙基纤维素(DEAE，阴离子)、乙基硫酸(SP，阳离子)，结构见下图。蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下，不同蛋白质带不同性质和强弱的电荷，而PEG呈电中性，从而可以利用离子交换有效去除残余PEG。
在本发明中，离子交换层析所用填料可以选择GE公司的阴离子DEAE，Q填料或阳离子SP，CM等相关填料。
所用流动相选择与离子交换配套的缓冲液，如阳离子，可以选择10～100mM柠檬酸、乙酸缓冲液，pH 3.0-5.0；如阴离子，可选择10～100mM Tris-HCl，pH 7.0-9.0。
经离子交换层析后收集组分m PEG-EPO，单步得率在90％以上。
超滤浓缩并置换缓冲液
对离子交换层析后的产物进一步用Amicon超滤管进行浓缩，并置换为PBS产品储备缓冲液，即得到高纯度产品，单步得率在90％以上。产品4℃保存，以进行纯度检测和动物体内活性检测。
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1
EPO和GLUC-PEG的反应及检测
用15ml塑料离心管，加入2ml EPO原液(EPO含量2.5mg/ml，来自深圳赛保尔生物药业有限公司)，加入3ml pH 7.2的20mM磷酸缓冲液，EPO的终浓度为1mg/ml。用分析天平准确称量109.4mg GLUC-PEG(35，000±3，500D，来自北京键凯，见专利号：02818455.6，结构式如式II)，加入1094μl 2mM且pH 3.0的磷酸缓冲液溶解。溶解后，将GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，试纸测定EPO溶液的pH为7.2。反应混合液放置于震荡器上，室温震荡反应2.5小时。
反应完毕后，反应物内含有未反应的EPO，PEG，反应生成的单取代PEG-EPO(m PEG-EPO)，二取代PEG-EPO(d PEG-EPO)，多取代PEG-EPO(oliPEG-EPO，三取代以上PEG-EPO)等，通过SEC-HPLC对其检测：
检测条件：
SEC-HPLC柱：GE superose 6分析柱
流动相：PBS缓冲液
HPLC：岛津HPLC，PDA检测器，LC solution工作站
检测波长：280nm
上样量：20μl
流速：0.5ml/min
结果如图1所示。
SEC-HPLC根据分子量大小对蛋白进行分离，分子量越大，保留时间越短。从图谱上保留时间来看，依次为oli EPO，d EPO，m PEG-EPO，EPO和盐峰。目标产物m PEG-EPO峰面积大约占50％，即反应单取代率50％左右。
PEG和EPO反应液的疏水层析
层析柱：华美玻璃柱，尺寸：1.6×10cm，内装GE公司疏水填料。
Buffer A：0.15M磷酸缓冲液，2M(NH4)2SO4，pH 7.3
Buffer B：0.15M磷酸缓冲液，pH7.3
流速：8ml/min
检测波长：280nm
样品：取上述反应得到的反应液共40mg EPO反应液，加BufferA稀释至400ml。
纯化步骤：用Buffer A充分平衡柱子5个柱体积后，紫外检测归零开始上样。上样完毕后，继续用BufferA继续冲洗5个柱体积后，开始梯度洗脱，0-100％/15CV(柱体积)，并等体积自动收集洗脱峰，梯度洗脱层析图谱如图2所示。
经SEC-HPLC检测(检测条件同实施例1)，穿透主要为未反应EPO，梯度洗脱过程中，A14-B10主要为m PEG-EPO，纯度达到95％以上，得率85％以上，不纯物以游离EPO存在。B9-C9主要为di PEG-EPO和oliPEG-EPO。按照PEG染色方法(Manfred M and Kurfürst.AnalyticalBiochemistry 200.244-248.1992)进行PEG残留检测，经检测：A14-B10还含有大量未反应PEG，尚需要通过其它步骤去除。
PEG分子量约是35KD，所以采用常规超滤(截留分子量10KD左右)，不能去除。PEG的除去可以采用如亲合层析(如蓝胶特异性结合EPO或EPO抗体亲和层析)的方法除去。考虑到PEG呈带电中性，所以可以采用离子交换方法有效去除PEG。疏水层析目标产物中含有较高浓度的盐，所以在进行离子交换前，需要对疏水产物进行脱盐处理。脱盐可以采用稀释、脱盐柱或超滤进行脱盐，这里我们采用脱盐G-25柱对产物进行脱盐并置换成离子交换平衡缓冲液。
脱盐层析：疏水层析分离物经脱盐柱脱盐并置换成阳离子交换平衡缓冲液
层析柱：华美玻璃柱，尺寸：2.6×60cm，内装GE公司G-25填料。
流速：6ml/min
上样样品：疏水层析组份A14-B10组分。
检测波长：280nm
流动相：10mM柠檬酸缓冲液，pH 4.5
层析图谱如图3所示。
从图谱可以看出：通过脱盐柱，可以很好地去除疏水层析组分中的硫酸铵，并置换了缓冲液，单步得率在90％以上。
离子交换层析以去除残余PEG
经缓冲液置换的样品经过离子交换后以除掉残余PEG。
柱子：华美玻璃柱，尺寸：1.0×20cm，内装GE公司阳离子填料
Buffer C：10mM柠檬酸缓冲液，pH 4.5
Buffer D：buffer C+1M NaCl
上样：层析柱经Buffer C充分平衡至少5个柱体积(CV)后，直接上经脱盐柱脱盐后的样品。
洗脱：0-100％B/20CV
离子交换典型图谱如图4所示。
通过SEC-HPLC检测，对m PEG-EPO峰进行收集。收集组分用10KDAmicon超滤管进行超滤浓缩(按说明书操作)，并置换为适合人体或动物注射的PBS产品储备缓冲液，即得到高纯度产品，4℃保存。
实验例1
纯化产物m PEG-EPO的纯度检测(SDS-PAGE和SEC-HPLC)
将上述实施例得到的纯化产物进行SDS-PAGE(非还原型)纯度(按照2010药典方法)检测，常规EPO和m PEG-EPO均上样10μg，考马斯亮蓝染色，结果如图5所示。
从图5结果可以看出，通过以上层析(疏水+脱盐+离子交换+超滤)纯化的m PEG-EPO在SDS-PAGE胶上是唯一条带，纯度大于98％。
对纯化产物进行SEC-HPLC分析，条件同实施例1，结果如图6所示。
从以上结果可以看出，通过以上层析(疏水+脱盐+离子交换+超滤)纯化的m PEG-EPO进行SEC-HPLC纯度分析，纯度达到100％。
通过纯度检测，可以看出通过该工艺获得的单取代PEG-EPO(mPEG-EPO)纯度大于95％。按照PEG染色方法(Manfred M and Kurfürst.(Analytical Biochemistry 200.244-248.1992)，我们对其进行残留PEG检测，发现无残留PEG(＜1％)存在。
实验例2
纯化产物m PEG-EPO的体内活性检测
测定原理：骨髓中红细胞系统的增生发育过程：多能干细胞→单能干细胞→原始红细胞→早幼红细胞→中幼红细胞→晚幼红细胞→网织红细胞→成熟红细胞。从原始红细胞增殖到晚幼红细胞阶段共分裂3-4次，约需72小时，红细胞数由一个变为8一16个，细胞核由大变小而浓缩，胞浆中含血红蛋白逐渐增多。晚幼红细胞以后细胞即不再分裂，发育过程中核被排出而成为网织红细胞。网织红细胞含有少量核糖核酸RNA)，用煌焦油蓝染色时成网状故名网织红细胞。网织红细胞进一步成熟，RNA消失而为成熟红细胞。
EPO可以促进骨髓内多能干细胞加速生成网织红细胞，并最终生成红细胞。因此，网织红细胞和红细胞的变化可以用来评价EPO的体内活性。
目的：可以根据等量不同种类的EPO与网织红细胞或红细胞的数量的关系曲线来定量测定其体内生物活性，以及活性持续时间。从而判断本发明得到的m PEG-EPO在长效性方面是否优于常规EPO。
方法：网织红细胞法(RET)
实验动物：SPF级雌性Balb/C小鼠(体重18g左右)
1.网织红细胞法(RET)实验
1.1实验分组
| 实验组1(10只) | 实验组2(40只) | 实验组3(40只) | 实验组4(40只) |
| 空白对照组 | 阴性对照组 | 常规EPO组 | m PEG-EPO组 |
1.2采血时间点
空白对照第0天采血，常规EPO组第3、4、5、6天采血，m PEG-EPO组和阴性对照组第4、5、6、7天采血。
1.3注射和采血
空白对照组不注射，阴性对照组注射200μl生理盐水，常规EPO组和纯化m PEG-EPO组依据体重注射(2μg/kg)。采用眼眶采血，利用日本Sysmax血细胞分析仪(R-500)进行自动计数红细胞和网织红细胞计数分析，结果如图7-9所示。
结果：通过图7至图9的结果可以看出，同剂量的本发明纯化产物mPEG-EPO具有比常规EPO体内活性更强，半衰期更长，具有很好的长效化作用。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种从EPO、PEG、单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO及多取代PEG-EPO的混合物中纯化单取代PEG-EPO的方法，所述方法包括，将混合物经疏水层析纯化得到单取代PEG-EPO与PEG的混合物，再从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中分离得到单取代PEG-EPO；
所述单取代PEG-EPO、二取代PEG-EPO、多取代PEG-EPO是指在EPO分子上分别偶联一个、两个或多个具有下式I所述结构的聚合物，
其中，P为聚乙二醇PEG，且P的分子量为30,000～40,000道尔顿。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述从单取代PEG-EPO与PEG的混合物中纯化得到单取代PEG-EPO是指通过离子交换层析去除PEG得到纯化的单取代PEG-EPO。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：进行离子交换层析之前，将单取代PEG-EPO与PEG的混合物进行脱盐处理，或稀释降低电导率。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将纯化得到的单取代PEG-EPO利用超滤方法进行浓缩和置换缓冲液。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于：所述疏水层析所用填料为含有丁基、辛基、苯基、烷基、己基或乙醚基的疏水填料，所述疏水层析采用梯度洗脱，第一流动相含有0.05-0.25M的磷酸缓冲液，0.5-2M(NH4)2SO4，pH值为6.0-9.0，第二流动相含有0.05-0.25M的磷酸缓冲液，pH值为6.0-9.0。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述离子交换层析为阳离子交换层析或阴离子交换层析；所述脱盐处理是采用脱盐柱进行脱盐层析，并且脱盐层析所用流动相与离子交换层析相对应的平衡缓冲液一致；或稀释降低电导率，所用稀释液与离子交换层析相对应的平衡缓冲液一致。
7.一种单取代PEG-EPO的制备方法，所述方法包括将具有下式(II)所示结构的聚乙二醇衍生物与EPO混合反应至少2小时，反应pH值为7.0～7.5，所述聚乙二醇衍生物与EPO的摩尔比为10～25∶1，并将反应所得产物用权利要求1～6任意一项所述的方法纯化得到单取代PEG-EPO，
其中，P为聚乙二醇，且P的分子量为30,000～40,000道尔顿。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Xionghui Inventor after: Zhang Xiangrong Inventor after: Zhang Diping Inventor after: Sheng Guangyang Inventor after: Liu Jianjun Inventor after: Huang Junlong Inventor after: Huang Haiyan Inventor after: Wu Yuanyuan Inventor before: Li Xionghui Inventor before: Zhang Xiangrong Inventor before: Zhang Diping Inventor before: Sheng Guangyang Inventor before: Liu Jianjun Inventor before: Huang Junlong Inventor before: Huang Haiyan |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: LI XIONGHUI ZHANG XIANGRONG ZHANG DIPING SHENG GUANGYANG LIU JIANJUN HUANG JUNLONG HUANG HAIYAN TO: LI XIONGHUI ZHANG XIANGRONG ZHANG DIPING SHENG GUANGYANG LIU JIANJUN HUANG JUNLONG HUANG HAIYAN WU YUANYUAN |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Li Xionghui Inventor after: Zhang Xiangrong Inventor after: Zhang Diping Inventor after: Sheng Guangyang Inventor after: Liu Jianjun Inventor after: Huang Junlong Inventor after: Huang Haiyan Inventor after: Wu Yuanyuan Inventor before: Li Xionghui Inventor before: Zhang Xiangrong Inventor before: Zhang Diping Inventor before: Sheng Guangyang Inventor before: Liu Jianjun Inventor before: Huang Junlong Inventor before: Huang Haiyan Inventor before: Wu Yuanyuan |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: GUANGDONG SAIBAOER BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL TECHN Free format text: FORMER OWNER: SHENZHEN SCIPROGEN BIO-PHARMACEUTICAL CO., LTD. Effective date: 20130823 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 518129 SHENZHEN, GUANGDONG PROVINCE TO: 523808 DONGGUAN, GUANGDONG PROVINCE |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20130823 Address after: 523808, building 5, building 506, Songshan science and Technology Industrial Park, building 4, Songshan Lake, Guangdong, Dongguan Applicant after: Guangdong Saibaoer Bio-Pharmaceutical Technology Co., Ltd. Address before: Graceland Bantian Petrochemical Industrial Zone Road in Longgang District of Shenzhen City, Guangdong province 518129 Applicant before: ShenZhen Sciprogen Bio-pharmaceutical Co., Ltd. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20181228 Address after: 523808 Room 407, 4th Floor, Building 12, Innovation Science Park, Dongguan Songshan Lake High-tech Industrial Development Zone, Dongguan City, Guangdong Province Patentee after: Guangdong Sansheng Pharmaceutical Co., Ltd. Address before: 523808 Room 506, 5th Floor, Building 4, Innovation Science Park, Songshan Lake Science and Technology Industrial Park, Dongguan City, Guangdong Province Patentee before: Guangdong Saibaoer Bio-Pharmaceutical Technology Co., Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201221 Address after: No.14, Yayuan Road, Bantian street, Longgang District, Shenzhen, Guangdong 518129 Patentee after: SHENZHEN SCIPROGEN BIO-PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 523808 Room 407, 4th Floor, Building 12, Innovation Science Park, Dongguan Songshan Lake High-tech Industrial Development Zone, Dongguan City, Guangdong Province Patentee before: Guangdong Sansheng Pharmaceutical Co.,Ltd. |
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| TR01 | Transfer of patent right |