CN103570820B - 一种重组人促卵泡激素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，属于生物技术领域，具体涉及一种重组人促卵泡激素的纯化方法，即将含有重组人促卵泡激素的细胞上清依次经过染料亲和层析、疏水作用层析、脱盐层析和羟基磷灰石层析得到高质量的重组人促卵泡激素目的蛋白。本发明具有工艺简单、成本低、目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。
Description
技术领域
本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及一种重组人促卵泡激素的纯化方法，属于生物技术领域。
背景技术
卵泡刺激素（FollicleStimulatingHormone，FSH）也称为促卵泡激素，是一种属于促性腺激素类的可注射的蛋白质。天然状态下由垂体嗜碱性细胞合成和分泌的，作为药用，FSH可以重组产生，或者可以从绝经后的妇女尿液中分离得到。FSH可用于女性和男性病人的不孕和生殖紊乱的治疗，目前国内已经上市的有从尿液中提取的注射用尿促卵泡激素，商品名丽申宝；采用基因重组技术生产的产品也已进口上市，其纯度更高、避免了尿蛋白杂质及其他杂质的污染，商品名果纳芬（重组人α促卵泡激素）和普丽康（重组人β促卵泡激素）。
FSH是一种糖蛋白，糖蛋白激素的不均一性引起理化性质的差别较大，对色谱分离方法的选择性提出了挑战——既要保证制品的质量，又要有较高的回收率，这是蛋白质纯化中一个重要的问题。
CN101087805中公开了一种重组FSH纯化方法，该发明采用超滤、阴离子交换层析、染料亲和层析、疏水层析、反相层析以及阴离子交换层析的方法纯化重组FSH。CN1890265中公开了一种重组FSH纯化的方法，该发明采用超滤、阴离子层析、金属螯合亲和层析、阴离子层析、疏水层析以及反相层析的方法纯化FSH，制备的FSH比活性为8876IU/mg。这两篇专利所涉及的纯化工艺步骤较多，纯化较为复杂，工业化生产过程中控制点多，对纯化工艺可控性带来一定的困难；另外，反相层析过程相对较慢，需要用到有机溶剂，最终导致产物要检测有机物残留，而且以后用于医药生产时还要考虑有机溶剂的存放问题，给医药生产带来一定的不便。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种适宜于规模扩大化生产的、快速、高效、简便的重组人促卵泡激素目的蛋白的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。
本发明将含有重组人促卵泡激素的液体依次经过染料亲和层析、疏水作用层析、脱盐层析和羟基磷灰石层析得到高质量的重组人促卵泡激素目的蛋白。
本发明的具体步骤为：
染料亲和层析
（1）用平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡，将含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养上清进行上样，重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；
（2）用含有NaCl的平衡缓冲液对步骤（1）处理的层析柱进行洗脱，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
（3）用含盐的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤（2）中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液；
脱盐层析
（4）将步骤（3）中的穿出蛋白液上样到用平衡缓冲液平衡好的脱盐柱上进行脱盐，收集脱盐的蛋白液；
羟基磷灰石层析
（5）用平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，将步骤（4）中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，即获得目的蛋白原液。
本发明所采用的含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养液在纯化之前先进行澄清过滤，除去细胞培养液中的菌体等成分。
染料亲和层析过程中，介质选用BlueSepharoseCL-6B、BlueSepharose6FastFlow或者BlueSepharoseHighPerformance，该过程主要用于捕获细胞培养液中的重组人促卵泡激素目的蛋白，同时除去少量杂质蛋白，而且染料亲和层析洗脱液不用经过样品处理就可以直接进行后续的疏水层析，简化了操作步骤。当重组人促卵泡刺激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上后采用添加了NaCl的平衡缓冲液对其进行洗脱，其中NaCl的浓度为1.0mol/L-2.5mol/L。
本发明各个步骤所用的平衡缓冲液为本领域常用的缓冲体系，例如Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液或Hepes缓冲液，缓冲液浓度为10mmol/L-100mmol/L，pH值为6.5-10.0。
为了去除色素与杂质蛋白，染料亲和层析后获得的蛋白液进一步进行疏水作用层析。疏水作用层析所采用的层析介质苯基琼脂糖凝胶6（highsub）或丁基琼脂糖凝胶4或者辛基-琼脂糖凝胶4FF。该步骤中的平衡缓冲液通过添加盐来增加其离子强度，所述的盐可选择为NaCl、（NH4）2SO4或者Na2SO4，浓度为0.5mol/L-2.0mol/L，其中优选NaCl。
为了除去疏水层析后蛋白液中的盐，以进行后续的羟基磷灰石层析，疏水作用层析以后先进行脱盐层析，所用的层析介质为SephadexG-25Fine、SephadexG-25Medium、或者SephadexG-25Coarse。另外，该脱盐层析过程在一定程度上也能除去蛋白液中的一些色素和低分子量杂质蛋白。
虽然经过上述多次层析以后，蛋白液中的色素和杂质蛋白部分得到了去除，但是为了保证最终产品的品质，本发明最后采用了羟基磷灰石层析，去除蛋白液中大量的色素、内毒素以及杂质蛋白，层析介质为Bio-gel羟基磷灰石或者CHT羟基磷灰石，例如Bio-GelHTPGel、Bio-GelHTP,DNAGrade、Bio-GelHTGel或者CHTCeramicHydroxyapatite。
将经过上述层析纯化后的穿出液进行纳米过滤，即可获得高纯度目的蛋白液。
综上所述，本发明首先采用染料亲和层析捕获重组人促卵泡激素目的蛋白，同时除去少量杂质蛋白，然后利用疏水层析、脱盐层析去除少量色素、少量的杂质蛋白以及低分子量杂质，最终采用羟基磷灰石层析去除大量的色素与杂质蛋白，三种层析方法依次作用，相互补充，最终制得高质量产品，经检测，本发明制备出的重组人促卵泡激素目的蛋白活性为13000IU/mg，整个纯化过程中未采用任何有机溶剂，最终获得的产品中无有机溶剂残留，而且本发明所述的制备工艺简便、快速、规模放大容易，适合大规模生产。
附图说明
图1为SDS-PAGE电泳分析实施例1纯化后的重组人促卵泡激素目的蛋白纯度图谱，1为Marker；2为重组人促卵泡激素目的蛋白原液，纯度：99.68%。
图2为Sec-HPLC液相分析实施例1纯化后的重组人促卵泡激素目的蛋白纯度图谱，纯度为99.98%。
具体实施方式
以下通过实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应作为本发明的限制。
本发明的方法包括顺序使用含有重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养液澄清过滤，染料亲和层析，疏水层析，脱盐，羟基磷灰石层析来纯化重组人促卵泡刺激素目的蛋白。本发明中所述的层析介质均为市购。
实施例1
一种重组人促卵泡激素的纯化方法，其具体步骤为：
染料亲和层析
（1）用200ml浓度为100mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液平衡BlueSepharoseCL-6B层析柱（1.6×10cm），将澄清过滤后的含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养液上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；
（2）用含有2.0mol/LNaCl的浓度为100mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液对步骤（1）处理的层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
（3）用20ml含有2.0mol/LNaCl的浓度为100mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液平衡苯基琼脂糖凝胶6（highsub），将步骤（2）中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液，上样结束继续用含有2.0mol/LNaCl的浓度为100mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU；
脱盐层析
（4）用300ml浓度为100mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液平衡SephadexG-25Fine（1.6×70cm）层析柱，平衡结束，将步骤（3）中的穿出蛋白液上样进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，收至100mAU结束；
羟基磷灰石层析
（5）用100ml浓度为100mmol/L，pH为8.0的Tris-HCl缓冲液平衡Bio-GelHTPGel（1.6×5cm）层析柱，平衡结束后，将步骤（4）中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上样结束继续用浓度为100mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU。
将穿出液进行纳米过滤，所获得的目的蛋白液采用SDS-PAGE与Sec-HPLC方法检测重组人促卵泡激素目的蛋白纯度可以达到99.98%。
实施例2
一种重组人促卵泡激素的纯化方法，其具体步骤为：
染料亲和层析
（1）用200ml浓度为50mmol/L，pH为7.0的Tris-HCl缓冲液平衡BlueSepharoseHighPerformance层析柱（1.6×10cm），将澄清过滤后的含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；
（2）用含有1.0mol/LNaCl的浓度为50mmol/L、pH为7.0的Tris-HCl缓冲液作为洗脱液对步骤（1）处理的层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
（3）用20ml含有1.0mol/LNaCl的浓度为50mmol/L、pH为7.0的Tris-HCl缓冲液平衡苯基琼脂糖凝胶6（highsub），将步骤（2）中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液，上样结束继续用含有0.5mol/LNaCl的浓度为50mmol/L、pH为7.0的Tris-HCl缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU；
脱盐层析
（4）用300ml浓度为50mmol/L，pH为7.0的Tris-HCl缓冲液平衡SephadexG-25Fine（1.6×70cm）层析柱，平衡结束，将步骤（3）中的穿出蛋白液上样到用平衡缓冲液平衡好的脱盐柱上进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，收至100mAU结束；
羟基磷灰石层析
（5）用100ml浓度为50mmol/L，pH为7.0的Tris-HCl缓冲液平衡Bio-GelHTPGel（1.6×5cm）层析柱，平衡结束后，将步骤（4）中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上样结束继续用浓度为50mmol/L、pH为7.0的Tris-HCl缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU。
将穿出液进行纳米过滤，所获得的目的蛋白液采用SDS-PAGE与Sec-HPLC方法检测重组人促卵泡激素目的蛋白纯度可以达到98.95%。
实施例3
一种重组人促卵泡激素的纯化方法，其具体步骤为：
染料亲和层析
（1）用200ml浓度为20mmol/L，pH为10.0的磷酸盐缓冲液平衡BlueSepharose6FastFlow层析柱（1.6×10cm），将澄清过滤后的含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；
（2）用含有2.5mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH为10.0的磷酸盐缓冲液作为洗脱液对步骤（1）处理的层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
（3）用20ml含有0.5mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH为10.0的磷酸盐缓冲液平衡丁基琼脂糖凝胶4，将步骤（2）中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液，上样结束继续用含有0.5mol/LNaCl的浓度为20mmol/L、pH为10.0的磷酸盐缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU；
脱盐层析
（4）用300ml浓度为20mmol/L，pH为10.0的磷酸盐缓冲液平衡SephadexG-25Medium（1.6×70cm）层析柱，平衡结束，将步骤（3）中的穿出蛋白液上样到用平衡缓冲液平衡好的脱盐柱上进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，收至100mAU结束；
羟基磷灰石层析
（5）用100ml浓度为20mmol/L，pH为10.0的磷酸盐缓冲液平衡Bio-GelHTGel（1.6×5cm）层析柱，平衡结束后，将步骤（4）中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上样结束继续用浓度为20mmol/L、pH为10.0的磷酸盐缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU。
将穿出液进行纳米过滤，所获得的目的蛋白液采用SDS-PAGE与Sec-HPLC方法检测重组人促卵泡激素目的蛋白纯度可以达到99.95%。
实施例4
一种重组人促卵泡激素的纯化方法，其具体步骤为：
染料亲和层析
（1)用200ml浓度为60mmol/L，pH为7.0的磷酸盐缓冲液平衡BlueSepharoseHighPerformance层析柱（1.6×10cm），将澄清过滤后的含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；
（2）用含有1.0mol/LNaCl的浓度为60mmol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液作为洗脱液对步骤（1）处理的层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
（3）用20ml含有1.0mol/LNaCl的浓度为60mmol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液平衡丁基琼脂糖凝胶4，将步骤（2）中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液，上样结束继续用含有1.0mol/LNaCl的浓度为60mmol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU；
脱盐层析
（4）用300ml浓度为60mmol/L，pH为7.0的磷酸盐缓冲液平衡SephadexG-25Medium（1.6×70cm）层析柱，平衡结束，将步骤（3）中的穿出蛋白液上样到用平衡缓冲液平衡好的脱盐柱上进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，收至100mAU结束；
羟基磷灰石层析
（5）用100ml浓度为60mmol/L，pH为7.0的磷酸盐缓冲液平衡Bio-GelHTGel（1.6×5cm）层析柱，平衡结束后，将步骤（4）中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上样结束继续用浓度为50mmol/L、pH为7.0的磷酸盐缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU。
将穿出液进行纳米过滤，所获得的目的蛋白液采用SDS-PAGE与Sec-HPLC方法检测重组人促卵泡激素目的蛋白纯度可以达到99.97%。
实施例5
一种重组人促卵泡激素的纯化方法，其具体步骤为：
染料亲和层析
（1）用200ml浓度为10mmol/L，pH为6.5的Hepes缓冲液平衡BlueSepharoseCL-6B层析柱（1.6×10cm），将澄清过滤后的含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；
（2）用含有2.0mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH为6.5的Hepes缓冲液作为洗脱液对步骤（1）处理的层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
（3）用20ml含有2.0mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH为6.5的Hepes缓冲液平衡辛基-琼脂糖凝胶4FF，将步骤（2）中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液，上样结束继续用含有2.0mol/LNaCl的浓度为10mmol/L、pH为6.5的Hepes缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU；
脱盐层析
（4）用300ml浓度为10mmol/L，pH为6.5的Hepes缓冲液平衡SephadexG-25Coarse（1.6×70cm）层析柱，平衡结束，将步骤（3）中的穿出蛋白液上样到用平衡缓冲液平衡好的脱盐柱上进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，收至100mAU结束；
羟基磷灰石层析
（5）用100ml浓度为10mmol/L，pH为6.5的Hepes缓冲液平衡Bio-GelHTP,DNAGrade（1.6×5cm）层析柱，平衡结束后，将步骤（4）中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上样结束继续用浓度为10mmol/L、pH为6.5的Hepes缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU。
将穿出液进行纳米过滤，所获得的目的蛋白液采用SDS-PAGE与Sec-HPLC方法检测重组人促卵泡激素目的蛋白纯度可以达到99.96%。
实施例6
一种重组人促卵泡激素的纯化方法，其具体步骤为：
染料亲和层析
（1）用200ml浓度为100mmol/L，pH为9.0的Hepes缓冲液平衡BlueSepharose6FastFlow层析柱（1.6×10cm），将澄清过滤后的含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养上清进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；
（2）用含有2.0mol/LNaCl的浓度为100mmol/L、pH为9.0的Hepes缓冲液作为洗脱液对步骤（1）处理的层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
（3）用20ml含有2.0mol/LNaCl的浓度为100mmol/L、pH为9.0的Hepes缓冲液平衡辛基-琼脂糖凝胶4FF，将步骤（2）中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液，上样结束继续用含有2.0mol/LNaCl的浓度为100mmol/L、pH为9.0的Hepes缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU；
脱盐层析
（4）用300ml浓度为100mmol/L，pH为9.0的Hepes缓冲液平衡SephadexG-25Coarse（1.6×70cm）层析柱，平衡结束，将步骤（3）中的穿出蛋白液上样到用平衡缓冲液平衡好的脱盐柱上进行脱盐，收集脱盐的蛋白液，收至100mAU结束；
羟基磷灰石层析
（5）用100ml浓度为100mmol/L，pH为9.0的Hepes缓冲液平衡CHTCeramicHydroxyapatite（1.6×5cm）层析柱，平衡结束后，将步骤（4）中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，上样结束继续用浓度为100mmol/L、pH为9.0的Hepes缓冲液平衡，平衡至UV280小于100mAU。
将穿出液进行纳米过滤，所获得的目的蛋白液采用SDS-PAGE与Sec-HPLC方法检测重组人促卵泡激素目的蛋白纯度可以达到99.90%。
Claims (7)
1.一种重组人促卵泡激素的纯化方法，其特征在于：其具体步骤为：
染料亲和层析
(1)用平衡缓冲液对染料亲和层析柱进行平衡，将含重组人促卵泡激素目的蛋白的细胞培养上清进行上样，重组人促卵泡激素目的蛋白吸附于染料亲和层析介质上；
(2)用含有NaCl的平衡缓冲液对步骤(1)处理的层析柱进行洗脱，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出染料亲和层析柱，收集洗脱蛋白液；
疏水作用层析
(3)用含盐的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡，将步骤(2)中的洗脱蛋白液进行上样，使重组人促卵泡激素目的蛋白穿出疏水层析柱，收集穿出蛋白液；
脱盐层析
(4)将步骤(3)中的穿出蛋白液上样到用平衡缓冲液平衡好的脱盐柱上进行脱盐，收集脱盐的蛋白液；
羟基磷灰石层析
(5)用平衡缓冲液对羟基磷灰石层析柱进行平衡，将步骤(4)中收集的蛋白液上样到羟基磷灰石层析柱上，重组人促卵泡激素目的蛋白穿出并收集，即获得目的蛋白原液；
其中，染料亲和层析的介质选用BlueSepharoseCL-6B或BlueSepharose6FastFlow或BlueSepharoseHighPerformance；
步骤(1)-(5)中所用的平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液或磷酸盐缓冲液或Hepes缓冲液，缓冲液浓度为10mmol/L-100mmol/L，pH值为6.5-10.0。
2.根据权利要求1所述的重组人促卵泡激素的纯化方法，其特征在于：步骤(2)中的平衡缓冲液中NaCl的浓度为1.0mol/L-2.5mol/L。
3.根据权利要求1所述的重组人促卵泡激素的纯化方法，其特征在于：步骤(3)中所述的疏水层析采用的层析介质为苯基琼脂糖凝胶6的highsub形式或丁基琼脂糖凝胶4或者辛基-琼脂糖凝胶4FF。
4.根据权利要求1所述的重组人促卵泡激素的纯化方法，其特征在于：步骤(3)中的盐为NaCl或(NH4)2SO4或者Na2SO4，浓度为0.5mol/L-2.0mol/L。
5.根据权利要求4所述的重组人促卵泡激素的纯化方法，其特征在于：步骤(3)中的盐为NaCl。
6.根据权利要求1所述的重组人促卵泡激素的纯化方法，其特征在于：步骤(4)中的脱盐层析介质为SephadexG-25Fine或SephadexG-25Medium或SephadexG-25Coarse。
7.根据权利要求1所述的重组人促卵泡激素的纯化方法，其特征在于：步骤(5)中羟基磷灰石层析介质为Bio-gel羟基磷灰石或者CHT羟基磷灰石。
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