CN102321135B - 一种利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法，其包括以下步骤：1.制备虫草素样品溶液；2.根据虫草素的理化性质配制用于高速逆流色谱的两相分配系数K值在0.5～1.0范围之间的两相溶剂系统，然后采用所述的两相溶剂系统对所述步骤1所得的虫草素样品溶液进行高速逆流色谱分离纯化，收集流出的流动相溶液或固定相溶液，从而得到虫草素纯品溶液。本发明中采用的两相分配系数K值在0.5～1.0范围之间的两相溶剂系统对虫草素具有相当好的分离效果，在高速逆流色谱中的分峰效果非常好，因而分离所得到的虫草素纯品的纯度非常高，均可达到98％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种虫草素分离纯化的方法，尤其涉及一种利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法。
背景技术
虫草素是虫草属真菌中的一种特有标志性成分，在其他食药用真菌中一般不含有此成分。因此，此成分对于鉴别虫草制品有着特殊意义。虫草素(Cordycepin，3′-脱氧腺苷)是一种核苷类抗生素，属嘌呤类生物碱，其分子式为C10H13N5O3，结构式参见结构式I，分子量为251，溶于水、热乙醇、甲醇、正丁醇和正丙醇，不溶于苯、丁醚和氧仿，熔点225～226℃，旋光度-47°。
虫草素在虫草属真菌中的含量很低，从虫草属真菌中分离虫草素纯品需要经过提取、柱色谱分离等比较复杂的分离程序才能得到虫草素的纯品，即虫草素样品的色谱纯度达到98％以上，因此分离纯化的成本很高，目前国际市场上虫草素的价格非常昂贵，为进一步开发虫草素的药用价值，扩大其应用范围带来了不便。目前，我国比较常用的虫草素分离纯化方法是离子树脂吸附法，此外还可以采用活性炭吸附法以及氧化铝柱层析和硅胶柱层析的方法。
1.离子交换树脂法
潘中华等(《蚕蛹虫草中虫草素的提取及纯化工艺研究》，江苏蚕业，2003，2.)对用732阳离子交换树脂分离纯化虫草素进行了研究。他们将蚕蛹虫草子实体经过粉碎，脱脂，过滤，烘干，水浴，沉淀，过滤，离心沉淀，除色素，浓缩等几步预处理后上732阳离子交换树脂柱，之后用0.15mol/L氨水洗脱，流速1d/s。用10ml试管收集洗脱液，每支收集6ml，收集60支。用红紫酸氨反应检测收集到的洗脱液中虫草素的含量。取有虫草素的一支或几支浓缩，然后于T＜5℃静置得到虫草素晶体。这种方法的工艺流程比较简单，但所提取的虫草素较少，提取率较低，这与树脂的吸附能力及吸附量有关，因此，筛选吸附能力较强及吸附量较多的树脂是这种方法能否得到应用的关键。
中国专利申请CN1298742A中采用反吸附不交换的方法得到了虫草素晶体。他以蛹虫草真菌固体干燥培养物为原料，通过粉碎、热浸、低度醇液提取、过滤四步得到提取液。当提取液在pH8-pH9时，有效成分虫草素，既不被717阴离子(Cl-)交换树脂吸附，也不被732阳离子(NH4 +)树脂吸附。这样，无关的其它有机或无机阴、阳离子均被离子交换柱吸附。经上述处理的虫草素处于近中性状态，这时重新调pH至11，使虫草素带负电荷被吸附在717(Cl-)阴离子柱上。然后采用常规方法纯净水或蒸馏水洗脱、加热浓缩(或真空干燥)。经浓缩后，提取液略呈淡黄色，4℃静置出现絮状沉淀，滤纸过滤，所得白色块状物即为虫草素租结晶。如此反复数次即可得纯度在95％以的虫草素。众所周知，717和732离子交换树脂通常在纯净水制作中应用。这种方法反其道而行之，有效地提高工作效率，同时可以综合利用其它成分。即717和732离子交换树脂柱分别洗脱，集中浓缩，又可得到氨基酸及生物碱等药用成分。这种方法既有利于虫草素提取净化，又有利于相关成分开发，有较高的工业利用价值，但该方法操作方法比较繁琐，需要多次分离才能达到98％的纯度，样品的损失比较大，可以用于虫草素的粗分，但要一次得到高纯度的虫草素单体，还需要更快捷、方便，高效的分离方法。
2.超临界萃取技术
超临界CO2萃取技术是近些年来迅速发展起来的一种新技术，与传统提取方法相比，它具有许多独特的优点，中国专利申请CN1339440A中采用超临界萃取得到虫草素晶体，他以蛹虫草人工培养后的发酵物为原科，采用超临界技术萃取核苷类有效成分，并以乙醇等作为夹带剂减压分离获得核苷多组份及单体。这种方法采用蛹虫草人工培养后的固体或半固体为原料，在技术过程中，真菌培养物粉碎后加入萃取釜中，在高压条件下使二氧化碳成为液体，作为溶剂，提取中药材的成分在釜中溶出。在二氧化碳流动过程中，分离釜中的压力、温度不同使所需成分析出，结合I、II、III分离釜或分馏塔可使某一成分析出。在减压下二氧化碳挥发即可得到脱氧核苷组份或单体。而获得的脱氧核苷组份，仍溶在水、乙醇混合液或丙烷液体中，尚需采用活性碳吸附、除杂，有机溶剂去杂、重结晶或离子树脂处理去杂、冷冻干燥或真空干燥得到粉状原料，从而成为含虫草素为50-99.9％的粉状原料。超临异技术无污染，易操作，不损害活性天然成分的结构，具有显著的优点，但是这种方法所得虫草素的纯度依然不够理想。而较之传统提取方法它需要的成本也比较高。
3.活性炭吸附法
活性炭柱层析对于分离水溶性物质是一种较好的方法，其样品上柱量大，分离效果好，工艺简单，成本低，适用于大量制备分离，但是活性炭柱对虫草素的吸附的选择性比较差，在吸附虫草素的同时还吸附其它杂质成分，导致虫草素的得率偏低，无法对虫草素进行有效的分离。
由于虫草素的分离纯化非常困难，因此无论国际上还是国内，尚无虫草素有证标准样品。大多数企业在检测虫草素时多数采用从中国药品微生物制品检定所或国外的sigma公司、Acros公司购买虫草素的标准品，进行自行检测，因此无法保证标准样品的质量，严重影响了虫草素检测工作的开展。所述的虫草素的标准品是指样品的色谱纯度达到98％以上，并且样品经过紫外、红外、核磁和质谱进行检测，确认为虫草素的结构。
高速逆流色谱作为近几十年来发展起来的一种新型液-液分配色谱技术，高速逆流色谱不需要任何的固体载体或支撑物，相对于柱色谱、高效液相色谱等其他常用色谱技术来说，它克服了固体载体引起的样品吸附损耗、样品难活化、样品峰拖尾及样品易受污染、不易回收等缺陷，而且还具有可从样品粗提液或直接从生物体液中提取有效成分等优点。然而，目前还没有人采用高速逆流色谱进行虫草素的分离纯化。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法。
本发明的发明目的是通过以下技术方案来实现的：一种利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法，其包括以下步骤：
1.制备虫草素样品溶液；
2.根据虫草素的理化性质配制用于高速逆流色谱的两相分配系数K值在0.5～1.0范围之间的两相溶剂系统，然后采用所述的两相溶剂系统对所述步骤1所得的虫草素样品溶液进行高速逆流色谱分离纯化，收集流出的流动相溶液或固定相溶液，从而得到虫草素纯品溶液。
本发明所述的步骤2中的两相溶剂体系的K值可根据下式来进行计算，并由此来选择使用的溶剂，并保证让两相溶剂体系的K值在0.5～1.0之间，
K＝(Vr-Vs)/Vm
其中，Vr为最终分离得到的某一部分的保留体积，Vs为柱内固定相体积，Vm为流动相体积。
经发明人的研究发现，分离纯化虫草素的两相溶剂的优选的分配系数K值在0.65到1.0之间。
在符合上述条件的情况下，本发明所述步骤2中可以优选以下的任一种溶剂系统：
(1)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝1∶1∶1∶1，V/V；
(2)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝10∶40∶50∶100，V/V；
(3)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝14∶80∶30∶155，V/V；
(4)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝18∶70∶30∶200，V/V；
(5)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝20∶60∶30∶225，V/V；
(6)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝25∶70∶28∶145，V/V；
(7)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝25∶75∶25∶150，V/V；
(8)正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水＝3～5∶46∶4～6∶4～6，V/V；
(9)乙酸乙酯∶正丁醇∶甲醇∶水＝4～5∶3～5∶3～5∶3～5，V/V；
(10)乙酸乙酯∶甲醇∶水＝9～11∶2～5∶9～11，V/V；
(11)正丁醇∶甲醇∶0.4％冰乙酸＝12～15∶70～90∶20～40∶140～160，V/V。
在使用上述溶剂系统进行高速逆流色谱分离纯化时，作为本发明的一种实施方式：所述的步骤2中的高速逆流色谱分离纯化条件是：以两相溶剂体系中的上相溶剂做为固定相，下相溶剂做为流动相，并采取首端进样，以10.0～20.0ml/min的流速泵入上相溶剂，待上相溶剂泵满后，开动高速逆流色谱的主机，选择转速为500～1000转/分后以1～5ml/min的流速开始泵入下相溶剂，同时接收流出来的上相溶剂，当有下相溶剂从管末端流出时，记录所流出来的上相溶剂，以计算两相溶液系统的保留值，然后进样1.5～2.5ml浓度为0.1～0.3g/ml的虫草素样品溶液，开始记录，设定检测波长为254nm，按照高速逆流色谱图收集图谱中的第三个目标峰的物质，得到虫草素纯品溶液。
本发明所述的步骤2中可根据虫草素纯品的需求量来决定进样次数，即如果虫草素纯品的需求量较大，则可以多次进行进样的操作。
在本发明中，所述的步骤1中的虫草素样品溶液可以直接采用经过常规技术纯化分离得到的虫草素样品溶液，或者是取已有的虫草素成品进行溶解配制所得的溶液，以上所述的虫草素样品溶液可以是虫草素水溶液或者是虫草素醇溶液。
为了取得更高的虫草素得率以及纯度，本发明人优化了虫草素粗提物的除杂以及分离提纯处理条件，以获得更加适合用于高速逆流色谱法分离的虫草素样品溶液，所述步骤1的虫草素样品溶液的制备包括以下步骤：
(1)取虫草素粗提物制备虫草素粗品溶液，然后去除虫草素粗品溶液中的沉淀物；
(2)对步骤(1)中经过预处理的虫草素租品溶液进行初步的分离提纯处理，去除溶液中的多糖和蛋白质等杂质，获得的虫草素样品溶液。
虫草素粗品含有大量的多糖、蛋白质等成分，在进行高速逆流色谱时虫草素与这些成分难以分离，若将虫草素粗品直接用于高速逆流色谱进行分离纯化，不仅需要的样品量大，而且分离的效率会大大降低，得到的虫草素的含量会很低，甚至无法得到高纯度的虫草素，因而需要在进行高速逆流色谱分离纯化前，对虫草素粗品进行初步的分离提纯处理，以减少虫草素样品溶液中的杂质。
本发明所述的步骤(1)中所述的虫草素粗提物可以是虫草属真菌的提取物，例如：蛹虫草水提物、蛹虫草醇提物、冬虫夏草水提物、冬虫夏草醇提物，这些提取物可以是溶液、膏状或者是干粉状。
本发明所述的步骤(1)所述的去除沉淀物的方式可以采用过滤或离心分离。在本发明中，推荐采用离心分离处理，可以快速的进行固液分离，将产生的沉淀去除。本发明推荐采用的离心条件为：转速3000～4500r/min，处理时间10～50min。
从虫草素的理化性质可知，它可以溶解于水、乙醇、正丁醇以及正丙醇等溶剂中，因此在所述的步骤(2)中可以采用水提醇沉、醇提水沉以及柱层析等方法对虫草素粗提物进行初步分离提纯处理，以去除虫草素粗品中大部分多糖和蛋白质等杂质。
本发明的一个优选实施例，本发明所述的步骤(2)中推荐采用阳离子交换树脂法进行初步的分离提纯的，其具体操作是：先用0.4～0.6mol/L的HCL将虫草素样品溶液的pH值调至3，把层析柱底部的螺旋打开，树脂床上层水缓缓滴下，待水弯月面接近树脂床平面时，然后顺管壁缓缓加入全部上清液，做到不冲床，待虫草素样品溶液完全进柱，加1～3倍过柱体积pH＝2～5的HCl平衡液，流速控制在10～20ml/min范围之间，虫草素被树脂吸附固定；用0.1～0.2mol/L的氨水洗脱液加到层析柱内对虫草素进行洗脱，流速控制在10～20ml/min范围之间，收集7倍过柱体积的洗脱液，得到虫草素样品溶液。
本发明中还可以在所述步骤(2)中采用高效液相色谱法(HPLC)检测经阳离子交换树脂法分离所得的虫草素样品溶液的纯度以及浓度，以判断是否需要进行再次的阳离子交换树脂法分离纯化，并能根据所测得的虫草素样品溶液浓度结果来调整用于高速逆流色谱分离纯化的虫草素样品溶液的浓度。
本发明采用高效液相色谱法测定的色谱条件推荐为：
流动相：甲醇∶水＝13～17∶70～95(V/V)，检测波长：260nm，柱温：室温，流速：0.5～1.5ml/min，进样量：20μl，tR，8～10min。
本发明还包括以下获得虫草素结晶纯品的步骤：3.将由步骤2得到的虫草素纯品溶液在30～100℃和0.1-0.2兆帕的条件下减压蒸馏，得到干燥物，将所述的干燥物用甲醇重溶，所述的干燥物质量与甲醇体积之间的比例为0.5～2∶4～7，在4℃析出虫草素结晶纯品。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明中采用的两相分配系数K值在0.5～1.0范围之间的两相溶剂系统对虫草素具有相当好的分离效果，在高速逆流色谱中的分峰效果非常好，因而分离所得到的虫草素纯品的纯度非常高，均可达到98％以上。
(2)本发明在进行高速逆流色谱分离纯化虫草素时，将流动相的流速控制在1～5ml/min范围内，而仪器转速控制在500～1000转/分范围内，可以获得较高固定相的保留值，有利于色谱峰的分离，即能使虫草素和其它杂质成分尽可能分离，能够获得高纯度的虫草素纯品。
(3)本发明优化了虫草素粗提物的除杂以及分离提纯处理条件，将虫草素粗提物中的多糖、蛋白质等成分，获得更加适合用于高速逆流色谱法分离的虫草素样品溶液，为高速逆流色谱的分离提供了良好的分离条件，以取得更高的虫草素得率以及纯度。
(4)本发明操作方法简单、方便和快捷，一次性可以得到虫草素纯品，若K值控制在0.65～1.0范围内，并采用所述优化的改进措施，甚至可以得到纯度达到98.9％以上的虫草素标准品。而且实验证明本发明最佳实施方案甚至最高可以达到99％的纯度，为虫草素标准品的快速制备提供了非常好的研究思路。
附图说明
图1是虫草素标准品的高效液相色谱图；
图2是虫草素粗品的高效液相色谱图；
图3是虫草素粗品经732-阳离子交换树脂分离，收集的酸固定液的高效液相色谱图；
图4是虫草素粗品经732-阳离子交换树脂分离的碱洗脱液的高效液相色谱图；
图5是实施例一中的虫草素样品的HSCCC的色谱图；
图6是实施例一中的虫草素样品的HSCCC的色谱图中的C峰的物质的高效液相色谱图；
图7是实施例一中所得的C峰的物质晶体的高效液相色谱图；
图8是实施例一中五次连续进样的HSCCC的色谱图；
图9是实施例一中所得的虫草素晶体的高效液相色谱图；
图10是实施例一中所得的虫草素晶体的紫外光谱；
图11是实施例一中所得的虫草素晶体的红外光谱；
图12是实施例一中所得的虫草素晶体的电喷雾全扫描正离子一级质谱图；
图13是实施例一中所得的虫草素晶体的正离子模式下m/z252的2级串联质谱图；
图14是实施例一中所得的虫草素晶体的氢谱；
图15是实施例一中所得的虫草素晶体的碳谱；
图16是实施例二中所得的虫草素晶体的高效液相色谱图；
图17是实施例三中所得的虫草素晶体的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例一
实验中所用到的实际与药品如表1所示
表1 实验药品及试剂
1.样品预处理
取虫草素粗提品900ml，离心分离20min，转速3500r/min。约得上清液800ml。将收集好的上清液密封好，低温储存，备用。
采用高效液相色谱法对虫草素粗提品的上清液中虫草素的含量进行了测定，色谱条件为：流动相：甲醇∶水＝15∶85(V/V)，检测波长：260nm，柱温：室温，流速：1ml/min，进样量：20μl，tR约为10min。其色谱图参见图2。
从色谱图中我们可以看出，虫草素粗提品中物质很杂，特别是高效液相色谱图前面部分有很多杂质峰，但尽管如此，在9.6min仍有一很高的色谱峰，其保留时间与标准色谱图(图1)相一致，可能就是虫草素，但含量比较低，大致有29.36％。由于虫草素粗提品含有较多的杂质，直接用于高速逆流色谱进行分离纯化难度比较大，且需要很多的样品。根据文献报道，离子交换树脂可以对虫草素的粗提物进行初步分离提纯，为此可以把虫草素粗提品采用离子交换树脂进行精制，提高虫草素的含量，然后再采用逆流色谱进行分离纯化。
2.虫草素纯品的制备
2.1虫草素粗品的分离提纯
虫草素粗品的离子交换树脂分离
(1)树脂预处理
由于新的离子交换树脂需要经过活化后才能使用，所以在装柱前先要将备用的离子交换树脂进行活化处理，具体步骤如下：
称取约650ml新的732-阳离子交换树脂1000g，然后用2mol/LNaOH置摇床振荡浸洗2h以上，用蒸馏水冲洗至呈中性，再用2mol/L HCl置摇床振荡浸洗2h以上，而后用蒸馏水冲洗至呈中性，再次用2mol/L NaOH摇床振荡浸洗2h以上，用蒸馏水冲洗至呈中性，再一次用2mol/L HCl摇床振荡浸洗2h以上，用蒸馏水冲洗至呈中性，水封备用。
(2)装柱、平衡
先在空柱中装入少量蒸馏水，开启螺旋夹，赶走气泡，使水缓缓下滴，将带水的树脂通过漏斗连续装入层析柱中，装至3/4～2/3柱高，防止断层和气泡，若装柱过程中产生气泡，先停止装柱，然后用玻棒搅动树脂让气泡析出后继续装柱。树脂床顶呈平面状态，并低于水平面，装好后，用3倍柱体积pH＝3的HCl平衡液过柱，待流出液pH值恒定时停止。
(3)加样、固定
先将800ml虫草素粗提品的上清液用0.5mol/L的HCL溶液，将其pH值调为3，把层析柱底部的螺旋打开，树脂床上层水缓缓滴下，待水弯月面接近树脂床平面时，然后顺管壁缓缓加入全部上清液，做到不冲床，待样品液完全进柱，加2倍过柱体积pH＝3的HCl平衡液，流速为15ml/min，虫草素定被树脂吸附固，同时去处部分杂质。
从图3可以看出，在t＝9.6min时不出峰，结果表明经pH＝3的HCl平衡液固定洗脱后，上清液中的虫草素基本固定在离子交换树脂中，但在虫草素粗提品中出现在高效液相色谱图中前面的杂质峰的杂质通过酸洗，却有相当一部分被洗脱下来。
(4)洗脱与收集
将0.15mol/L的氨水洗脱液加到层析柱内，流速为15ml/min，收集7倍过柱体积，得到纯度较高的虫草素样品溶液。用HPLC检测离子柱的除杂效果，结果如图4所示。
如图3和图4所示，从HPLC色谱图上可以看到，经过酸洗后，前面的色谱峰已经被去掉，而通过氨水溶液的解吸后，后面的色谱峰被分开了，从保留时间上可以看出虫草素是一个主要的色谱峰，虫草素的百分含量从29.36％提高到44.70％，分离提纯的效果显著为高速逆流色谱的分离提供了良好的分离条件。
2.2虫草素纯品的高速逆流色谱分离
因为高速逆流色谱是依靠组分在两相中不断进行连续液液萃取，使物质最终达到分离的，所以两相溶剂系统的选择是对样品进行成功分离的关键。使用选择的溶剂系统要使样品在互不相溶的两相溶剂中有合适的K值，理想的K值应在0.65～1.0之间。
K＝(Vr-Vs)/Vm
上式中，Vr为最终分离得到的某一部分的保留体积，Vs为柱内固定相体积，Vm为流动相体积。当K＝0时，表示样品完全分配在流动相中，随流动相流出，固定相中没有保留；当K值接近1.0时，若固定相与流动相体积相当，则组分在流动相中1∶1进行分配，该溶剂系统能使组分得到最佳分离。
通常来说，两相溶剂系统应满足以下要求：(1)为了保证不低于50％的固定相保留值合适，溶剂体系的分层时间小于30s；(2)目标样品的分配系数K接近于1，容量因子应大于1.5；(3)上下两相的体积大致相等，以免浪费溶剂；(4)尽量采用挥发性溶剂，以方便后续处理，易于物质纯化。
在本实施例中，使用正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝23∶80∶30∶155(V/V)作为分离虫草素的两相溶剂体系，其K值为0.66，我们采用制备型逆流色谱，按上述比例在将四种溶剂混合于2L的分液漏斗中，充分振荡让其混合均匀，然后静置12h，让溶剂分层，使用前将上下相溶液分开。
在HSCCC的分离过程中，以用两相溶剂体系中的上相溶剂做为固定相，下相溶剂做为流动相。由于下相溶剂为流动相，所以采取首端进样。以10ml/min的流速泵入上相溶剂，待上相溶剂泵满后，开动主机，调转速为850转/分然后以2.0ml/min的流速开始泵入下相溶剂，同时用量筒接收流出来的上相溶剂，当有下相溶剂从管末端流出时，记录所流出来的上相溶剂，以计算两相系统的保留值。在该HSCCC条件下保留值约为70％。然后通过六通阀进样2ml浓度为100mg/ml的虫草素样品溶液，开始记录，设定检测波长为254nm，按照图5所示的色谱图收集每个分离出的物质。
2.3.HSCCC的分离后，虫草素的检测
用HSCCC分离虫草素后，对C峰作HPLC检测，色谱条件为：流动相：甲醇∶水＝15∶85(V/V)，检测波长：260nm，柱温：室温，流速：1ml/min，进样量：20μl，tR约为10min，结果如图6所示，所得的虫草素纯品中虫草素质量百分含量为98.88％。
将得到的虫草素纯品溶液在30～100℃和0.1～0.2兆帕的条件下减压蒸馏，得到干燥物，将所述的干燥物用甲醇重溶，所述的干燥物质量与甲醇体积之间的比例为1∶5，在4℃析出虫草素结晶，即得到虫草素结晶纯品。
接着，把少量结晶溶解于1ml纯水中，用HPLC检测晶体纯度。色谱条件为：流动相：甲醇∶水＝15∶85(V/V)，检测波长：260nm，柱温：室温，流速：1ml/min，进样量：20μl，tR约为10min，结果如图7所示。
综上所述，经过HSCCC分离提纯后可得纯度约为98.90％的虫草素结晶纯品，即虫草素结晶纯品中虫草素质量百分含量为98.90％。
2.4.高速逆流色谱制备的放大
为了进一步大量制备虫草素纯品，必须将虫草素样品溶液的量加大，开始采用增加进样量的方法。实验发现，当虫草素样品溶液进样量过大时，分离度下降比较严重，如进样量达到20ml，系统已经不能把样品组分作有效分离。然后，尝试采用在进样量保持不变的情况下适当提高虫草素样品溶液的浓度，由虫草素的初始浓度0.025g/ml提高到0.1g/ml，流动相流速从1.0ml/mim逐步提高到2.0ml/min，峰分离的效果没有明显变坏。连续五次进样，结果发现除第一次进样稍有固定相流失现象外，后续四次进样均没有发现有固定相流失现象，而且目标峰的峰的分离效果良好，如图8所示。五次进样所收集目标峰的混合液，用高效液相色谱检测虫草素的含量，结果达到98.5％。
3紫外、红外、质谱、核磁四大谱确定虫草素的结构
首先将本实施例制备的纯品和标准品进行保留时间的比对，进行初步的认定，然后采用薄层色谱、熔点测定、紫外、红外、质谱、元素分析、核磁等综合手段对制备的虫草素的结构进行了测定，确定制备的纯品为虫草素的结构。
3.1纯品和标准品的液相色谱
选择流动相：流动相：甲醇∶水＝15∶85(V/V)，检测波长：260nm，柱温：室温，流速：1ml/min，进样量：20μl，tR约为10min。虫草素标准品的色谱图见图1，而本实施例所得纯品的色谱图见图9。
结论：从色谱图中可以看出，标准品和制备所得纯品保留时间一致，可以初步确定制备的为虫草素纯品。
3.2纯品的结构测定结果
3.2.1薄层色谱
仪器：WFH-203三用紫外分析仪 上海精科实业有限公司
测定结果：在254nm下观察
展开剂：氯仿∶乙酸乙酯∶异丙醇∶水＝8∶2∶6∶0.5(V/V)混合液8.25ml作为展开剂，样品用甲醇溶解，毛细管点样层析，结果在WFH-203三用紫外分析仪观察计算，Rf为0.42。
结论：与文献《蛹虫草培养基的综合利用研究》(孙诗清硕士学生论文20056：6-20)公开的Rf为0.43基本一致。
熔点测定
熔点测定：仪器：双目显微熔点测定仪北京泰克仪器仪器有限公司
结论：224-226℃，与文献《蛹虫草培养基的综合利用研究》的226-227℃基本接近。
3.2.2紫外：
检测仪器：日本岛津UV-210可见-紫外分光光度仪
检测依据：常规紫外分光光度法
3.2.3红外：
检测仪器：美国MSGNA-760红外光谱仪
检测依据：常规红外光谱法
3.2.4质谱：
检测仪器：美国热电Deca XP Finningan液质联用仪
检测依据：常规液质联用法
3.2.5核磁：
检测仪器：美国AVANCE 400 Digital MNR核磁
检测依据：常规核磁测定法
结论：从紫外(图10)、红外(图11)、质谱(图12和13)及核磁(图14和15)的结果分析中，可以确定，本实施例制备的纯品物质的结构就是虫草素。
4.最小包装量的确定和均匀性检验
按照国标GB/T-15000.3-2008/ISO Guide 35：2006国家标准，按本实施例制备虫草素纯品样本数10个，每个测定三次，根据虫草素标准品纯度的测定方法及色谱条件，进行瓶间均匀性研究。
测定数据如下：
表2 虫草素纯度的瓶间均匀性研究的测量数据 单位：质量百分含量(％)
运用方差分析对数据进行处理和分析，结果如下：
表3.虫草素纯度瓶间均匀性分析结果：
| 平均值 | 99.59 |
| MSamong | 0.0017 |
| MSwithin | 0.0038 |
| sr | 0.062 |
| sbb | 0.041 |
结论：虫草素纯品的瓶间和瓶内的方差非常小，说明虫草素纯品是非常均匀的。
5.稳定性实验
5.1检测方法的选取：按照国标GB/T-15000.3-2008/ISO Guide 35：2006国家标准，采用回归曲线作为模型，通过测定直线的斜率的显著性，来判断本发明制备的虫草素纯品的稳定性。
5.2根据虫草素标准品纯度的测定方法及色谱条件，开始每周测定1次，连续测定四周，一个月以后，每半个月测定一次，连续测定一个月，然后每个月测定一次，连续进行三个月，最后每个季度测定一次，连续测定了四个季度。
5.3运用方差分析对数据进行处理和判断，测定数据如下：
表4.不同的测定时间虫草素的纯度
| 测定时间 | 纯度 |
| 第1天 | 99.63 |
| 第7天 | 99.61 |
| 第14天 | 99.56 |
| 第21天 | 99.57 |
| 第28天 | 99.55 |
| 第43天 | 99.58 |
| 第58天 | 99.65 |
| 第73天 | 99.66 |
| 第103天 | 99.49 |
| 第133天 | 99.59 |
| 第193天 | 99.45 |
| 第283天 | 99.58 |
| 第373天 | 99.57 |
| 第463天 | 99.48 |
| 第553天 | 99.55 |
5.4结论：
该虫草素纯品的相对平均偏差CV＝0.16＜0.3(HPLC)，小于高效液相色谱的相对平均偏差，说明该虫草素纯品是稳定的。
6.虫草素的定值测定
按照国标GB/T-15000.3，由山东省分析测试中心、广州分析测试中心、中山大学分析测试中心、广东省食品研究所、广东省化学研究所、华南师范大学化学与环境学院等六家单位，根据上述虫草素标准品纯度的测定方法及色谱条件对虫草素的纯度进行了测定，其测试数据如下：
表5.不同实验室虫草素纯度测定数据
结论：该虫草素纯品的总平均值为：平均值的置信区间为：μ＝99.804±0.139不确定度为：
实施例二：
与实施例一不同的是：所述的分离虫草素的两相溶剂体系为正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝25∶75∶25∶150，K＝0.5，得到质量百分含量为98.79％的虫草素纯品(图16，t＝9.81)。
实施例三：
与实施例一不同的是：所述的分离虫草素的两相溶剂体系为正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝25∶70∶28∶145(V/V)，K＝1.0，得到质量百分含量为99.85％的虫草素纯品(图17，t＝9.79)。
Claims (6)
1.一种利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)制备虫草素样品溶液：取虫草素粗提物制备虫草素粗品溶液，然后去除虫草素粗品溶液中的沉淀物，然后用0.4～0.6mol/L的HCL将虫草素样品溶液的pH值调至3，把层析柱底部的螺旋打开，树脂床上层水缓缓滴下，待水弯月面接近树脂床平面时，然后顺管壁缓缓加入全部上清液，做到不冲床，待虫草素样品溶液完全进柱，加1～3倍过柱体积pH＝2～5的HCl平衡液，流速控制在10～20ml/min范围之间，虫草素被树脂吸附固定；用0.1～0.2mol/L的氨水洗脱液加到层析柱内对虫草素进行洗脱，流速控制在10～20ml/min范围之间，收集7倍过柱体积的洗脱液，得到虫草素样品溶液；
(2)根据虫草素的理化性质配制用于高速逆流色谱的两相分配系数K值在0.5～1.0范围之间的两相溶剂系统，然后采用所述的两相溶剂系统对所述步骤1所得的虫草素样品溶液进行高速逆流色谱分离纯化，进样1.5～2.5ml浓度为0.1～0.3g/ml的虫草素样品溶液，收集流出的流动相溶液或固定相溶液，从而得到虫草素纯品溶液；
所述溶剂系统选择以下的任一种：
(1)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝1∶1∶1∶1，V/V；
(2)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝10∶40∶50∶100，V/V；
(3)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝14∶80∶30∶155，V/V；
(4)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝18∶70∶30∶200，V/V；
(5)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝20∶60∶30∶225，V/V；
(6)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝25∶70∶28∶145，V/V；
(7)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝25∶75∶25∶150，V/V；
(8)正己烷∶正丁醇∶甲醇∶水＝23∶80∶30∶155，V/V；
(9)乙酸乙酯∶正丁醇∶甲醇∶水＝4～5∶3～5∶3～5∶3～5，V/V；
(10)乙酸乙酯∶甲醇∶水＝9～11∶2～5∶9～11，V/V；
(11)正丁醇∶甲醇∶0.4％冰乙酸＝12～15∶70～90∶20～40∶140～160，V/V。
2.根据权利要求1所述的利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的高速逆流色谱分离纯化条件是：以两相溶剂体系中的上相溶剂做为固定相，下相溶剂做为流动相，并采取首端进样，以10.0～20.0ml/min的流速泵入上相溶剂，待上相溶剂泵满后，开动高速逆流色谱的主机，选择转速为500～1000转/分后以1～5ml/min的流速开始泵入下相溶剂，同时接收流出来的上相溶剂，当有下相溶剂从管末端流出时，记录所流出来的上相溶剂，以计算两相溶液系统的保留值，然后进样1.5～2.5ml浓度为0.1～0.3g/ml的虫草素样品溶液，开始记录，设定检测波长为254nm，按照高速逆流色谱图收集图谱中的第三个目标峰的物质，得到虫草素纯品溶液。
3.根据权利要求1或2所述的利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法，其特征在于，所述的步骤(1)所述的去除沉淀物的方式离心分离处理，离心条件为：转速3000～4500r/min，处理时间10～50min。
4.根据权利要求3所述的利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中采用高效液相色谱法检测经阳离子交换树脂法分离所得的虫草素样品溶液的纯度以及浓度，以判断是否需要进行再次的阳离子交换树脂法分离纯化，并能根据所测得的虫草素样品溶液浓度结果来调整用于高速逆流色谱分离纯化的虫草素样品溶液的浓度。
5.根据权利要求4所述的利用高速逆流色谱分离纯化法生产虫草素标准品的方法，其特征在于，所述的采用高效液相色谱法测定的色谱条件为：
流动相：甲醇∶水＝13～17∶70～95(V/V)，检测波长：260nm，柱温：室温，流速：0.5～1.5ml/min，进样量：20μl，tR：8～10min。
6.根据权利要求5所述的利用高速逆流色谱分离纯化虫草素的方法，其特征在于，还包括以下获得虫草素结晶纯品的步骤(3)：将由步骤2得到的虫草素纯品溶液在30～100℃和0.1-0.2兆帕的条件下减压蒸馏，得到干燥物，将所述的干燥物用甲醇重溶，所述的干燥物质量与甲醇体积之间的比例为0.5～2∶4～7，在4℃析出虫草素结晶纯品。
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