JP7410860B2 - Ｐｅｇ化タンパク質組成物を提供するための方法 - Google Patents

Description

発明の分野
本発明は、PEG化タンパク質組成物を提供するための方法、特に、モノPEG化タンパク質組成物を提供するために方法に関する。特に、本発明は、モノPEG化エリスロポエチン（EPO）組成物を提供するための方法に関する。

背景
タンパク質のPEG化またはペグ化とは、タンパク質に対する1つまたは複数のPEG（ポリエチレングリコール）基の付加を指す。PEG化は、例えば、インビボ循環半減期を増加させるため、治療用タンパク質のために特に有用である。しかし、PEG化はまた、治療用タンパク質の生物活性を低減させ、それによってその有効性を低減させる可能性がある。したがって、循環時間の増加と治療効力の低減との間には、とるべき釣り合いがある。

ある特定の治療用タンパク質にとって、モノPEG化は、治療効力を有意に損なうことなく安定性の改善性を提供するため、特に望ましい。モノPEG化治療用タンパク質には、Mircera（登録商標）、PegIntron（登録商標）、およびPegasys（登録商標）が含まれる。Micera（登録商標）は、エリスロポエチン（EPO）のモノPEG化型であり、貧血を処置するために用いられている。

PEG化反応は、非PEG化タンパク質（未反応タンパク質）とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む混合物を生成する傾向がある。高度のPEG化に有利な反応条件（例えば、長い反応時間、高いPEG/タンパク質のモル比）は、高い割合のオリゴPEG化タンパク質を有する混合物を生成する傾向があり、これは、モノPEG化タンパク質が所望の生成物である場合に、低い収率を結果としてもたらす。低度のPEG化に有利な反応条件（例えば、短い反応時間、低いPEG/タンパク質のモル比）は、高い割合の未反応（非PEG化）タンパク質を有する混合物を生成する傾向があり、これもまた、モノPEG化タンパク質が所望の生成物である場合に、低い収率を結果としてもたらす。

治療用タンパク質は、多くの場合、製造するのが高価であり、したがって、モノPEG化治療用タンパク質の良好な収率（未反応および/またはオリゴPEG化としての治療用タンパク質の最小の廃棄）を提供するプロセスは、経済的に有利であり、したがって、特に望ましい。

PEG化の特異性を操作し、それによって所望の程度のPEG化を有するタンパク質の収率を改善する試みにおいて、関心対象のタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーカラムに結合させながらPEG化する方法が、開発されている（いわゆる「オンカラム」法）。そのような方法は、技術的に複雑であり、時間を浪費し、かつ結果的に、生産性が低い。そのような方法はまた、相対的に大量のPEG化試薬を消費する可能性があり、経済的に不利になる。様々な「オンカラム」PEG化法が、Pfister (Reac React. Chem. Eng., 2016, 1,204)、Ingold (2016)、およびFee & Van Alstine (2006)において議論されている。

モノPEG化タンパク質を提供する方法は、非PEG化タンパク質（未反応タンパク質）とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む混合物を提供するようにPEG化反応を実施すること、ならびに次いで、モノPEG化タンパク質を精製するための精製ステップを実施することを含んでもよい。

WO 2009/010270およびWO 2012/035037は、モノPEG化EPOを、非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む混合物から精製するための方法に関する。精製方法は、PEG化反応から結果として生じた混合物を、少なくとも1つのカチオン交換クロマトグラフィー（CEC）ステップに供する工程を含む。CECステップは、結合モードおよび溶出モードにおいて実施され、異なる溶出画分が、主として非PEG化EPO、モノPEG化EPO、またはオリゴPEG化EPOを含む。そのようなCEC法は、タンパク質の等電点よりも下で行われなければならず、EPO（4.0～5.5の範囲の等電点）の場合には、3.0あたりのpHでのCECを含む。

PEG化反応を実施する工程、および次いで、結果として生じた混合物からモノPEG化タンパク質を精製する工程による、モノPEG化タンパク質を生成するための方法は、未反応（非PEG化）タンパク質の再利用を含んでもよい。これらの方法は、未反応タンパク質を回収すること、およびそれを、その後のPEG化反応に加えることを含む。そのような再利用は、モノPEG化タンパク質の全体的な収率を改善する。

Pfister (Biotech and Bioeng, 2016)は、PEG化反応が実施され、未反応（非PEG化）タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む混合物からのモノPEG化タンパク質の精製がその後に続く、プロセスを記載する。プロセスにおいて、未反応タンパク質が回収され、その後のPEG化反応に用いられる。精製プロセスは、結合モードおよび溶出モードにおけるカチオン交換クロマトグラフィー（CEC）を含み、そこで、未反応タンパク質、モノPEG化タンパク質、およびオリゴPEG化タンパク質が、順次溶出において分離される。高塩濃度溶出緩衝液を用いて、未反応タンパク質が最後に溶出される。CECの最終段階での未反応タンパク質の溶出は、それが再利用の前に透析ろ過によって処理されるため、未反応タンパク質の再利用を遅らせ、それによって、プロセスの全体的な生産性を低減させる。

本発明は、上記の考慮すべき問題に照らして考案されている。

本発明は、モノPEG化タンパク質組成物を提供するための方法に関する。本発明の方法は特に、モノPEG化EPO組成物を提供するのに適している。本明細書に記載される方法の利点は、モノPEG化生成物の高い収率および生産性、ならびに高い純度を含む。

本発明は、非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物が、二段階疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）ステップに供される方法に関する。二段階HICステップは、特定の条件（「二段階HIC条件」）下で、タンパク質混合物を2つのHIC材料にアプライすることを含む：それらの条件下では、第1のHIC材料がオリゴPEG化タンパク質のみと結合し、同じ条件下で、第2のHIC材料がモノPEG化タンパク質と結合する。すなわち、第1のHIC材料は、二段階HIC条件下で、オリゴPEG化タンパク質と結合するが、非PEG化タンパク質ともモノPEG化タンパク質とも結合しない。第2のHIC材料は、二段階HIC条件下で、モノPEG化タンパク質と結合し、かつ、二段階HIC条件下で、オリゴPEG化タンパク質と結合することができるが、本明細書に開示される方法において、オリゴPEG化タンパク質の実質的にすべては、第1のHIC材料によって既に除去されている可能性があり、そのため、本発明を行う際、第2のHIC材料は、オリゴPEG化タンパク質と必ずしも結合せず、かつ有意な量のオリゴPEG化タンパク質とも結合しない。

特に、本発明は、以下の工程を含む、少なくとも約90％のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法を提供する：（a）非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物を提供する工程；（b）タンパク質混合物を二段階疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）ステップに供する工程であって、第1のHICフロースルー溶液を提供するために、タンパク質混合物を第1のHIC材料にアプライすること；および、第2のHICフロースルー溶液を提供するために、第1のHICフロースルー溶液を第2のHIC材料にアプライすることを含み、第2のHIC材料が、第1のHIC材料とは異なっており；かつ、二段階HICステップが、オリゴPEG化タンパク質を第1のHIC材料に結合させかつモノPEG化タンパク質を第2のHIC材料に結合させるのに適している二段階HIC条件下で実施される、工程；ならびに、（c）モノPEG化タンパク質組成物を提供する第2のHIC溶出液を提供するために、モノPEG化タンパク質を第2のHIC材料から溶出させる工程。

「第2のHIC溶出液」はまた、二段階HICステップにおける第2のHIC材料からの溶出液であるため、「第2のHIC材料溶出液」とも呼ばれ得る。

本明細書に開示される方法において、モノPEG化タンパク質組成物は、相対的に高い割合のモノPEG化タンパク質を含有し得る。例えば、タンパク質組成物は、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、または少なくとも約99.9％のモノPEG化タンパク質を含み得る。

前記タンパク質は、エリスロポエチン（EPO）であってもよい。タンパク質は、ホルモンであってもよい。タンパク質は、ホルモン、サイトカイン、酵素、または抗体であってもよい。

モノPEG化タンパク質は、タンパク質の非PEG化バージョンおよびオリゴPEG化バージョンに比べて、半減期の増加と匹敵する生物活性との間の釣り合いを提供するため、望ましい可能性がある。しかし、PEG化反応は、非PEG化タンパク質（未反応タンパク質）とモノPEG化タンパク質とリゴPEG化タンパク質とを含む混合物を生成する傾向がある。タンパク質、特に治療用タンパク質は、多くの場合、製造するのが高価であり、したがって、モノPEG化治療用タンパク質の良好な収率を提供する方法が、特に望ましい。モノPEG化EPO（Mircera（登録商標））の良好な収率を提供する方法は、特に望ましい。

本明細書に開示される方法は、その後の処理およびその後のPEG化反応における再利用のために非PEG化タンパク質（未反応タンパク質）の迅速な回収を可能にし得るため、有利である。非PEG化EPOは、回収されて再利用され得、したがって、出発タンパク質のより大きな割合が、モノPEG化されるようになるため、本明細書に開示される方法は、相対的に高い収率を可能にし得る。

本明細書に開示される方法は、非PEG化タンパク質がモノPEG化タンパク質の後に回収される、非PEG化タンパク質を再利用する方法に比べて、有利である。これは、本明細書に開示される方法が、モノPEG化タンパク質の回収の前の、方法の早期での非PEG化タンパク質の回収を可能にし、非PEG化タンパク質が、方法の後期と並行して処理され、かつ再利用され得ることを意味するためである。これは、非PEG化タンパク質の再利用の工程を含む方法の全体的な生産性を増大させる。本明細書に開示される方法は、生理学的pHに近いpHで実施され得るHICを含むため、有利である。これは、タンパク質の安定性を改善し得る。本発明の方法は特に、モノPEG化EPO組成物を生成するのに適している。これは、3.0またはそれよりも低いpHで概して実施される、モノPEG化EPOを生成するためのカチオン交換クロマトグラフィー（CEC）を含む方法を上回って有利である。約pH 3.0またはそれよりも低い酸性条件は、EPOの品質に対して有害効果を有する可能性があり、そのような有害効果が、CECを必要とせず、したがってCECベースのEPOの精製に必要な低いpH条件を必要としない、本発明の方法において低減される。

さらに、EPOの酸性型（酸性バリアント）は、それらを特に有用にする高い治療活性を有する可能性がある。しかし、CECによるEPOのモノPEG化酸性型の回収は、そのCECにおける溶出条件が、EPOのジPEG化非酸性型のものに類似しているため、不十分であり得る。酸性条件は、タンパク質分子におけるアミノ酸の側鎖の酸化を結果としてもたらす。CECは、その電荷に従ってタンパク質分子を分離するため、ある1つの種の塩基性バリアントは、酸性バリアントよりも後に溶出することになる。この理由で、EPOのジペグ化非酸性型のCEC溶出プロファイルは、EPOのモノPEG化酸性型とオーバーラップする傾向がある。これらの有用なモノPEG化酸性EPO型のCECによる不十分な回収は、モノPEG化EPOをオリゴPEG化EPOから分離するためにCECに依拠しない、本明細書に開示される方法において低減される。

HICによるタンパク質の精製は、電荷よりもむしろ、タンパク質の疎水性に基づく。本明細書に開示される方法は、酸性型によって、またはタンパク質の電荷に影響を及ぼすグリコシル化バリアントによって、相対的に影響を受けないため、有利であり得る。PEG化は、タンパク質の疎水性に大いに影響を及ぼし得るため、本明細書に開示される方法は、モノPEG化タンパク質組成物を提供するために、特に有用である。

モノPEG化EPOを提供する本発明に関連する利点は、他のタンパク質、特に他の治療用タンパク質に適用され得る。すなわち、低いpH条件の回避および酸性バリアントの回収は、本発明を、モノPEG化EPO以外のモノPEG化タンパク質を提供するために有用にし得る。

本明細書に開示される方法は、非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物を用いて、モノPEG化タンパク質組成物を生成するためである。本明細書に開示される方法において、2つのHIC材料が、二段階HICステップにおいて連続して用いられる。2つのHIC材料は、互いに異なっており、二段階HICステップのために用いられる条件下で、第1のHIC材料がオリゴPEG化タンパク質と結合し（しかしモノPEG化タンパク質とは結合せず）、第2のHIC材料がモノPEG化タンパク質と結合し、かつ第1のHIC材料も第2のHIC材料も非PEG化タンパク質と結合しないように、選択される。したがって、タンパク質混合物が第1のHIC材料を通過する際に、オリゴPEG化タンパク質が捕捉され（かつ後に溶出させることができ）、第2のHIC材料を通過する際に、モノPEG化タンパク質が（後の溶出のために）捕捉される。非PEG化タンパク質は、第1のHIC材料および第2のHIC材料の両方を通過し、フロースルーにおいて二段階HICステップから除去することができ、その後再利用されてもよい。したがって、非PEG化（未反応）タンパク質は、再利用のためにタンパク質混合物から非常に迅速に回収される。モノPEG化タンパク質組成物を提供するために、モノPEG化タンパク質は、次いで、第2のHIC材料から溶出される。

同じHIC条件が、第1のHIC材料および第2のHIC材料の両方を含むHICのために用いられる（これらは、「二段階HIC条件」と呼ばれ得る）。これは、HICステップの第1段階と第2段階との間で緩衝液を交換する必要がないことを意味する。二段階HIC条件は、均一濃度であってもよい。第1のHIC材料からのフロースルー溶液の組成を、第2のHIC材料にアプライする前に、コンディショニングするかまたは変更する必要はない。第1のHIC材料からのフロースルー溶液を、第2のHIC材料に直接アプライすることができる。これは、時間を浪費するHIC条件の調整を省き、それによって効率および生産性を改善する。これは、第1のHICステップ由来のフロースルー溶液が迅速にかつ効率的に第2のHIC材料に送達され得るように、第1のHIC材料および第2のHIC材料が、直列に直接接続されていてもよいことを意味する。全体的なプロセスは、相対的に速く、安価であり、かつ効率的である。

二段階HICステップは、2つの異なるHIC材料を用いる。第1のHIC材料を用いて、単にまたは主にオリゴPEG化タンパク質を捕える（すなわち、捕捉する、結合させる、除去する）。第2のHIC材料は、単にまたは主にモノPEG化タンパク質を捕えるために用いられる。これの利点は、第1のHIC材料の結合能力が、単にまたは主に、所望ではないオリゴPEG化タンパク質（本文脈における混入物）と結合するために用いられ、第2のHIC材料が、単にまたは主に、所望のモノPEG化タンパク質（本文脈における生成物）を結合させるために用いられることである。これは、プロセスが、使用されるHIC材料の量に比べて相対的に高い生産性を有することを意味する。利用可能な結合能力の大部分またはすべてが、混入物または生成物のいずれかを結合させるために用いられるため、ロードが相対的に高いことができる。すなわち、HIC材料にアプライされるタンパク質混合物の量は、相対的に高いことができる。これは、全体的なプロセスが、時間内に、またはサイクル当たりに、大量のモノPEG化タンパク質組成物を生成することができるため、相対的に高い生産性を有することを意味する。

前記方法は、HEPESなどの緩衝剤を含む緩衝液を用いて行われてもよい。緩衝液は、生理学的pH、例えば、pH 7.0～8.0、またはpH 7.5あたりであってもよい。緩衝液は、Na₂SO₄などの塩の変動する量を含有し得る。概して、平衡化緩衝液および洗浄緩衝液は、相対的に高い塩濃度（例えば、約400～600 mMまたは約500 mM）を含有するが、溶出緩衝液は、相対的に低い塩濃度（例えば、約0～300 mM）を含有する。

HIC材料は、フェニルリガンドを含んでもよい。第1のHIC材料は、Phenyl Sepharose HP（例えば、GE Healthcareから入手可能のHiTrap Phenyl HP）であってもよい。第2のHIC材料は、Toyopearl Phenyl 650 M（Tosoh Bioscience LLC）であってもよい。特に、モノPEG化タンパク質がモノPEG化EPOである場合には、第1のHIC材料は、Phenyl Sepharose High HPであってもよく、第2のHIC材料は、Toyopearl Phenyl 650 Mであってもよい。
[本発明1001]
以下の工程を含む、少なくとも約90％のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法：
（a）非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物を提供する工程；
（b）該タンパク質混合物を二段階疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）ステップに供する工程であって、
第1のHICフロースルー溶液を提供するために、該タンパク質混合物を第1のHIC材料にアプライすること；および
第2のHICフロースルー溶液を提供するために、該第1のHICフロースルー溶液を第2のHIC材料にアプライすること
を含み、
該第2のHIC材料が、該第1のHIC材料とは異なっており；かつ
該二段階HICステップが、オリゴPEG化タンパク質を該第1のHIC材料に結合させかつモノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料に結合させるのに適している二段階HIC条件下で実施される、該工程；ならびに
（c）該モノPEG化タンパク質組成物を提供する第2のHIC溶出液を提供するために、該モノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料から溶出させる工程。
[本発明1002]
前記タンパク質が、ホルモン、サイトカイン、酵素、または抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記タンパク質がエリスロポエチンである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
前記第1のHIC材料および前記第2のHIC材料が直列に直接接続されている、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記二段階HIC条件下で、前記第1のHIC材料が非PEG化タンパク質ともモノPEG化タンパク質とも結合せず、かつ前記第2のHIC材料が非PEG化タンパク質と結合しない、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
比較HIC溶出クロマトグラムにおいて、前記第1のHIC材料および前記第2のHIC材料が、モノPEG化タンパク質について十分に分解されたピークを有する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
（a）前記第1のHIC材料が、前記二段階HIC条件下でPhenyl Sepharose HPと実質的に同じ選択性を有し；かつ
（b）前記第2のHIC材料が、該二段階HIC条件下でToyopearl Phenyl 650Mと実質的に同じ選択性を有する、
前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
（a）前記第1のHIC材料がPhenyl Sepharose HPであり；かつ/または
（b）前記第2のHIC材料がToyopearl Phenyl 650Mである、
前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
さらなる（d）第1のHIC溶出液を提供するために、前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程
を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程が直線勾配溶出を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
i. 前記二段階HIC条件が、約54～55 mS/cmの伝導率におけるものであり；かつ/または
ii. 前記モノPEG化タンパク質を前記第2のHIC材料から溶出させる工程が、約40～41 mS/cmの伝導率におけるものであり；かつ/または
iii. 前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程が、約54～55 mS/cmから約1～5 mS.cmまでの直線勾配によって行われ、
かつ任意で、該タンパク質がEPOである、
前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記方法が、緩衝液Aと緩衝液Bの混合物を用いて行われ、緩衝液Aが25 mM HEPES、pH 7.5、500 mM Na ₂ SO ₄ を含み、かつ緩衝液Bが25 mM HEPES、pH 7.5を含み、かつ
i. 前記二段階HIC条件が、約13.5％の緩衝液Bにおけるものであり；かつ/または
ii. 前記モノPEG化タンパク質を前記第2のHIC材料から溶出させる工程が、約40％の緩衝液Bにおけるものであり；かつ/または
iii. 前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程が、約13.5％から約80％までの緩衝液Bの直線勾配によって行われ、
かつ任意で、該タンパク質がEPOである、
前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記第2のHIC材料からの前記モノPEG化タンパク質の溶出が、段階溶出と、任意で、その後に続く勾配溶出を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも約99％のモノPEG化タンパク質を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記タンパク質混合物が、少なくとも10％のオリゴPEG化タンパク質を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
モノPEG化タンパク質が、少なくとも約20 kDaの分子量を有するPEG残基を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記モノPEG化タンパク質組成物が薬学的組成物であり、前記方法が、前記第2のHIC溶出液を薬学的賦形剤と共に製剤化する工程をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。

添付の図面を参照して、本発明の原理を例証する態様および実験を次に議論する。
比較クロマトグラム。HIC材料であるToyopearl Phenyl 650M、Phenyl Sepharose HP、およびToyopearl PPG 600MのカラムのUVクロマトグラムの比較。Phenyl Sepharose HPカラム由来の画分の伝導率を、点線によって示す。カラムを、60 mS/cmで平衡化した。各カラムについての第1のピークは、カラムからのフロースルー溶液中にある非PEG化EPOである。モノPEG化EPOおよびオリゴPEG化EPOは、伝導率を約1 mS/cmまで減少させる、下降する塩勾配によって溶出される（これは、Na₂SO₄濃度を約500 mMから約0 mMまで減少させる、低塩濃度緩衝液Bの割合を0％から100％まで増加させることによって達成される）。最高のピークを有するトレースは、Toyopearl PPG 600Mであり、最も早いモノPEG化EPOピークを有するトレースは、Phenyl Sepharose HPであり、残りのトレースは、Toyopearl Phenyl 650Mである。 Phenyl Sepharose HPの詳細なクロマトグラム。垂直の線は、HPLC分析のために収集された画分a～fを示す。pH値は、全体を通しておよそ7.5である。0％から100％まで増加させた低塩濃度緩衝液Bの割合を、画分の伝導率と同様に示す。 比較クロマトグラム。Phenyl Sepharose HPおよびToyopearl Phenyl 650MカラムのUVクロマトグラムの比較。最も早いモノPEG化EPOピークを有するトレースは、Phenyl Sepharose HPであり、残りのトレースは、Toyopearl Phenyl 650Mである。pH値は、全体を通しておよそ7.5である。0％から100％まで増加させた低塩濃度緩衝液Bの割合を、Phenyl Sepharose HPカラム由来の画分の伝導率と同様に示す。 本明細書に開示されるような方法の態様を示すスキーム。図4Aは、直列に接続された第1のHIC材料（HIC 1）および第2のHIC材料（HIC 2）のカラムを示す。PEG化反応容器は、第1のHIC材料にアプライされるタンパク質混合物を提供する。第1のHIC材料上へのローディングのためにタンパク質混合物を調製する、介在するコンディショニングステップがあってもよい（コンディショニング）。二段階HICステップは、第1のHICフロースルー溶液を取得するために、タンパク質混合物を第1のHIC材料にアプライすることを含み、第1のHICフロースルー溶液が、第2のHICフロースルー溶液を取得するために、第2のHIC材料にアプライされる。第2のHICフロースルー溶液は、相対的に高い割合の非PEG化タンパク質を含有し、これは、その後のPEG化反応において再利用されてもよい。 本明細書に開示されるような方法の態様を示すスキーム。図4Bは、溶出緩衝液での第2のHIC材料の溶出を示し、この溶出は、モノPEG化タンパク質を第2のHIC材料から回収する。第2のHIC材料からの溶出液は、モノPEG化タンパク質組成物（所望の生成物）を提供する。 本明細書に開示されるような方法の態様を示すスキーム。図4Cは、溶出緩衝液での第1のHIC材料の溶出を示し、この溶出は、オリゴPEG化タンパク質を第1のHIC材料から除去する。 カラムの組み合わせ（第1のHIC材料のカラムおよび第2のHIC材料のカラム）のクロマトグラム。両方のカラムを介したローディング中に、非PEG化EPOは、フロースルー溶液中にある。41 mS/cmでの第2のカラムの溶出により、主として、モノPEG化EPOは、段階溶出において溶出するが、いくつかのオリゴPEG化EPOは、勾配溶出において溶出することが示される。54.5 mS/cmで開始する第2のカラムの溶出中には、少量のモノPEG化EPOが溶出する。勾配において、オリゴPEG化EPOは完全に溶出する。pH値は、全体を通しておよそ7.5である。0％から100％まで増加させた低塩濃度緩衝液Bの割合を、画分の伝導率と同様に示す。ピーク1～5の組成を下記の表6に要約する。

発明の詳細な説明
添付の図面を参照して、本発明の局面および態様を次に議論する。さらなる局面および態様が、当業者に明らかであろう。本文において述べられるすべての文書は、参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、モノPEG化タンパク質組成物を提供するための方法に関する。本発明は、少なくとも90％のモノPEG化タンパク質を含むタンパク質組成物を提供するための方法に関する。特に、本発明は、少なくとも90％のモノPEG化EPOを含むEPO組成物を提供するための方法を提供する。

モノPEG化タンパク質組成物
本文脈において、モノPEG化タンパク質組成物とはタンパク質を含む組成物であり、組成物中に存在するタンパク質の相対的に高い割合が、モノPEG化タンパク質として存在する。モノPEG化タンパク質組成物は、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、少なくとも約99.5％、少なくとも約99.9％、または少なくとも約99.99％のモノPEG化タンパク質を含み得る。

少なくともx％のモノPEG化タンパク質を含むタンパク質組成物とは、その組成物中に存在するタンパク質の少なくともx％がモノPEG化されている、タンパク質組成物を指す。例えば、少なくとも99％のモノPEG化タンパク質を含むタンパク質組成物は、組成物中に存在するそのタンパク質の少なくとも99％がモノPEG化されている、タンパク質組成物である。本発明の方法によって生成されるタンパク質組成物は、少なくとも約90％、少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、または99.99％のモノPEG化タンパク質を含み得る。

特に、本文脈において、モノPEG化EPO組成物は、EPOを含む組成物であり、組成物中に存在するEPOの相対的に高い割合が、モノPEG化EPOとして存在する。少なくとも「x％」のモノPEG化EPOを含むEPO組成物とは、その組成物中に存在するEPOの少なくとも「x％」がモノPEG化されている、EPO組成物を指す。例えば、少なくとも99％のモノPEG化EPOを含むEPO組成物は、組成物中に存在するEPOの少なくとも99％がモノPEG化されている、EPO組成物である。本発明の方法によって生成されるEPO組成物は、少なくとも約90％、少なくとも約95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、または99.99％のモノPEG化EPOを含み得る。本発明の方法によって生成されるEPO組成物は、少なくとも約98％のモノPEG化EPOを含み得る。本発明の方法によって生成されるEPO組成物は、少なくとも約99％のモノPEG化EPOを含み得る。

純度の決定のための方法は、当業者に公知である。非PEG化タンパク質、モノPEG化タンパク質、またはオリゴPEG化タンパク質の純度は、任意の適している分析の方法（例えば、ゲル上のバンド強度、ELISA、HPLCなど）によって決定されてもよい。純度の決定は、既知の純度の参照物質を用いて作成された標準曲線を用いることを含んでもよい。純度はまた、重量/重量ベースで決定されてもよい。パーセンテージに換算した（％の）本明細書において表される非PEG化タンパク質またはPEG化タンパク質の純度は、例えば、相対的な「曲線下面積」の値を用いて決定されてもよく、これは、典型的には、HPLCクロマトグラムなどのクロマトグラムにおけるピークについて取得することができる。純度を決定する方法は、RP-HPLCおよびサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を含む。

疎水性相互作用クロマトグラフィー
疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）は、分子を、その表面疎水性の違いに基づいて分離する。これを、タンパク質分子を分離するために用いることができる。HICにおいて、関心対象のタンパク質を含む混合物を、HIC材料を通過させてもよい。タンパク質とHIC材料との間の相互作用は、ある特定の塩の存在によって変更される。塩濃度の増加は、相互作用を増加させ、塩濃度の低減は、相互作用を低減させる。選択的溶出のために、塩濃度を低下させてもよく、混合物の成分は、疎水性の順に溶出し、最も疎水性の成分が最後に溶出する。本文脈において、これは、非PEG化タンパク質が最初にHIC材料を離れ、モノPEG化タンパク質が、オリゴPEG化タンパク質の前に溶出されることを意味する。

HIC材料などの、本文脈におけるクロマトグラフィー「材料」とは、固定相または固相を指す。これはまた、樹脂またはマトリックスまたは媒体とも呼ばれ得る。本文脈における「材料」は、関心対象のタンパク質などの混合物の成分が結合し得る、マトリックスを提供する。材料は、カラム、例えば、膨張床カラムまたは充填床カラムであってもよいか、またはそれを含んでもよい。材料は、離散性の粒子またはビーズの形態であってもよい。材料は、膜の形態であってもよい。材料は、多孔性モノリシック材料の形態であってもよい。材料は、官能基を有する繊維、フリース、またはメッシュの形態であってもよい。材料は、官能基を保有することができるか、またはHIC特性を呈する任意の他の固体支持体の形態であってもよい。本文脈において、移動相は、固定相を通って流れ、それでのクロマトグラフィーによって分離される物質を保有する。移動相は、タンパク質混合物またはフロースルー溶液などの混合物である。溶出緩衝液または洗浄緩衝液などの緩衝液もまた、移動相である。

本文脈において、「ローディング」という用語は、混合物または組成物をクロマトグラフィー材料上に接触させるステップを指す。クロマトグラフィー材料は、ローディングステップの前に平衡化されてもよい。

平衡化は、クロマトグラフィー材料に平衡化緩衝液をアプライすることを含む。平衡化緩衝液のpHおよびイオン強度は、タンパク質混合物がクロマトグラフィーマトリックス上にロードされた場合に、所望の結合および/またはフロースルーまたは特定のタンパク質または混入物が達成されることを確実にするように選択される。

ローディング条件は、混合物の望まれない成分（例えば、混入物）の結合を促進してもよい。このモードにおいて、関心対象のタンパク質は、イオン交換材料のマトリックスを通り過ぎて、収集されてもよい。このタイプの手順は、「フロースルー」モードとして公知である。イオン交換材料のマトリックスを通り過ぎた後に収集される組成物は、「フロースルー」または「フロースルー溶液」である。マトリックスから離れ、かつ関心対象のタンパク質を含有するフロースルー溶液はまた、「流出液」とも称され得る。関心対象のタンパク質をカラムから溶出させるために伝導率および/またはpHの変化を含む「結合および溶出」モードとは異なり、「フロースルー」モードは、均一濃度条件下で行われる。

疎水性相互作用クロマトグラフィー材料などのクロマトグラフィー材料からの溶出は、勾配溶出または段階溶出を用いて緩衝液のイオン強度を減少させることによって達成されてもよい。勾配溶出または直線勾配溶出は、個々の関心対象の多くの成分が、該材料に結合しており、かつ異なるように溶出され得る場合に、および高分解能分離のために用いられ得る。段階溶出は、クロマトグラフィー材料から単一の成分を除去する（または特定の群の成分を一緒に除去する）ために有用である。段階溶出は、相対的に速く、より少ない緩衝液を消費する。段階溶出は、関心対象のタンパク質をクロマトグラフィー材料から、相対的に濃縮された形態で溶出させるために用いられ得る。溶出ステップにおいてクロマトグラフィー材料から離れ、かつ関心対象のタンパク質を含有する溶液は、溶離液または溶出液として公知であり得る。

HIC材料
HIC材料は、疎水性リガンドで官能基化されている基本マトリックスを含んでもよい。HIC材料上の疎水性リガンドは、タンパク質の疎水性表面と相互作用し得る。HIC材料上のリガンドおよび置換の程度（高いかまたは低い置換「sub」）が、その最終的な疎水性に、およびそれによってその選択性に寄与し得る。リガンドは、アルキル基またはアリール基を含有し得る。HIC材料の疎水性は、リガンド系列：エーテル、ポリプロピレングリコール（PPG）、フェニル、ブチル、およびヘキシルを通して増大する。基本マトリックスは、Sepharoseまたはメタクリルポリマーであってもよい。

HIC材料には、Toyopearl Ether 650M、Toyopearl Hexyl 650C、Toyopearl Butyl 650M、Toyopearl PPG 600M、Toyopearl Phenyl 650 M（すべてTosoh Bioscience LLC由来）；Phenyl Sepharose FF (hi sub)、Phenyl Sepharose FF (low sub)、Phenyl Sepharose HP、Butyl Sepharose FF、Butyl-S Sepharose FF、Butyl Sepharose HP、Capto Butyl ImpRes、Capto Phenyl (hi sub)が含まれる。

HIC材料には、Toyopearl Phenyl 650S、TSKgel Phenyl 5PW、Butyl Sepharose 4 FF、Butyl-S Sepharose FF、Octyl Sepharose 4 FF、Phenyl Sepharose BB、Phenyl Sepharose HP、Phenyl Sepharose 6 FF High Sub、Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub、Source I SETH、Source 151 SO、Source 1 SPHE、Phenyl Sepharose BB、Cellufine Butyl、Cellufine Octyl、Cellufine Phenyl、WP HI-Propyl (C3)、Macroprep t-Butyl、Macroprep methylが含まれる。HIC材料には、官能基を保有することができるか、またはHIC特性を呈する、任意の他の適している固体支持体が含まれる。

本発明の方法は、二段階HICステップを含む。二段階HICステップは、2つの異なるHIC材料を含む。2つの異なる材料は、スクリーニングプロセスによって選択されてもよい。

スクリーニングプロセスにおいて、HIC材料は、タンパク質のローディング、洗浄、および直線勾配溶出を含むHICステップにおける、タンパク質の非PEG化バージョン、モノPEG化バージョン、およびオリゴPEG化バージョンと結合するその能力についてスクリーニングされる。HIC材料は、タンパク質の非PEG化型、モノPEG化型、およびオリゴPEG化型を分離する能力についてスクリーニングされる。タンパク質の非PEG化型、モノPEG化型、およびオリゴPEG化型を分離することができるHIC材料は、候補として進められ、残りのHIC材料は、さらなる考察から除外される。

候補HIC材料のHICクロマトグラムを比較して、モノPEG化タンパク質のピークの間で良好な分解度を呈するHIC材料のペアが選択される。図1は、3つの候補HIC材料についてのHICクロマトグラムを示す。各HIC材料は、非PEG化EPO、モノPEG化EPO、およびオリゴPEG化EPOを分離することができる。HICにおいて、該材料は高塩濃度溶液で平衡化され、タンパク質は、（段階溶出または勾配溶出において）塩濃度を減少させることによって溶出され、最も疎水性の種が最後に溶出する。各トレースの第1のピークは、非PEG化EPOであり、これは、HIC材料に結合せず、フロースルー溶液中に出る。各トレースの第2のピークは、モノPEG化EPOであり、第3のピークは、オリゴPEG化EPOである。

図1の比較クロマトグラムにおいて見られ得るように、モノPEG化EPOについてのピーク（各トレースの第2のピーク）は、Phenyl Sepharose HPおよびToyopearl Phenyl 650Mについて、最高の分離を示す。これは、同じHIC条件（同じ塩濃度）下で、2つの材料がモノPEG化EPOと結合する異なる能力を示すため、このHIC材料のペアが、本明細書に開示される方法における使用に適していることを意味する。より親水性のHIC材料（この場合はPhenyl Sepharose HP）が、第1のHIC材料として用いられ、より疎水性の材料（この場合はToyopearl Phenyl 650M）が、第2のHIC材料として用いられる。

図1から見られ得るように、約60 mS/cmで、Phenyl Sepharose HPもToyopearl Phenyl 650Mも、非PEG化EPOと結合しない。これは、タンパク質混合物を、最初のおよび次いで2番目の、両方のHIC材料にアプライすることができ、非PEG化EPOが、第2のHIC材料からフロースルー溶液中に回収されるであろうことを意味する。

図1はまた、54.5 mS/cmで、Phenyl Sepharose HP（第1のHIC材料）はモノPEG化EPOと結合しないが、Toyopearl Phenyl 650M（第2のHIC材料）はモノPEG化EPOと結合することも示す。これは、タンパク質混合物を、同じ条件下で、第1のHIC材料に、次いで第2のHIC材料にアプライすることができ、モノPEG化EPOは、第2のHIC材料に結合するだけであることを意味する。図1はまた、54.5 mS/cmで、Phenyl Sepharose HP（第1のHIC材料）は依然としてオリゴPEG化EPOと結合し、したがって、第1のHIC材料は、オリゴPEG化EPOが第2のHIC材料に到達する前に、オリゴPEG化EPOのすべてまたは大部分を捕捉することも示す。

図1はまた、約41 mS/cmで、Toyopearl Phenyl 650M（第2のHIC材料）はもはやモノPEG化EPOと結合せず、したがって、モノPEG化EPOを、この伝導率あたりで第2のHIC材料から溶出できることも示す。

図1に示される結果は、本明細書に開示される方法が、第1のHIC材料としてPhenyl Sepharose HPを、第2のHIC材料としてToyopearl Phenyl 650Mを用いて実施され得ることを実証する。二段階HICのステップ中および第2のHIC材料の溶出のステップ中の様々な緩衝液に適している伝導率の値（塩濃度）は、図1に示される比較クロマトグラム研究のタイプから決定することができる。

非PEG化EPO、モノPEG化EPO、およびオリゴPEG化EPOを含むEPO混合物、または非PEG化EPO、モノPEG化EPO、およびオリゴPEG化EPOを含む他のタンパク質混合物のいずれかに対して本発明の方法を実施するのに適している、さらなるHIC材料のペアを見出すために、本明細書に記載されるスクリーニングプロセスを、他のタイプのHIC材料について繰り返すことができる。

HIC技術に精通した当業者は、モノPEG化タンパク質組成物を提供するためのさらなるHIC材料のペアおよび適している二段階HIC条件を特定するために、本明細書に記載されるスクリーニングプロセスを実施することができる。これは、タンパク質の疎水性挙動を予測することが難しいために、HIC材料および試料成分の選択が通常、経験的に行われることが、HIC分野において十分に確立されているからである。したがって、個々の場合に応じて用いられるべき最も適しているHIC材料ならびに塩のタイプおよび濃度を決定することが、HICにおける一般的な慣行である。

HIC材料の性能（選択性、分解度、および結合能力）は、多くのパラメータ：タンパク質特性、リガンドタイプ、リガンド置換の程度、タンパク質アプライ中に用いられる塩の濃度およびタイプ、ならびに界面活性剤の存在によって影響を受けることが公知である。より低い程度だが、ベースマトリックス（例えば、Sepharose）の温度、pH、およびタイプが、いくらかの効果を有し得る。特定のタンパク質についてのHIC材料の性能を決定するために最も重要なパラメータは、リガンドタイプおよびリガンド置換の程度（固定相であるHIC材料の疎水性）、ならびに塩のタイプおよび濃度（移動相であるロードおよび緩衝液の伝導率）である。

HIC材料において用いられる最も一般的なリガンドは、フェニル、ブチル-S、ブチル、オクチル、エーテル、およびイソプロピルである。

より高度のリガンド置換（より高いリガンド密度）は、より疎水性のHIC材料を提供する。例えば、「hi sub」を含む名称を有するHIC材料は、対応する「low sub」HIC材料よりも疎水性であろう。

タンパク質とHIC材料との間の疎水性相互作用を促進する、特定の塩の能力は、存在するイオン種およびその濃度に依存する。本明細書に開示される方法における使用のために特定のHIC材料の適性をスクリーニングする場合に、いくつかのタイプの塩が試験されてもよい。塩の濃度が増加するにつれて、HIC材料に結合したタンパク質の量は、タンパク質の沈殿点まで増加する。HICにおいて一般的に用いられる塩には、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、NaCl、KCl、およびCH₃COONH₄が含まれる。塩は、以下のアニオンのいずれかを、以下のカチオンのいずれかとの組み合わせで含んでもよい。アニオンは、沈殿効果を減少させる順に、PO₄ ^3-、SO₄ ^2-、CH₃COO^-、Cl^-、Br^-、NO₃ ^-、ClO₄ ^-、I^-、SCN^-である。カチオンは、カオトロピック効果を増大させる順に、NH₄ ⁺、Rb⁺、K⁺、Na⁺、Cs⁺、Li²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺である。

当業者は、特定のタンパク質プロファイルを提供するかまたはスクリーニングするために、HIC材料上のリガンドのタイプおよび置換の程度、ならびに塩のタイプおよび濃度を変動させることができる。例えば、関心対象のタンパク質種が、高い塩濃度条件下では結合しない場合には、より疎水性の媒体を用いることができる。フロースルー溶液中にとどまることが望まれるタンパク質種（例えば非PEG化タンパク質）が、プロセスの開始時に高塩濃度条件下でHIC材料に結合する場合には、平衡化緩衝液中の塩濃度を減少させることができ、かつ/または、より疎水性が低いHIC媒体を用いることができる。

第1のHIC材料および第2のHIC材料は両方とも、特定の条件下で、非PEG化タンパク質、モノPEG化タンパク質、およびオリゴPEG化タンパク質を分解することができる。この特徴は、特定の条件下で、HICプロセスのUVクロマトグラムを用いて特定することができる。条件は、高塩濃度条件下でタンパク質混合物をHIC材料にアプライすること、および、タンパク質を溶出させるために下降する塩濃度の勾配をアプライすることを含み得る。適しているHIC材料は、高塩濃度条件（開始条件）下で、非PEG化タンパク質と結合せず、よって、フロースルー溶液において回収することができる。適しているHIC材料はまた、溶出勾配中に、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質を分解することもできる。特に、適しているHIC材料は、モノPEG化種およびオリゴPEG化種の各々について相対的に狭い、相対的に高い、および/または相対的に対称性の溶出ピークを示すものである。

本明細書に開示される方法は、2つの異なるHIC材料：第1のHIC材料および第2のHIC材料を用いる二段階HICステップを含む。第1のHIC材料および第2のHIC材料は、HIC材料のペアと呼ばれ得る。

本明細書に開示される方法における使用に適しているHIC材料のペアは、比較HICクロマトグラムを提供するために、特定のHIC条件下での特定のタンパク質混合物についてのHICクロマトグラムを重ね合わせることによって特定され得る。適しているHIC材料のペアはモノPEG化溶出ピークの良好な分解度を有し得る。すなわち、比較HICクロマトグラムにおいて重ね合わせた場合のモノPEG化タンパク質についての溶出ピークは、可能な限り少ししかオーバーラップしないべきである。適しているHIC材料のペアは、モノPEG化タンパク質についての溶出ピークのオーバーラップを実質的に全く有さないペアであってもよい。すなわち、2つのHIC材料のモノPEG化タンパク質についての溶出ピークには、実質的に全くオーバーラップがない。適しているHIC材料のペアは、モノPEG化タンパク質についての溶出ピークのオーバーラップをほとんど有さないペアであってもよい。そのようなHIC材料のペアは、モノPEG化生成物について十分に分解されたピークを有すると呼ばれ得る。

2つの溶出ピークの間の分解度（R_s）は、2つのピークの平均ベース幅と比較した最高ピークの間の距離として定義され得る（Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography, Principles and Methods, GE Handbook, 2006
を参照されたい）。溶出容量およびピーク幅は、2つのピークの間の相対的分離の測定値を提供する、無次元分解値R_sを与えるように、同じ単位で測定される。

いかに良好に2つのピークが分離されるかの測定値である分解度Rsは、

として表すことができ、式中、t_r1およびW_b1は、それぞれ、第1の溶出ピークについての保持時間およびベースライン幅であり、t_r2およびW_b2は、それぞれ、第2の溶出ピークについての保持時間およびベースライン幅である。

本明細書に開示される方法において、HIC材料は、それぞれの溶出ピークが、少なくとも0.5、少なくとも0.8、少なくとも1.0、少なくとも1.2、または少なくとも1.5の分解度（R_s）を有するHICクロマトグラムを提供するように、特定の条件下で、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質を分解し得る。

本明細書に開示される方法における使用のためのHIC材料は、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質について、十分に分解された溶出ピークを示し得る。

本明細書に開示される方法における第2のHIC材料としての使用のためのHIC材料は、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、もしくは少なくとも99.9％、または約100％のモノPEG化タンパク質の組成を有する、モノPEG化タンパク質溶出ピークを示し得る。例えば、下記の実験において、Toyopearl Phenyl 650Mは、モノPEG化EPOを約100％で含むモノPEG化EPOのHIC画分を提供することが見出された（表3および6）。

本明細書に開示される方法において、HIC材料のペアは、各それぞれのHIC材料についてのモノPEG化タンパク質のピークが、少なくとも0.8、少なくとも1.0、少なくとも1.2、または少なくとも1.5の分解度（R_s）を有する比較HICクロマトグラムを提供し得る。そのようなHIC材料のペアは、モノPEG化生成物について十分に分解されたピークを有すると呼ばれ得る。比較HICクロマトグラムとは、同じHIC条件下での、2つ以上の異なるHIC材料についてのクロマトグラムトレースの重ね合わせである。比較HICクロマトグラムにより、同じ条件下での異なるHIC材料についての溶出ピークを比較することが可能になる。

HIC材料のペアは、モノPEG化タンパク質および/またはオリゴPEG化タンパク質についてのそれぞれの溶出ピークが、実施例1（図4）におけるクロマトグラフィー設計を用いた場合に少なくとも3 mLの保持容量によって分離される最大値を有するか、もしくは保持容量で最大値を有し、または、第2のHIC材料の溶出ピークが、保持容量に換算して第1のHIC材料の対応する溶出ピークよりも10％超、15％超、または20％超大きい、比較HICクロマトグラムを提供し得る。

適しているHIC材料のペアについての比較HICクロマトグラムにおいて、モノPEG化タンパク質の溶出ピークがより早い（保持容量がより低い）HIC材料が、第1のHIC材料として用いられ得る。第1のHIC材料は、第2のHIC材料よりも親水性が高い（または疎水性が低い）と説明され得る。

モノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法
本発明は、モノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法を提供する。本発明は、非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含む混合物からモノPEG化タンパク質を精製するための方法を提供する。

本発明は、以下の工程を含む、少なくとも約90％のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法を提供する：（a）非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物を提供する工程；（b）タンパク質混合物を二段階疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）ステップに供する工程であって、第1のHICフロースルー溶液を提供するために、タンパク質混合物を第1のHIC材料にアプライすること；および、第2のHICフロースルー溶液を提供するために、第1のHICフロースルー溶液を第2のHIC材料にアプライすることを含み、第2のHIC材料が、第1のHIC材料とは異なっており；かつ、二段階HICステップが、オリゴPEG化タンパク質を第1のHIC材料に結合させかつモノPEG化タンパク質を第2のHIC材料に結合させるのに適している二段階HIC条件下で実施される、工程；ならびに、（c）モノPEG化タンパク質組成物を提供する第2のHIC溶出液を提供するために、モノPEG化タンパク質を第2のHIC材料から溶出させる工程。

前記タンパク質は、EPOであってもよい。タンパク質は、ホルモンであってもよい。タンパク質は、ホルモン、サイトカイン、酵素、または抗体であってもよい。

二段階HIC条件は、代替的に、単一セットの条件、または固定条件と呼ばれ得る。第1のHIC材料へのタンパク質混合物のアプライと、第2のHIC材料への第1のHICフロースルー溶液のアプライとの間に、HIC条件の調整はない。二段階HIC条件は、二段階HICステップにおいて用いられる塩、pH緩衝液、およびpH条件である。二段階HIC条件とは、二段階HICステップにおいて用いられるタンパク質混合物（またはロード組成物）、平衡化緩衝液、および洗浄緩衝液の組成を指し得る。

本開示の文脈における「条件」という用語は、移動相の組成を指す。特に、これは、移動相における塩のタイプおよび濃度を指す。これはまた、pH緩衝剤または界面活性剤などの移動相における他の置換基のタイプおよび濃度も指し得る。

前記タンパク質混合物は、二段階HICステップにおいて両方のHIC材料にわたってアプライされる。第1のHICフロースルー溶液は、介在するコンディショニングステップまたは調整ステップを伴わずに、第2のHIC材料に直接アプライされ得る。第1のHIC材料および第2のHIC材料は、直接接続されていてもよい。第1のHIC材料および第2のHIC材料は、直列に直接接続されていてもよい。例えば、第1のHIC材料が、第1のHICカラムに含まれ、第2のHIC材料が、第2のHICカラムに含まれ、第1のHICカラムは、第2のHICカラムに直接接続されている。第1のHICカラム由来の第1のHICフロースルー溶液は、第2のHICカラムに直接送達されてもよい。第1のHICカラムと第2のHICカラムとの間に、インライン接続があってもよい。第1のHICカラムと第2のHICカラムとの間に、連続的な流れを可能にする機構があってもよい。方法の工程は、連続的に実施されてもよい。方法の工程は、並行して実施されてもよく、すなわち、工程（a）および（b）が並行して進むように、工程（b）は、工程（a）が完了する前に開始されてもよい。方法を連続的に（または並行して）実施することは、相対的に速く、かつ効率的であるため、有利である。

本発明の方法の工程は、順次実施されてもよい。方法は、以下の順次の工程を含んでもよい：（a）非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物を提供する工程；（b）タンパク質混合物を二段階疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）ステップに供する工程であって、第1のHICフロースルー溶液を提供するために、タンパク質混合物を第1のHIC材料にアプライすること；および、第2のHICフロースルー溶液を提供するために、第1のHICフロースルー溶液を第2のHIC材料にアプライすることを含み、第2のHIC材料が、第1のHIC材料とは異なっており；かつ、二段階HICステップが、オリゴPEG化タンパク質を第1のHIC材料に結合させかつモノPEG化タンパク質を第2のHIC材料に結合させるのに適している二段階HIC条件下で実施される、工程；ならびに、（c）モノPEG化タンパク質組成物を提供する第2のHIC溶出液を提供するために、モノPEG化タンパク質を第2のHIC材料から溶出させる工程。

「順次」という用語は、いかなる介在するクロマトグラフィーステップおよび/またはいかなる介在するコンディショニングステップもしくは調整ステップも、工程a～cのいずれかの間に起こらない（工程（a）と（b）、または（b）と（c）の間にいかなる介在する工程もない）ことを意味する。「順次」という用語は、いかなる介在する工程も、請求項のいずれか一項において列挙される工程のいずれかの間に起こらないことを意味する。本発明の方法の工程は、直接実施されてもよく、これは、工程（b）および（c）の各々が、前の工程後に直接実施されることを意味する。方法は、工程（a）～（c）からなってもよい。方法は、請求項のいずれか一項において列挙される工程からなってもよい。方法は、連続的にかつ順次実施されてもよい。

第1のHIC材料および第2のHIC材料は、互いに異なっている。それらは、リガンドのタイプ、および/またはリガンドの置換の程度（リガンドの密度）に関して異なっていてもよい。第1のHIC材料は、第2のHIC材料よりも親水性であってもよい。第1のHIC材料は、Phenyl Sepharose HPであってもよい。第2のHIC材料は、Toyopearl Phenyl 650Mであってもよい。

二段階HIC条件下で、第1のHIC材料は、非PEG化タンパク質と結合せず、かつ有意にも結合しない。二段階HIC条件下で、第2のHIC材料は、非PEG化タンパク質と結合せず、かつ有意にも結合しない。第1のHICフロースルー溶液および/または第2のHICフロースルー溶液における非PEG化タンパク質の画分は、タンパク質混合物におけるものと実質的に同じである。

二段階HIC条件下で、第1のHIC材料は、モノPEG化タンパク質と結合せず、かつ有意にも結合しない。第1のHICフロースルー溶液におけるモノPEG化タンパク質の画分は、タンパク質混合物におけるものと実質的に同じである。

本文脈において、「有意には結合しない」という用語は、HIC材料が、約5％未満、約2％未満、約1％未満、約0.5％未満、約0.1％未満、または約0.01％未満の言及されるタンパク質種と結合することを意味し得る。本文脈において、「実質的に同じ」であるタンパク質種の画分という用語は、参照値の約±0.1％以内、約±0.5％以内、約±1％以内、約±2.5％以内、約±5％以内、または約±10％以内である。例えば、タンパク質混合物におけるものと実質的に同じである、モノPEG化タンパク質の画分を含有する第1のHICフロースルー溶液は、タンパク質混合物におけるモノPEG化タンパク質の割合の約±1％以内である、モノPEG化タンパク質の割合を含有し得る。

本明細書に開示される方法において、第1のHIC材料は、第2のHIC材料よりも親水性であり、代替的に表現すると、第2のHIC材料は、第2のHIC材料よりも疎水性である。第1のHIC材料は、比較クロマトグラムにおいて、モノPEG化タンパク質を最初に溶出するため、第2のHIC材料よりも疎水性であると判定され得る。勾配溶出中のモノPEG化タンパク質についての保持時間は、第2のHIC材料についてよりも第1のHIC材料について、より短い。

本明細書における動的結合能力についての言及は、クロマトグラフィープロセスまたはステップのために選択された条件下での、動的結合能力を指す。特定のタンパク質についての特定のクロマトグラフィー条件下でのクロマトグラフィー媒体の動的結合能力は、不必要なタンパク質の損失を伴わずにクロマトグラフィー媒体上にロードすることができる、そのタンパク質の最大量として考えることができる。それは、「ブレークスルー」を引き起こさずにロードすることができる、関心対象のタンパク質の最大量である。タンパク質ブレークスルーは、例えば、280 nmでの分光光度法（A₂₈₀）によってモニターされてもよい。ブレークスルー閾値は、10％であってもよい。クロマトグラフィー条件は、pH、伝導率、および流速、ならびに、任意の塩または移動相への他の添加物の濃度であってもよい。第1または第2のHIC材料の動的結合能力は、本発明の二段階HICプロセスのための作動条件下で決定されてもよい。例えば、二段階HIC条件は、その下で、第1のHIC材料がオリゴPEG化タンパク質に対して相対的に高い動的結合能力を有する条件であってもよい。二段階HIC条件は、その下で、第2のHIC材料がモノPEG化タンパク質に対して相対的に高い結合能力を有する条件であってもよい。二段階HIC条件およびHIC材料は、オリゴPEG化タンパク質が第1のHIC材料によって保持され（堅く結合され）、かつモノPEG化タンパク質が第2のHIC材料によって保持される（堅く結合される）ために、第1のHIC材料および第2のHIC材料の動的結合能力を調整するかまたは最適化するように選択されてもよい。

二段階HIC条件は、第1のHIC材料にアプライされたオリゴPEG化タンパク質の量が、オリゴPEG化タンパク質に対する第1のHIC材料の動的結合能力よりも低いか、またはその約80～95％であるか、またはそれよりも約2、約5、約10、約20、もしくは約30倍低いような条件であってもよい。二段階HIC条件は、実質的に、オリゴPEG化タンパク質が、第1のHIC材料を全く「ブレークスルー」しないような条件であってもよい。二段階HIC条件は、オリゴPEG化タンパク質の大部分または実質的にすべてが、第1のHIC材料によって保持されるような条件であってもよい。第1のHIC材料は、二段階HIC条件下で、材料上にロードされるオリゴPEG化タンパク質の量よりも高いか、またはそれよりも約2、約5、約10、約20、もしくは約30倍高い、オリゴPEG化タンパク質に対する動的結合能力を有し得る。オリゴPEG化タンパク質に対して相対的に低い動的結合能力を有する第1のHIC材料を用いることは、例えば、相対的に多い量のタンパク質（相対的に多い量のタンパク質混合物）を第1のHIC材料上にロードすることができるため、有利である。これは、例えば、より小さいカラムの使用を可能にし、経済的に有利である。

二段階HIC条件は、第2のHIC材料にアプライされたモノPEG化タンパク質の量が、モノPEG化タンパク質に対する第2のHIC材料の動的結合能力よりも低いか、またはその約80～95％であるか、またはそれよりも約2、約5、約10、約20、もしくは約30倍低いような条件であってもよい。第2のHIC材料は、二段階HIC条件下で、材料上にロードされるモノPEG化タンパク質の量よりも高いか、またはそれよりも約2、約5、約10、約20、もしくは約30倍高い、モノPEG化タンパク質に対する動的結合能力を有し得る。モノPEG化タンパク質に対して相対的に低い動的結合能力を有する第2のHIC材料を用いることは、例えば、相対的に多い量のタンパク質（相対的に多い量の第1のHICフロースルー溶液）を第2のHIC材料上にロードすることができるため、有利である。これは、例えば、より小さいカラムの使用を可能にし、経済的に有利である。

比較HIC溶出クロマトグラムにおいて、第1のHIC材料および第2のHIC材料は、モノPEG化タンパク質に対する十分に分解された溶出ピークを有し得る。十分に分解されたピークとは、ほとんどまたは全くオーバーラップを有さないピークである。比較HIC溶出クロマトグラムにおいて、第1のHIC材料および第2のHIC材料は、モノPEG化タンパク質についての溶出ピークを有してもよく、それについてのR_sは、少なくとも0.8、少なくとも1.0、少なくとも1.2、もしくは少なくとも1.5、または少なくとも約0.8、少なくとも約1.0、少なくとも約1.2、もしくは少なくとも約1.5である。

第1のHIC材料は、Phenyl Sepharose HP（例えば、HiTrap Phenyl HP；GE Healthcare）であってもよい。第1のHIC材料は、Phenyl Sepharose HPと実質的に同じ選択性を有するHIC材料であってもよい。第1のHIC材料は、室温で25 mM HEPES、pH 7.5中、500 mMから0 mM Na₂SO₄まで下降する勾配において、モノPEG化EPOに対してPhenyl Sepharose HPと実質的に同じ選択性を有するHIC材料であってもよい。タンパク質は、エリスロポエチンであってもよい。

第2のHIC材料は、Toyopearl Phenyl 650M（Tosoh Bioscience LLC）であってもよい。第2のHIC材料は、Toyopearl Phenyl 650Mと実質的に同じ選択性を有するHIC材料であってもよい。第2のHIC材料は、室温で25 mM HEPES、pH 7.5中、500 mMから0 mM Na₂SO₄まで下降する勾配において、モノPEG化EPOに対してToyopearl Phenyl 650Mと実質的に同じ選択性を有するHIC材料であってもよい。タンパク質は、エリスロポエチンであってもよい。

モノPEG化EPOに対する実質的に同じ選択性とは、保持時間または保持容量±10％を意味し得る、実質的に同じ溶出ピーク最大値を有することを指し得るか、または、それについてのR_sが、少なくとも0.8、少なくとも1.0、少なくとも1.2、もしくは少なくとも1.5、または少なくとも約0.8、少なくとも約1.0、少なくとも約1.2、もしくは少なくとも約1.5である、比較クロマトグラムにおける分解度を有することを指し得る。

本明細書に開示される方法において用いられるHIC材料は、フェニルリガンドを含んでもよい。これは、フェニルリガンドで官能基化されたメタクリック樹脂を含んでもよい。HIC材料は、Sepharoseまたはヒドロキシル化メタクリックポリマーの基本マトリックスを含んでもよい。HiTrap Phenyl HP（高性能）は、25μmol/mL媒体のリガンド密度でフェニルリガンドを有するSepharoseの基本マトリックスを含む。第1のHIC材料は、約20～30μmol/mL媒体、または約25μmol/mL媒体でフェニルリガンドを有する基本マトリックス（例えば、Sepharoseマトリックス）を含んでもよい。第2のHIC材料は、約40～50μmol/mL媒体、または約40もしくは50μmol/mL媒体でフェニルリガンドを有する基本マトリックス（例えば、Sepharoseマトリックス）を含んでもよい。Toyopearl Phenyl 650Mは、フェニルリガンドを有するヒドロキシル化メタクリックポリマーの基本マトリックスを含む。第2のHIC材料は、フェニルリガンドを有するヒドロキシル化メタクリックポリマーの基本マトリックスを含んでもよい。第1のHIC材料は、第2のHIC材料よりも親水性であってもよい。本明細書に開示される方法において用いられるHIC材料は、製造業者の説明書に従って用いられ得る。

本明細書に開示される方法において、モノPEG化タンパク質は、第2のHIC溶出液を提供するために、第2のHIC材料から溶出される（工程c）。第2のHIC溶出液は、モノPEG化タンパク質組成物を提供する。第2のHIC溶出液は、タンパク質混合物に比べて増大した、モノPEG化タンパク質の画分を含む。第2のHIC溶出液は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または少なくとも99.9％のモノPEG化タンパク質を含み得る。モノPEG化タンパク質は、塩濃度の下降であり得る、直線勾配によって第2のHIC材料から溶出され得る。モノPEG化タンパク質は、塩濃度の減少であり得る、段階勾配によって第2のHIC材料から溶出され得る。

本明細書に開示される方法は、第1のHIC溶出液を提供するために、オリゴPEG化タンパク質を第1のHIC材料から溶出させる工程を含んでもよい。「第1のHIC溶出液」は、二段階HICステップにおける第1のHIC材料からの溶出液であるため、「第1のHIC材料」ともまた呼ばれ得る。第1のHIC溶出液は、オリゴPEG化タンパク質組成物を提供する。第1のHIC溶出液は、タンパク質混合物に比べて増大した、オリゴPEG化タンパク質の画分を含む。第1のHIC溶出液は、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、または少なくとも99.9％のオリゴPEG化タンパク質を含み得る。オリゴPEG化タンパク質は、塩濃度の下降であり得る、直線勾配によって直線HIC材料から溶出され得る。オリゴPEG化タンパク質は、塩濃度の減少であり得る、段階勾配によって第1のHIC材料から溶出され得る。

前記タンパク質混合物は、非PEG化タンパク質、モノPEG化タンパク質、およびオリゴPEG化タンパク質を含む。これは、二段階HICステップにおいて用いられる平衡化緩衝液と実質的に同じ添加物の組成を有し得る。これは、高塩濃度緩衝液（緩衝液A）と実質的に同じ添加物の組成を有し得る。そのようなタンパク質混合物はまた、本明細書において、ロード組成物、ロード溶液、または試料とも呼ばれ得る。タンパク質混合物は、例えば遠心分離によりタンパク質を濃縮すること、および高塩濃度緩衝液に懸濁することによって、調製されてもよい。タンパク質混合物は、緩衝液交換によって調製されてもよい。タンパク質混合物またはロード組成物は、0.1～1.0 mg/mL、0.2～0.5 mg/mL、または約0.25 mg/mLのタンパク質濃度を有し得る。タンパク質濃度は、280 nmでのUV分光法によって測定することができる。

本明細書に開示されるHIC方法は、様々な塩濃度の緩衝液を含む。方法は、高塩濃度緩衝液（緩衝液A）および低塩濃度緩衝液（緩衝液B）を用いること、ならびに変動する割合の緩衝液Aおよび緩衝液Bを用いて様々な他の緩衝液を調製することを含んでもよい。

高塩濃度緩衝液（緩衝液A）は、塩を含み、これはNa₂SO₄であってもよい。塩は、(NH₄)₂SO₄、Na₂SO₄、NaCl、KCl、およびCH₃COONH₄であってもよい。高塩濃度緩衝液は、400～600 mM Na₂SO₄、450～550 mM Na₂SO₄、または約500 mM Na₂SO₄を含んでもよい。高塩濃度緩衝液は、400～600 mM Na₂SO₄について述べられるのと同じ濃度で、または等価のイオン強度もしくは伝導率を提供する濃度で、代替塩を含んでもよい。高塩濃度緩衝液は、HEPESなどのpH緩衝剤を含んでもよい。例えば、これは、HEPESであってもよい約10～50 mM pH緩衝剤、約20～30 mM pH緩衝剤、または約25 mM pH緩衝剤を含んでもよい。高塩濃度緩衝液は、約7.0～8.0、または約7.5のpHを有し得る。高塩濃度緩衝液は、約pH 7.5の約25 mM HEPES、および約500 mM Na₂SO₄を含んでもよい。高塩濃度緩衝液は、約40～80 mS/cm、50～70 mS/cm、55～65 mS/cm、または約60 mS/cmの伝導率を有し得る。

低塩濃度緩衝液（緩衝液B）は、全く塩を含まないか、または低濃度の塩を含む。低塩濃度緩衝液は、10 mM未満の塩を含んでもよい。低塩濃度緩衝液は、高塩濃度緩衝液と、実質的に同じ濃度で同じpHの緩衝剤、および実質的に同じpHを有し得る。低塩濃度緩衝液は、約0.5～5 mS/cm、0.5～2.5 mS/cm、または約1 mS/cmの伝導率を有し得る。低塩濃度緩衝液は、約5 mS/cm未満または約2.5 mS/com未満の伝導率を有し得る。

前記タンパク質混合物は、高塩濃度緩衝液と実質的に同じ塩、pH緩衝剤、およびpHを有し得る。例えば、タンパク質混合物（またはロード組成物、または試料）は、25 mM HEPES、pH 7.5、500 mM Na₂SO₄の溶液中に非PEG化タンパク質、モノPEG化タンパク質、およびオリゴPEG化タンパク質を含んでもよい。

HIC材料は、二段階HICステップのためにタンパク質混合物がそれらにアプライされる前に、平衡化されてもよい。平衡化緩衝液は、相対的に高い塩濃度を有する。平衡化緩衝液は、約10～20％の緩衝液Bおよび残りの分の緩衝液Aを含んでもよい。平衡化緩衝液は、13.5％の緩衝液Bおよび86.5％の緩衝液Aを含んでもよい。平衡化緩衝液は、HEPESなどのpH緩衝剤を含んでもよい。例えば、これは、HEPESであってもよい約10～50 mM pH緩衝剤、約20～30 mM pH緩衝剤、または約25 mM pH緩衝剤を含んでもよい。平衡化緩衝液は、約7.0～8.0、または約7.5のpHを有し得る。平衡化緩衝液は、Na₂SO₄であってもよい約400～450 mM、または約420～450 mM、または約432.5 mMの塩の塩濃度を有し得る。平衡化緩衝液は、約50～60 mS/cm、または約54～55 mS/cm、または約54.5 mS/cmの伝導率を有し得る。

前記タンパク質混合物が第1のHIC材料にアプライされた後、第1および第2のHIC材料は、二段階HICステップの一部として洗浄緩衝液で洗浄されてもよい。二段階HICステップのための洗浄緩衝液は、平衡化緩衝液と同じであってもよい。洗浄緩衝液は、HEPESであってもよい約10～50 mM pH緩衝剤、約20～30 mM pH緩衝剤、または約25 mM pH緩衝剤を含む。洗浄緩衝液は、約7.0～8.0、または約7.5のpHを有し得る。洗浄緩衝液は、Na₂SO₄であってもよい約400～450 mM、または約420～450 mM、または約432.5 mMの塩の塩濃度を有し得る。洗浄緩衝液は、約50～60 mS/cm、または約54～55 mS/cm、または約54.5 mS/cmの伝導率を有し得る。少なくとも3、少なくとも5、もしくは少なくとも10カラム容量（CV）の洗浄緩衝液が用いられてもよいか、または、2～25、5～20、10～20、もしくは約15 CVの洗浄緩衝液が用いられてもよい。

二段階HICステップにおいてHIC材料が洗浄された後、第2のHIC溶出液を提供するために、モノPEG化タンパク質が、第2のHIC材料から溶出される（工程c）。第2のHIC材料の溶出は、段階溶出を含んでもよい。段階溶出は、約30～50％の緩衝液Bおよび残りの分の緩衝液A、または約40％の緩衝液Bおよび残りの分の緩衝液Aである溶出緩衝液を用いてもよい。溶出緩衝液は、HEPESなどのpH緩衝剤を含んでもよい。例えば、これは、HEPESであってもよい約10～50 mM pH緩衝剤、約20～30 mM pH緩衝剤、または約25 mM pH緩衝剤を含んでもよい。溶出緩衝液は、約7.0～8.0、または約7.5のpHを有し得る。溶出緩衝液は、Na₂SO₄であってもよい約250～350 mM、275～325 mM、または約300 mMの塩の塩濃度を有し得る。溶出緩衝液は、約35～45 mS/cm、40～45 mS/cm、または約41.25 mS/cmの伝導率を有し得る。段階溶出は、約5～10、または約8 CVの溶出緩衝液の使用を含んでもよい。溶出緩衝液は、二段階HIC条件の伝導率よりも少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、または少なくとも15 mS/cm低い伝導率を有し得る。

第2のHIC材料の溶出は、約5～20もしくは10～15 CV、または10 CV内、または14もしくは15 CV内にわたる、約70～90％、75～85％、または約80％の緩衝液Bまでの勾配溶出をさらに含んでもよい。勾配溶出は、Na₂SO₄であってもよい約50～200 mM、50～150 mM、75～125 mM、または約100 mMの塩までであってもよい。

オリゴPEG化タンパク質は、第1のHIC材料から溶出されてもよい（工程d）。第1のHIC材料の溶出は、5～10または約8 CVの洗浄緩衝液での洗浄、次いで、10、15、または20 CV内の少なくとも90％のまたは100％の緩衝液Bまでの溶出勾配のアプライ、およびさらに5～10または8 CVのこの緩衝液での溶出を含んでもよい。

HIC材料は、純水で再生され得る。

本明細書に開示される方法は特に、相対的に高い割合のオリゴPEG化タンパク質を含むタンパク質混合物からモノPEG化タンパク質組成物を調製するのに適している。本明細書に開示される方法は、少なくとも50％、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、または少なくとも30％のオリゴPEG化タンパク質、または約5～20％もしくは約10～30％のオリゴPEG化タンパク質を含むタンパク質混合物で用いられてもよい。

本明細書に開示される方法は、相対的に高い純度のモノPEG化タンパク質組成物を提供し得る。下記のように、100％のモノPEG化EPOを含有するモノPEG化タンパク質組成物（第2のHIC溶出液）が、本明細書に記載される方法を用いて調製された（表4）。図5のピーク2は、第2のHIC溶出液であり、100％のモノPEG化EPOを含む。

本明細書に開示される方法は、出発試料（タンパク質混合物）中のモノPEG化タンパク質の相対的に高い割合が、モノPEG化タンパク質組成物において回収されるように、相対的に高い収率を提供し得る。本明細書に開示される方法は、モノPEG化タンパク質の少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、または少なくとも約85％がタンパク質混合物から回収される、モノPEG化タンパク質組成物を提供し得る。下記のように、モノPEG化EPOの約89.5％が、本明細書に開示される方法を用いて、PEG化反応試料（タンパク質混合物）から回収された（表7）。

本明細書に開示される方法は、出発試料（タンパク質混合物）中の非PEG化タンパク質の相対的に高い割合が、第2のHICフロースルー溶液において回収されるように、相対的に高い収率を提供し得、この非PEG化タンパク質を、再利用することができる。本明細書に開示される方法は、非PEG化タンパク質の少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、または少なくとも約99.9％がタンパク質混合物から回収される、第2のHICフロースルー溶液を提供し得る。下記のように、非PEG化EPOの約100％が、本明細書に開示される方法を用いて、PEG化反応試料（タンパク質混合物）から回収された（表7）。

本明細書に開示される方法は、相対的に高い純度のモノPEG化タンパク質組成物を提供し得る。

HIC条件のpHは、タンパク質の安定性および活性に適しているべきである。pHは、約5.0～8.5であってもよい。特に治療用タンパク質または生物学的活性タンパク質のためには、生理学的pHが望ましい。

pH緩衝剤の選択は、通常、HICにとって重大ではない。リン酸緩衝液、またはHEPES緩衝液、または他のグッドの緩衝液が、用いられてもよい。約6～10のpKaを有する緩衝液が、用いられてもよい。一級アミンを含有しない緩衝液が特に適している（一級アミンは、PEG試薬に対するパートナーとして作用し、いくつかのPEG化緩衝剤分子を結果としてもたらす可能性があるため）。

クロマトグラフィーステップのための流速は、従来の技術に従って選択され、かつ調整されてもよい。より速い流速は、結合能力を減少させることになり、これは、特に大きな体積の分離されるべきタンパク質混合物をアプライした時に、最大動的結合能力の達成と速い分離との間でバランスがとられ得ることを意味する。適している流速は、50～400 cm/hであり得る。滞留時間は、用いられるクロマトグラフィー材料に依存して、3～5分、または恐らくそれ未満であり得る。全プロセスの生産性を改善するためには、より速い流速およびより短い滞留時間が、望ましい可能性がある。

クロマトグラフィーステップは、特定のタンパク質（またはタンパク質のPEG化型）と「結合するのに適している」条件下で実施され得る。当業者は、クロマトグラフィー技術に精通しており、その共通一般知識を用いてかつ本開示に手引きされて、特定のタンパク質と結合するのに適している条件を経験的に見出すことができる。クロマトグラフィーにおいて特定のタンパク質（またはタンパク質のPEG化型）と結合するのに適している条件を提供するために、クロマトグラフィー材料、塩のタイプおよび/または濃度、pH、緩衝剤、温度、ならびに流速などのパラメータはすべて、変更することができる。

本文脈において、クロマトグラフィーステップは、混合物または溶液（例えば、タンパク質混合物または第1のHICフロースルー溶液）から「混入物」を除去することができ、ここで、混入物はタンパク質の所望ではない形態である。混入物はまた、不純物とも呼ばれ得る。例えば、本文脈におけるタンパク質の所望の形態は、モノPEG化タンパク質であるため、クロマトグラフィーステップは、非PEG化タンパク質またはオリゴPEG化タンパク質を除去し得る。クロマトグラフィーステップはまた、他の混入物、例えばタンパク質凝集物、またはPEG化反応物も除去し得る。

PEG
ポリ(エチレングリコール)すなわちPEGは、中性親水性ポリエーテルである。ポリマー化合物としてのPEGは、規定された分子量では得られないが、実際のところ分子量分布を有するため、本文脈における（kDaでの）「分子量」という用語は、PEGの平均分子量として理解されるべきであり；「約」という用語は、いくらかのPEG分子または残基は、示される分子量よりも重く、いくらかはそれよりも軽いことを示し、すなわち、本文脈における「約」という用語は、その中のPEG分子の95％が示される分子量の+/-10％以内の分子量を有する、分子量分布を指し得る。例えば、30 kDaの分子量は、27 kDa～33 kDaの範囲を表し得る。

PEG残基は、PEG化分子の化学合成から結果として生じた、または分子の一部の最適な距離のためのスペーサーである、結合反応に必要であるさらなる化学基を含有することができる。これらのさらなる化学基は、PEG残基の分子量の算出のためには用いられない。加えて、そのようなPEG残基は、互いに共有結合されている1つまたは複数のPEG鎖からなることができる。1つよりも多いPEG鎖を有するPEG残基は、マルチアームまたは分枝状PEG残基と呼ばれる。分枝状PEG残基は、例えば、グリセロール、ペンタエリスリオール（pentaerythriol）、およびソルビトールを含む様々なポリオールへのポリエチレンオキシドの付加によって調製することができる。分枝状PEG残基は、例えば、EP 0 473 084、US 5,932,462において報告されている。PEG化反応に用いられるPEG分子、およびPEG化タンパク質上のPEG残基は、各々、少なくとも約12 kDa、または少なくとも約20 kDa、約20 kDa～40 kDa、または約30 kDaの分子量を有し得る。PEG残基は、20 kDa～35 kDaの分子量を有し、かつ直鎖状PEG残基であってもよい。PEG残基は、35 kDa～40 kDaの分子量を有し、かつ分枝状PEG残基であってもよい。

モノPEG化EPOは、少なくとも約12 kDa、または少なくとも約20 kDa、約20 kDa～40 kDa、約20 kDa、または約30 kDaの分子量を有する単一のPEG残基を含んでもよい。PEG残基は、少なくとも約20 kDaの分子量を有し得る。

モノPEG化タンパク質は、単一のPEG残基を含むタンパク質である。すなわち、モノPEG化タンパク質は、1つのPEG残基のみを有する。オリゴPEG化タンパク質は、少なくとも2つのPEG残基を含む。例えば、オリゴPEG化タンパク質は、ジ、トリ、またはテトラ-PEG化タンパク質であってもよい。オリゴPEG化タンパク質（またはポリPEG化タンパク質）という用語は、変動する程度のPEG化（2つ、3つ、またはそれよりも多いPEG残基）を有するオリゴPEG化タンパク質分子の群を指し得る。PEG化タンパク質という用語は、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質を指す。PEG化タンパク質という用語は、モノPEG化タンパク質およびオリゴPEG化タンパク質からなるタンパク質を指し得る。非PEG化タンパク質は、いかなるPEG残基も含まないタンパク質である。非PEG化タンパク質はまた、PEG化反応の文脈において未反応タンパク質とも呼ばれ得る。非PEG化タンパク質は、ネイティブタンパク質、または未PEG化タンパク質、またはフリータンパク質と呼ばれ得る。

「PEG化」という用語は、PEG残基とタンパク質との共有結合を意味する。特に、これは、ポリペプチドのN末端、および/または内部リジン残基での共有結合を指し得る。タンパク質のPEG化は、最先端技術において広く知られており、例えば、Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417によって概説されている。PEGは、様々な官能基、および様々な分子量を有するポリエチレングリコール、直鎖状および分枝状PEG、ならびに様々な連結基を用いて連結することができる（Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18；Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier 30 Systems 9 (1992) 249-304もまた参照されたい）。エリスロポエチンのPEG化は、例えば、WO 00/44785に記載されているようなPEG化試薬を有する水溶液において、1つの態様においては、5 kDa～40 kDaの分子量のNHSで活性化された直鎖状または分枝状のPEG分子を用いることによって、実施することができる。PEG化はまた、Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229に従って、固相で実施することもできる。ランダムではない、N末端のPEG化ポリペプチドはまた、WO 94/01451に従って生成することもできる。PEG化反応はまた、WO 2009/010270およびWO 2012/035037においても概説されている。

適しているPEG誘導体は、約5～約40 kDa、または約20～約40 kDaの平均分子量を有する、活性化PEG分子である。PEG誘導体は、1つの態様において、直鎖状PEGまたは分枝状PEGである。PEG-タンパク質およびPEG-ペプチドコンジュゲートの調製における使用に適している多種多様のPEG誘導体を、Shearwater Polymers（Huntsville, AL, U.S.A.; www.nektar.com）から入手することができる。活性化PEG誘導体は、当技術分野において公知であり、例えば、Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368に記載されている。

PEG化反応は、約6.5～9.5、約7.0～9.0、または約7.5～8.5、または約8.0のpHで実施されてもよい。PEG化反応が実施されるpHは、用いられるPEG試薬に依存し得る。PEG試薬は、mPEG-NHS、mPEG-SPA、mPEG-SVA、またはmPEG-CIであってもよい。PEG化反応は、（NHS）活性化PEG試薬を用いて、約7.0～9.0、または約7.5～8.5、または約8.0のpHで実施されてもよい。PEG化反応は、約15～25℃、または約18～22℃、または約20℃で実施されてもよい。PEG化反応は、少なくとも約20、少なくとも約30、少なくとも約40、少なくとも約50、もしくは少なくとも約60分間、または約30～90もしくは約30～60分間、または約40、約50、もしくは約60分間、行われてもよい。

PEG化反応は、塩および緩衝剤を含む溶液において実施されてもよい。塩はNa₂SO₄であってもよく、緩衝剤はビシンであってもよい。塩は、5～10 mM、または約7.5 mMの量で存在してもよい。緩衝剤は、約10～50 mM、約20～30 mM、または約25 mMの量で存在してもよい。PEG化反応は、7.5 mM Na₂SO₄および25 mMビシンにおいて実施されてもよい。

PEG化反応のpHは、二段階HIC条件のpHと実質的に同じであってもよい。PEG化反応のpHは、PEG化反応から結果として生じたタンパク質混合物が第1のHIC材料上に直接ロードされるように、二段階HIC条件のpHと実質的に同じであるように選択されてもよい。本文脈において、実質的に同じとは、1.0、0.9、0.8、0.6、0.7、0.5、0.4、0.3、0.2、または0.1 pH単位以内を意味する。そのようなプロセスにおいて、タンパク質混合物は、PEG反応から結果として生じる反応生成物の混合物である。そのようなプロセスは、相対的に効率的であり、かつ速い。本文脈において、「直接ロードされる」とは、反応生成物の混合物が第1のHIC材料にアプライされる前に、いかなるそのpH調整も行われないことを意味する。PEG化反応のための緩衝液は、二段階HIC条件のための緩衝液と同じであってもよい。

EPO
「エリスロポエチン」およびその略語である「EPO」という用語は、SEQ ID NO: 1もしくはSEQ ID NO: 2のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはそれに対して実質的に相同なタンパク質もしくはポリペプチドを指し、その生物学的特性は、骨髄における赤血球産生の刺激ならびにコミットした赤血球前駆細胞の分裂および分化の刺激に関する。組換えエリスロポエチンは、組換えDNA技術によって、または内在性遺伝子活性化によって、真核細胞、例えば、CHO細胞、またはBHK細胞、またはHeLa細胞における発現を介して調製されてもよく、すなわち、エリスロポエチン糖タンパク質は、内在性遺伝子活性化によって発現される。例えば、US 5,733,761、US 5,641,670、US 5,733,746、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667、およびWO 91/09955を参照されたい。EPOは、ヒトEPOであってもよい。EPOは、グリコシル化EPOであってもよい。

ヒトEPOは、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2に述べられるアミノ酸配列を有し得る。ヒトEPOは、SEQ ID NO: 1に述べられるアミノ酸配列を有し得る。「EPO」という用語はまた、例えば、EP 1 064 951またはUS 6,583,272において報告されているような、1個または複数個のアミノ酸残基が、変化しているか、欠失しているか、または挿入されており、かつ改変されていないタンパク質に匹敵する生物活性を有する、SEQ ID NO: 1またはSEQ ID NO: 2のタンパク質のバリアントも表す。変化しているか、欠失しているか、または挿入されているアミノ酸の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1～50、1～40、1～30、1～20、または1～10個であってもよい。EPOという用語は、SEQ ID NO: 1もしくはSEQ ID NO: 2に述べられるアミノ酸配列またはそのバリアントを含むかまたはそれからなる、タンパク質を表す。バリアントは、グリコシル化のための1～6個の追加的な部位を有する、ヒトエリスロポエチンのアミノ酸配列を有し得る。PEG化エリスロポエチンの特異的活性は、当技術分野において公知の様々なアッセイによって測定することができる。精製されたPEG化エリスロポエチンの生物活性は、ヒト患者への注射によるタンパク質の投与が、対象の非注射群または対照群と比較して、骨髄細胞が網状赤血球および赤血球の産生を増大させることを結果としてもたらすようなものである。本明細書に報告されるような方法に従って取得され、精製されたPEG化エリスロポエチンの生物活性は、Bristow, A, Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48による方法によって試験することができる。

EPOのアミノ酸配列バリアントは、EPOをコードするヌクレオチド配列中に適切な改変を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような改変には、例えば、エリスロポエチンのアミノ酸配列からの欠失、および/またはその中への挿入、および/またはその内の残基の置換が含まれる。最終構築物がヒトEPOに匹敵する生物活性を所有するという前提で、最終構築物に達するために、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行うことができる。

保存的アミノ酸置換を、「好ましい置換」という項目の下で表1に示す。より実質的な変化は、「例示的な置換」という項目の下で表1に、およびアミノ酸側鎖クラスに関連して下記のように提供される。アミノ酸置換は、ヒトエリスロポエチン中に導入されてもよく、生成物が、ヒトエリスロポエチンの生物活性の保持についてスクリーニングされてもよい。

非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスに交換することを必然的に伴う。

EPOは、バリアントEPOであってもよい。EPOは、別のタンパク質との融合タンパク質に含まれてもよいか、またはPEGに加えて別の部分にコンジュゲートされてもよい。

エリスロポエチンの化学的PEG化は、概して、リジン残基の1個もしくは複数個のε-アミノ基で、および/またはN末端アミノ基でPEG化されているエリスロポエチンを含むタンパク質調製物を、結果としてもたらす。N末端アミノ酸での選択的PEG化は、Felix (1997)に従って実施することができる。選択的N末端PEG化は、ペプチド鎖のN-1末端アミノ酸に対するN^α-PEG化アミノ酸誘導体のカップリングによって、固相合成中に達成することができる。側鎖PEG化は、伸長する鎖に対するN^ε-PEG化リジン誘導体のカップリングによって、固相合成中に実施することができる。組み合わされたN末端PEG化および側鎖PEG化が、上記のように固相合成内で、または活性化PEG試薬をアミノ脱保護ペプチドにアプライすることによる液相合成によって、のいずれかで実現可能である。

（表１）

アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って群分けされてもよい：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。

非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスに交換することを必然的に伴う。

タンパク質
本発明の方法は特に、モノPEG化EPO組成物を生成するのに適している。本明細書におけるタンパク質または関心対象のタンパク質への言及は、EPOを指し得る。

本発明の方法は、他のタンパク質、特に治療用タンパク質のモノPEG化タンパク質組成物を生成するのに適している可能性がある。例えば、インターロイキン-2（IL-2）、ペグインターフェロンα-2a、ヒト成長ホルモン（hGH）、骨形成タンパク質2（BMP-2）、骨形成タンパク質7（BMP-7）、骨形成タンパク質15（BMP-15）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、フォン・ウィルブランド因子（vWF）プロテアーゼ、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（IPA）、レプチン、ヒルジン、ウロキナーゼ、ヒトDNアーゼ、インスリン、B型肝炎表面タンパク質（HbsAg）、キメラジフテリア毒素-IL-2、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）、甲状腺ペルオキシダーゼ（TPO）、α-ガラクトシダーゼ、α-L-イズロニダーゼ、β-グルコシダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、酸性a-グルコシダーゼ（酸性マルターゼ）、アンチトロンビンIII（AT III）、卵胞刺激ホルモン（FSH）、グルカゴン様ペプチド-I（GLP-1）、グルカゴン様ペプチド-2（GLP-2）、線維芽細胞増殖因子7（FGF-7）、線維芽細胞増殖因子21（FGF-21）、線維芽細胞増殖因子23（FGF-23）、第X因子、第XIII因子、プロキネチシン（prokinetisin）、エクステンディン（extendin）-4、CD4、腫瘍壊死因子受容体（TNF-R）、a-CD₂₀、P-セレクチン糖タンパク質リガンド-I（PSGL-I）、補体、トランスフェリン、グリコシル化依存性細胞接着分子（GlyCAM）、神経細胞接着分子（N-CAM）、INF受容体-IgG Fe領域融合タンパク質。 そのようなタンパク質はまた、呼吸器合胞体ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスのタンパク質F、INF-a、糖タンパク質IIb/IIIa、CD20、VEGF-A、PSGL-1、CD4、a-CD3、EGF、がん胎児性抗原（CEA）、TNFα、およびIL-2受容体のいずれか1つに対するモノクローナル抗体などの、抗体も含む。

本発明の方法は、ホルモン、サイトカイン、または酵素などのタンパク質のモノPEG化組成物を生成するのに適している可能性がある。そのようなタンパク質は、エリスロポエチンであってもよい。タンパク質は、インターフェロン-α-2aまたはインターフェロン-α-2bであってもよい。タンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子、ヒト成長ホルモン、または尿酸オキシダーゼであってもよい。

PEG化は、インビボ循環半減期を増加させるため、本発明は、相対的に短い半減期を有する治療用タンパク質のために、特に有用である。概して、ホルモンおよびサイトカインは、相対的に短い半減期を有する。より小さい生体分子は、相対的に短い半減期を有する傾向がある。相対的に小さい生体分子の薬物動態プロファイルは、PEG化によって改善される可能性があり、そのため、本発明はまた、相対的に小さい治療用タンパク質のために、特に有用であり得る。概して、およそ70 kDaよりも小さいタンパク質およびペプチドは、より大きいタンパク質よりも、腎臓ろ過によって排出される可能性がより高い。より小さい生体分子またはタンパク質は、約70 kDa未満の分子量を有するものとして定義され得る。エリスロポエチンは、約37 kDaの分子量を有する。本発明は、（その非PEG化型において）約70 kDa未満の分子量を有する治療用タンパク質のために有用である。本発明は、約70 kDa未満、約60 kDa未満、約50 kDa未満、もしくは約40 kDa未満の分子量を有する、または約10～70 kDa、約20～60 kDa、約20～50 kDa、もしくは約30～40 kDaの分子量を有する治療用タンパク質のために有用である。本発明は、約70 kDa未満、約60 kDa未満、約50 kDa未満、もしくは約40 kDa未満の分子量を有する、または約10～70 kDa、約20～60 kDa、約20～50 kDa、もしくは約30～40 kDaの分子量を有するホルモンまたはサイトカインのために有用である。

前記タンパク質は、抗体であってもよい。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。抗体は、生物学的に機能性の抗体断片であってもよい。抗体断片には、Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv、(scFv)₂、単一ドメイン抗体（sdAb、またはdAB）、相補性決定領域断片、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ミニボディ（minibody）、ダイアボディ（diabody）、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。多くの抗体断片が、インビボで相対的に短い半減期を有し、これは、その相対的に小さいサイズおよびそれらがもはやFc領域を有さないことに起因する。本発明は、単一ドメイン抗体、Fab、Fab'、およびscFvなどの相対的に小さいサイズを有する抗体断片のために、特に有用である。本発明は、約70 kDa未満、約60 kDa未満、約50 kDa未満、もしくは約40 kDa未満の分子量を有する、または約10～70 kDa、約20～60 kDa、約20～50 kDa、もしくは約30～40 kDaの分子量を有する抗体断片のために有用である。

モノPEG化タンパク質組成物は、薬学的組成物として製剤化されてもよい。本明細書に開示される方法によって生成されるモノPEG化タンパク質組成物は、1つもしくは複数の薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化されてもよく、かつ/または、生理食塩水などの生理学的に許容される緩衝液において製剤化されてもよい。HICステップの平衡化緩衝液、洗浄緩衝液、または溶出緩衝液において用いられる塩および/または緩衝剤は、モノPEG化タンパク質組成物を薬学的組成物として製剤化する前に除去されてもよい。例えば、モノPEG化タンパク質組成物は、透析されてもよい。モノPEG化タンパク質組成物のモノPEG化タンパク質は、凍結乾燥されてもよい。モノPEG化タンパク質組成物のモノPEG化タンパク質は、単離され、薬学的組成物において再製剤化されてもよい。

本明細書に開示される方法は、工業規模の方法であってもよい。工業規模の方法は、バッチ当たりまたはサイクル当たり、少なくとも約5 g、少なくとも約10 g、少なくとも約25 g、少なくとも約50 g、少なくとも約100 g、少なくとも約250 g、または少なくとも約500 gを生成する方法であってもよい。本文脈におけるバッチまたサイクルは、本明細書に開示されるような工程（a）～（c）のすべてを含む方法であってもよい。工業規模の方法は、HICステップに供される（非PEG化タンパク質、モノPEG化タンパク質、およびオリゴPEG化タンパク質を含む）タンパク質混合物の体積が、少なくとも100 L、少なくとも500 L、少なくとも1000 L、少なくとも5000 L、少なくとも10000 L、少なくとも50000 L、または少なくとも100000 Lである方法であってもよい。

室温は、約18～25℃、20～22℃、約20℃、約21℃、または約22℃であってもよい。本明細書に開示される方法は、室温で実施されてもよい。HICは、室温で実施されてもよい。HICは、15～25℃の温度で実施されてもよい。再現性のために、方法は、特定のかつ安定した温度でHICを実施してもよい。安定した温度は、特定の温度±1.0℃または±1.0℃であってもよい。方法は、タンパク質がそのような条件下で安定であるという前提で、約4～40℃の任意の温度で実施されてもよい。

本発明は、説明される局面および好ましい特徴の組み合わせを、そのような組み合わせが明らかに許されないかまたは明白に回避される場合を除いて、含む。

前述の説明においてまたは添付の特許請求の範囲においてまたは添付の図面において開示され、それらの具体的な形態で、または開示される機能を実行するための手段に関してもしくは開示される結果を得るための方法もしくはプロセスに関して、示される、特徴は適宜、別々に、またはそのような特徴の任意の組み合わせにおいて、本発明をその多様な形態で実現するために利用されてもよい。

本発明が、上記の例示的な態様とともに説明されているが、本開示が与えられた場合、多くの等価の改変および変形が、当業者に明らかであろう。したがって、上記に示される本発明の例示的な態様は、例証となるものであり限定的ではないと考えられる。説明される態様に対する様々な変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なされてもよい。

いかなる疑いも回避するために、本明細書に提供される任意の理論的説明は、読者の理解を改善する目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれにも束縛されることを望まない。

本明細書において用いられる任意のセクションの見出しは、組織化が目的であるだけで、記載される内容を限定すると解釈されるべきではない。

添付の特許請求の範囲を含み本明細書を通して、文脈が別段必要としない限り、「含む（comprise）」および「含む（include）」という単語、ならびに「含む（comprises）」、「含むこと（comprising）」、および「含むこと（including）」などの変形は、述べられている整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の包含を含意するが、任意の他の整数もしくは工程、または整数もしくは工程の群の排除は含意しないように理解されるであろう。

本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形である「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかに別段の指図をしない限り、複数の指示物を含むことが注意されなければならない。範囲は、本明細書において、「約」1つの特定の値から、かつ/または「約」別の特定の値までとして示されてもよい。そのような範囲が示される場合、別の態様は、一方の特定の値から、かつ/または他方の特定の値までを含む。同様に、値が、「約」という先行詞の使用によって、概数として示される場合、特定の値が別の態様を形成することが理解されるであろう。数値に関連する「約」という用語は、任意であり、かつ例えば+/-10％を意味する。

上述のすべての参照文献は、参照により本明細書に組み入れられる。

実施例1
クロマトグラフィーのためのPEG化EPOの調製
材料：
‐ 10 mM リン酸Na/K、100 mM NaCl、pH 7.5中の、0.87 mg/mLの再利用されたPEG化エリスロポエチン（各々約30 kDaの分子量を有する、PEG化反応に用いられたPEG分子、およびPEG化タンパク質上のPEG残基）
‐ 高塩濃度緩衝液（25 mM HEPES、500 mM Na₂SO₄、pH 7.5、ろ過滅菌）
‐ 遠心濃縮器 10 kDa MWCO Vivaspin 20（Sartorius # VS2002）

クロマトグラフィー
高塩濃度クロマトグラフィーのために、PEG化エリスロポエチンを、緩衝液交換させ、かつ濃縮してもよい。この目的で、7 mLのPEG化エリスロポエチンを、10 kDa MWCO遠心濃縮器中にピペットで移し、4,700 gで40分間遠心分離する。その後、混合物を、10 mLの高塩濃度緩衝液での緩衝液交換に供し、4,700 gで40分間、再び遠心分離する。工程のうちの1つにおいて、濃縮物体積が0.5 mLよりも多い場合には、遠心分離をそれに応じて延長する。緩衝液交換後、約0.2 mLの残余分を、3 mLの高塩濃度緩衝液に溶解し、濃度を、280 nmで分光光度的に測定する。

各クロマトグラフィーの前に、こうして調製されたEPO濃縮物を、カラムのローディングのために、高塩濃度緩衝液で0.25 mg/mLの濃度に希釈する。通例、カラムに、0.5 mg試料に対応する2 mLをロードする。ローディング濃度は、280 nmでUV/Vis分光法によって測定する。

エリスロポエチンのPEG化後に、非PEG化エリスロポエチン（EPO）および単独にPEG化されたエリスロポエチン（モノPEG EPO）は、複合的にPEG化されたエリスロポエチン（オリゴPEG EPO）から分離されるべきである。

様々なクロマトグラフィー媒体の評価後に、2ステップクロマトグラフィーによって精製が試験されるべきである。この目的のために、同じ塩濃度で、より疎水性の分析物（オリゴPEG-EPO）が第1のカラムに結合する一方でより親水性の分析物（モノPEG-EPO）が第2のカラムに結合するような方式で、2つのカラムを、実験のために選択してAKTAにおいて直列に接続する。非常に親水性の分析物（未PEG化EPO）は、結合せず、試料アプライ中に溶出するはずである。加えて、カラムの分析物を互いとは別々に溶出させるために、カラムを互いから独立して制御することが必要である。

移動相Aは、25 mM HEPES、500 mM Na₂SO₄、pH 7.5（約60 mS/cm）からなる。移動相Bは、25 mM HEPES、pH 7.5（約1 mS/cm）からなる。体積流量を61.5 cm/hに調整し、クロマトグラフィーを室温で行う。図1において測定された伝導率を、クロマトグラフィープログラムに直接組み入れることはできない。むしろ、移動相の割合（％-B）を変動させることによって、伝導率を調整してもよい。結果として生じた移動相の画分を次いで、クロマトグラフィープログラム中に組み入れる。

カラムの平衡化は、最初に、13.5％の緩衝液Bで行う。カラムに次いで、2 mLの調製された試料を、試料ポンプを介してロードする。その後、カラムを、15 CVにわたる13.5％の緩衝液Bで洗浄し、溶出のための開始条件を調整する。EPOはラン中にあるため、さらなる分析のために、ランを、3番目のCVから13番目のCVまで分画する。

所望の生成物であるモノPEG-EPOは、より早く溶出されるはずであるため、第2のカラムの溶出を最初に開始して、より速いプロセス時間を容易にする。モノPEG-EPOの溶出は、8 CVにわたる40％のB（41.25 mS/cm）までの段階溶出で始まり、14 CV以内での80％のBまでの勾配がその後に続く。80％のBを、さらに8 CVにわたって保ち、溶出がこうして終了する。

第1のカラムのオリゴPEG-EPOを溶出させる第2の溶出は、8 CVにわたる13.5％のBで始まり、20 CV以内での100％のBまでの勾配がその後に続く。100％のBを、次いでさらに8 CVにわたって保ち、溶出がこうして終了する。

カラム洗浄および定置洗浄（CIP）のステップを、1 ml/分（186.5 cm/h）の増加した流量で、両方のカラムについて同時に実施する。このために、第2のカラムを再び接続し、両方のカラムを、超純水において8 CVにわたって洗浄する。ランを、1つの画分に完全に収集する。

実施例2
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
HICの収集された画分の組成を、HPLCを用いて分析する。

器具
‐ Dionex UltiMate 3000 HPLC System（Thermo Fisher Scientific Inc.）
‐ RP-C₁₈カラム、RP-Poroshell 300SB 2.1×75 mm；300Å（Agilent Technologies）

収集された凍結HIC画分を融解して、各場合に、100μLの試料をオートサンプラーバイアル中にピペットで移し、10℃に冷却されているオートサンプラーに置く。25μLの試料をアプライし、カラムオーブンにおいて60℃で0.5分間加熱して、カラムにアプライする。流速は、1 mL/分である。試験ランの後、クロマトグラフィーを、4分以内の、40％のBから52％のBまでの勾配で始める。その後、52％のBを3分間保つ。この時間中に、純粋なEPO（非PEG）が通常、勾配において溶出する。第2の勾配を次いで、3分以内の52％から58％までのBで作り、その後58％のBで4分間保つ。52％から58％までの勾配中またはその直後に、モノPEG-EPOが通常、溶出する。オリゴPEG-EPOの溶出は、58％のBから62％のBまでの1分勾配において起こる。62％のBを、さらに4分間保つ。次いで、100％のBでのカラムの再生を、1分間行う。

試料中の成分の割合を、UVクロマトグラムの積分によって測定する。この目的で、積分限界を、ソフトウェアの助けで対応するピークに設定する。次いで、面積を算出する。それぞれの成分の割合pを、以下のように算出する。

実施例3
HIC材料のスクリーニング
16種類のHIC材料を、非PEG化タンパク質、モノPEG化タンパク質、およびオリゴPEG化タンパク質に対する選択性（例えば、十分に分離された溶出ピーク）についてスクリーニングした。3つのHIC材料（Tosoh Bioscience LLC由来のToyopearl PPG-600MおよびToyopearl Phenyl-650M、ならびにGE Healthcare由来のPhenyl Sepharose HP（HiTrap Phenyl HP））が、残りのカラムと比較して最良の選択性を示し、中間の疎水性を有するカラムとして記載することができる。クロマトグラムは、プロファイルが互いに類似している。それらは、各々3つのピークからなる。第1のピークは、カラムのローディング中に現れ、第2のピークおよび第3のピークは、勾配中に幅広い二重ピークとして現れる。水での洗浄ステップ中に、第4のピークが現れる。図2におけるHiTrap Phenyl HPは、これらの3つのカラムの例である。しかし、これは、ピークの保持容量およびピークの形状が、他の2つのカラムとは異なっている。第3のピークが、最大値に達した後、最初に、他の2つのカラムにおいてと同様に強く、大まかに減少するが、終わりに向かって進行し、洗浄ステップまでベースラインに達しない。他方で、他の2つのカラムは、第3のピークが下降した後に再びベースラインに達する。

より良好な比較のために、3つのカラムのUVクロマトグラムを、図1に示す。加えて、後で個々の成分の溶出のための移動相の組成を推定することができるように、例としてフェニルHPについての伝導率をプロットする。この図は、とりわけ、類似した溶出プロファイルに加えて、溶出容量に関するカラム間の違いを示す。表1において、加えて、ピークの保持容量を最大値で列記する。保持容量についての装置誤差は、主に、ポンプの流速に依存し、製造業者によって1.5％に規定されており、異なるゲルチャージおよびカラムパックによる誤差は、5％と推定され、これは全誤差が6.5％であることを意味する。第1のピーク（最大値）は、Toyopearl PPGについての2.2 mL、およびPhenyl Sepharose HPについての2.8 mLに非常に近いが、すべての3つのカラムについて、第2のピークおよび第3のピークの保持容量は、より顕著に異なっている。ピーク2についての保持容量は19.8 mLであり、ピーク3は22.4 mLである。このように、Toyopearl Phenyl 650Mについての保持容量は、PPG-600MおよびPhenyl Sepharose HPのものよりも大きい。Phenyl Sepharose HPは、最低の保持容量を有し、ピーク2について15.7 mL、およびピーク3について18.7 mLである。Toyopearl PPG-600Mの保持容量は、Toyopearl Phenyl-650MよりもPhenyl Sepharose HPのものにより近い。

勾配中にToyopearl Phenyl-650MおよびPhenyl Sepharose HPにおいて溶出する分析物のピークは、保持容量において最も大きな違いを示す（ピーク2で4.1 mLおよびピーク3で3.7 mL）。他方で、Toyopearl PPG-600MとPhenyl Sepharose HPとの間の保持容量間の違いは、むしろ小さく、ピークは広範囲にわたってオーバーラップする。

カラムの組み合わせについての移動相の伝導率は、図1における伝導率および溶出プロファイルによって決定される。ローディング中に、移動相の伝導率は、54.5 mS/cmであるはずである。この伝導率で、EPOはラン中にあり、直ちに再使用することができる。オリゴPEG-EPOは、第1のカラムに結合するはずである（緑色、Phenyl Sepharose HP）。モノPEG-EPOおよび潜在的にブレークスルーするオリゴPEG-EPOは、他方で、第2のカラムのみに結合する（橙色、Toyopearl Phenyl-650M）。生成物であるモノPEG-EPOの溶出は、41 mS/cmでの第2のカラムの溶出によって起こる（橙色）。

（表１）3つの最も選択性のあるカラムの3つのメインピークの保持容量（mL）の比較。6.5％を全誤差として仮定する。

成分の溶出のための所望の塩濃度は、クロマトグラフィーシークエンスの伝導率の経過にわたって推定することができる。

物質収支
選択されたカラムについての物質収支を、表2に示す。試料ループ中に注入した試料の量を、インプットとして列記する。上記のように、試料の濃度は、光度計を用いて無希釈で測定した。これを次いで、試料ループ中に注入した。インプットについての誤差は、主に装置誤差に依存し、1％であることになる。アウトプットは、吸収の測定および吸収曲線の積分を介して、注入時に開始して溶出の終わりまでの全体のクロマトグラフィーランの間に算出された、試料の量を表す。誤差は、主に、流速の測定値およびUV測定値に関する。流速誤差は、ポンプが適正に動く場合には1.5％である。UV測定値誤差は、製造業者によって2.0％と示される。単一の測定値のみが利用可能であるため、偶然誤差は、10％と推定される。したがって、全誤差は13.5％である。

（表２）カラムへのアプライ前のmgでの試料の量と溶出された試料の量との比較は、測定精度に関して良好な一致を示す。インプットの量は、光度計によって測定し、他方、アウトプットの量は、UVクロマトグラムを積分することによって測定した。

実施例4
HPLCによる分離の特徴決定
試料成分であるEPO、モノPEG-EPO、およびオリゴPEG-EPOのクロマトグラフィー中の分離を確認するために、各クロマトグラフィーランについて6つの画分を収集して、HPLCによって特徴決定した。表3における結果をより容易にHICのクロマトグラムと比較できるように、文字a～fを、図2においてPhenyl Sepharose HPについて示される、特徴決定した画分に割り当てる。

（表３）クロマトグラムにおけるピークの組成をHPLC分析によって特徴決定した。EPO（非PEG）、モノPEG-EPO（モノ）、およびオリゴPEG-EPO（オリゴ）の％でのそれぞれの割合pを、各収集された画分について列記する。画分（a～f）の位置を、それぞれのクロマトグラムに示す。LOD：検出限界＜0.2％。

HPLC分析の結果から、試料のローディング中の3つのカラムすべてにおけるランは、100％非PEG化EPOであることが見られる。ピーク2は、主としてモノPEG-EPOからなり、ピーク3はオリゴPEG-EPOからなる。しかし、ピーク2およびピーク3の組成は、異なるカラムにおいて異なっている。Phenyl Sepharose HPは、ピーク2において99.3％モノPEG-EPOに加えて、0.7％EPOも含有する。しかし、Toyopearl Phenyl-650MおよびPPG-600Mのピーク2において、EPOはもはや検出することができない。ピーク2、ピーク3、および移行部（transition）は、モノPEG-EPOおよびオリゴPEG-EPOの異なる割合からなる。Toyopearl Phenylにおいて、ピーク2の画分bにおけるモノPEG-EPOの割合は100％であり、Toyopearl PPG-600Mにおいては、99.4％モノPEG-EPOである。

実施例5
カラム組み合わせの実行
Toyopearl Phenyl-650MおよびPhenyl Sepharose HPは、本明細書において用いられる二段階HIC条件下でのEPO、モノPEG-EPO、およびオリゴPEG-EPOの分離のためのクロマトグラフィー媒体として、十分に適していた。Phenyl Sepharose HP（Toyopearl Phenyl-650Mよりも疎水性が低い）を、第1のカラムとして用いる。Toyopearl Phenyl-650M（より疎水性）を、第2のカラムとして用いる。図5は、これらの2つのカラムの組み合わせのクロマトグラムを示す。合計で5つのピークが、認識可能である。第1のピークは、2つのカラムにわたる試料アプライ中のランである。第2および第3のピークは、それぞれ、Toyopearl Phenyl-650Mの溶出中に現れる。ピーク4および5は、Phenyl Sepharose HPの溶出中に現れる。pHは、クロマトグラフィー中にpH 7.6から7.3まで下降し、第2の溶出の初めに7.5のpH値まで上昇して、洗浄ステップによってpH 7.2まで落下する。カラムを、54.6 mS/cmの伝導率に対応する、13.5％のBで平衡化した。試料アプライ中に、伝導率は60.7 mS/cmまで上昇し、次いで再び54.6 mS/cmまで下降する。第1の溶出は、41.3 mS/cmの伝導率に対応する、40％のBでのステップで始まる。40％のBの段階において、最大のピークが現れ、これは、UVクロマトグラム下で総面積の49％を構成する。80％のBまでの勾配において、第3のピークが現れ；これは、有意により小さく、7.5面積％を有する。第2の溶出（Phenyl Sepharose HP）は、13.5％のBでの平衡化条件で開始する。溶出は、クロマトグラムにおける最小のピークで始まり、これは、3.4面積％を占める。その後の100％のBまでの勾配において、28.0面積パーセントを有する2番目に大きいピークが、次いで現れる。

次に、収集された画分の組成を、HPLC分析によって測定した。表4において、EPO（非PEG）、モノPEG-EPO（モノ）、およびオリゴPEG-EPO（オリゴ）の個々のピークの組成を列記する。ピーク1はこうして、100％EPOからなる。ピーク2は、100％モノPEG-EPOからなる。他方で、他のピークは、モノPEG-EPOとオリゴPEG-EPOの混合物である。アウトプットとは、総溶出物質の組成を表す。このために、吸収によって測定されたタンパク質の量を、ピークにおけるその組成で割った。こうして、インプット（ロード）の組成がクロマトグラフィー中に変化する程度を比較することができる。反応は、自己完結型であるため、インプットの組成は、アウトプットの組成と合うべきである。

（表４）ピークの組成をHPLC分析によって測定した。アウトプットの組成を算出した。LOD：検出限界＜0.2％。

インプットの組成とアウトプットの組成との比較を、回収率の算出によって表5に表す。回収率は、以下のように算出する。

回収率を、成分の各シェアpについて別々に算出する。

（表５）％での回収率の算出。インプットの組成を、総溶出試料物質（アウトプット）の組成と比較する。組成が測定されたそれぞれの分析の方法を括弧に示す。

同様に、物質収支が、回収率のように同等化されるべきである。得られた個々の成分の質量を、表6に示す。 (1.54 ± 0.21) mgタンパク質のアプライした質量が、アウトプットにおける(1.03 ± 0.14) mgの算出された質量から激しく逸脱していることが、注目に値する。通常の目視検査の結果として、システムの漏出および結果として生じる試料の損失は、除外することができる。この33％の顕著な逸脱のために、収率および損失のさらなる算出は、1.03 mg試料のアウトプットにおいて算出された質量を基準とする。

（表６）ピークにおいて収集されたタンパク質の量を、ピークの組成（HPLC分析）およびクロマトグラムにおけるUV吸収の積分を介して算出した。LOD＝検出限界。

表7は、2ステップクロマトグラフィーに帰する収率および損失を示す。EPOピークを表すピーク1を考えた場合には、ロードしたEPOの100％を、再使用のために回収することができる。ピーク2が収集された場合、ロードにおけるモノPEG-EPOの総量に関する収率は、89.5％である。40.0％の総タンパク質の損失は、ロードにおける総タンパク質質量を基準とし、これは、ピーク3、4、および5を捨てることにより、クロマトグラフィー中に起こる。表6に列記されるように、これらのピークは、主にオリゴPEG EPO、および少量のみのモノPEG-EPOを含有する。

（表７）実施された2ステップクロマトグラフィーにおける有用な画分（表6参照）の収率および損失。収率は、アウトプットにおけるそれぞれの成分の合計の割合を基準とする。損失は、総試料（1.03 mg）を基準とする。

参照文献
本発明および本発明が属する技術分野の最先端をより完全に説明し、かつ開示するために、多数の刊行物が上記で引用されている。これらの参照文献の完全な引用を、下記に提供する。これらの参照文献の各々の全体は、本明細書に組み入れられる。

標準的な分子生物学技術については、Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。

以下の番号付けした記載は、本開示の局面に関連し、かつ明細書の一部を形成する。
1. 以下の工程を含む、少なくとも約90％のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法：
（a）非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物を提供する工程；
（b）該タンパク質混合物を二段階疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）ステップに供する工程であって、
第1のHICフロースルー溶液を提供するために、該タンパク質混合物を第1のHIC材料にアプライすること；および
第2のHICフロースルー溶液を提供するために、該第1のHICフロースルー溶液を第2のHIC材料にアプライすること
を含み、
該第2のHIC材料が、該第1のHIC材料とは異なっており；かつ
該二段階HICステップが、オリゴPEG化タンパク質を該第1のHIC材料に結合させかつモノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料に結合させるのに適している二段階HIC条件下で実施される、該工程；ならびに
（c）該モノPEG化タンパク質組成物を提供する第2のHIC溶出液を提供するために、該モノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料から溶出させる工程。
2. 前記タンパク質がホルモンまたはサイトカインである、記載1による方法。
3. 前記タンパク質がエリスロポエチンである、記載2による方法。
4. 少なくとも約90％のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法であって、以下の工程を含み、該タンパク質がエリスロポエチンである、該方法：
（a）非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物を提供する工程；
（b）該タンパク質混合物を二段階疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）ステップに供する工程であって、
第1のHICフロースルー溶液を提供するために、該タンパク質混合物を第1のHIC材料にアプライすること；および
第2のHICフロースルー溶液を提供するために、該第1のHICフロースルー溶液を第2のHIC材料にアプライすること
を含み、
該第2のHIC材料が、該第1のHIC材料とは異なっており；かつ
該二段階HICステップが、オリゴPEG化タンパク質を該第1のHIC材料に結合させかつモノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料に結合させるのに適している二段階HIC条件下で実施される、該工程；ならびに
（c）該モノPEG化タンパク質組成物を提供する第2のHIC溶出液を提供するために、該モノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料から溶出させる工程。
5. 前記第1のHIC材料および前記第2のHIC材料が直列に直接接続されている、前記記載のいずれかによる方法。
6. 前記二段階HIC条件下で、前記第1のHIC材料が非PEG化タンパク質ともモノPEG化タンパク質とも結合せず、かつ前記第2のHIC材料が非PEG化タンパク質と結合しない、前記記載のいずれかによる方法。
7. 比較HIC溶出クロマトグラムにおいて、前記第1のHIC材料および前記第2のHIC材料が、モノPEG化タンパク質について十分に分解されたピークを有する、前記記載のいずれかによる方法。
8. （a）前記第1のHIC材料が、前記二段階HIC条件下でPhenyl Sepharose HPと実質的に同じ選択性を有し；かつ
（b）前記第2のHIC材料が、該二段階HIC条件下でToyopearl Phenyl 650Mと実質的に同じ選択性を有する、
前記記載のいずれかによる方法。
9. （a）前記第1のHIC材料がPhenyl Sepharose HPであり；かつ/または
（b）前記第2のHIC材料がToyopearl Phenyl 650Mである、
前記記載のいずれかによる方法。
10. 前記タンパク質がエリスロポエチンである、記載8または記載9による方法。
11. さらなる（d）第1のHIC溶出液を提供するために、前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程
を含む、前記記載のいずれかによる方法。
12. 前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程が直線勾配溶出を含む、記載11による方法。
13. i. 前記二段階HIC条件が、約54～55 mS/cmの伝導率におけるものであり；かつ/または
ii. 前記モノPEG化タンパク質を前記第2のHIC材料から溶出させる工程が、約40～41 mS/cmの伝導率におけるものであり；かつ/または
iii. 前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程が、約54～55 mS/cmから約1～5 mS.cmまでの直線勾配によって行われる、
前記請求項のいずれかによる方法。
14. 前記方法が、緩衝液Aと緩衝液Bの混合物を用いて行われ、緩衝液Aが25 mM HEPES、pH 7.5、500 mM Na₂SO₄を含み、かつ緩衝液Bが25 mM HEPES、pH 7.5を含み、かつ
i. 前記二段階HIC条件が、約13.5％の緩衝液Bにおけるものであり；かつ/または
ii. 前記モノPEG化タンパク質を前記第2のHIC材料から溶出させる工程が、約40％の緩衝液Bにおけるものであり；かつ/または
iii. 前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程が、約13.5％から約80％までの緩衝液Bの直線勾配によって行われる、
前記請求項のいずれかによる方法。
15. 前記タンパク質がエリスロポエチンである、記載13または14による方法。
16. モノPEG化エリスロポエチンが、少なくとも約20 kDaの分子量を有するPEG残基を含む、記載10または15による方法。
17. 前記第2のHIC材料からの前記モノPEG化タンパク質の溶出が、段階溶出と、その後に続く勾配溶出を含む、前記記載のいずれかによる方法。
18. 前記モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも約99％のモノPEG化タンパク質を含む、前記記載のいずれかによる方法。
19. 前記タンパク質混合物が、少なくとも10％のオリゴPEG化タンパク質を含む、前記記載のいずれかによる方法。
20. 前記モノPEG化タンパク質が、少なくとも約20 kDaの分子量を有するPEG残基を含む、前記記載のいずれかによる方法。
21. 前記モノPEG化タンパク質組成物が薬学的組成物であり、前記方法が、前記第2のHIC溶出液を薬学的賦形剤と共に製剤化する工程をさらに含む、前記記載のいずれかによる方法。

Claims (12)

1. 以下の工程を含む、少なくとも90％のモノPEG化タンパク質を含むモノPEG化タンパク質組成物を生成するための方法：
   （a）非PEG化タンパク質とモノPEG化タンパク質とオリゴPEG化タンパク質とを含むタンパク質混合物を提供する工程；
   （b）該タンパク質混合物を二段階疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）ステップに供する工程であって、
   第1のHICフロースルー溶液を提供するために、該タンパク質混合物を第1のHIC材料にアプライすること；および
   第2のHICフロースルー溶液を提供するために、該第1のHICフロースルー溶液を第2のHIC材料にアプライすること
   を含み、
   該第2のHIC材料が、該第1のHIC材料とは異なっており；かつ
   該二段階HICステップが、オリゴPEG化タンパク質を該第1のHIC材料に結合させかつモノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料に結合させるのに適している二段階HIC条件下で実施される、該工程；ならびに
   （c）該モノPEG化タンパク質組成物を提供する第2のHIC溶出液を提供するために、該モノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料から溶出させる工程、
   ここで、該タンパク質は、エリスロポエチンであり、
   （a）該第1のHIC材料は、Phenyl Sepharose(登録商標) HPであり；かつ
   （b）該第2のHIC材料は、Toyopearl(登録商標) Phenyl 650Mであり、
   該方法は、緩衝液Aと緩衝液Bの混合物を用いて行われ、緩衝液Aが25 mM HEPES、pH 7.5、500 mM Na ₂ SO ₄ を含み、かつ緩衝液Bが25 mM HEPES、pH 7.5を含み、かつ
   i. 該二段階HIC条件は、13.5％の緩衝液Bにおけるものであり；かつ
   ii. 該モノPEG化タンパク質を該第2のHIC材料から溶出させる工程は、40％の緩衝液Bにおけるものであり；かつ
   iii. 該オリゴPEG化タンパク質を該第1のHIC材料から溶出させる工程は、13.5％から80％までの緩衝液Bの直線勾配によって行われる。
2. 前記第1のHIC材料および前記第2のHIC材料が直列に直接接続されている、請求項1に記載の方法。
3. 前記二段階HIC条件下で、前記第1のHIC材料が非PEG化タンパク質ともモノPEG化タンパク質とも結合せず、かつ前記第2のHIC材料が非PEG化タンパク質と結合しない、請求項1または2に記載の方法。
4. 比較HIC溶出クロマトグラムにおいて、前記第1のHIC材料および前記第2のHIC材料が、モノPEG化タンパク質について十分に分解されたピークを有する、請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
5. さらなる（d）第1のHIC溶出液を提供するために、前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程
   を含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程が直線勾配溶出を含む、請求項5に記載の方法。
7. i. 前記二段階HIC条件が、54～55 mS/cmの伝導率におけるものであり；かつ/または
   ii. 前記モノPEG化タンパク質を前記第2のHIC材料から溶出させる工程が、40～41 mS/cmの伝導率におけるものであり；かつ/または
   iii. 前記オリゴPEG化タンパク質を前記第1のHIC材料から溶出させる工程が、54～55 mS/cmから1～5 mS/cmまでの直線勾配によって行われる、
   請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第2のHIC材料からの前記モノPEG化タンパク質の溶出が、段階溶出と、任意で、その後に続く勾配溶出を含む、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記モノPEG化タンパク質組成物が、少なくとも99％のモノPEG化タンパク質を含む、請求項1～8のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記タンパク質混合物が、少なくとも10％のオリゴPEG化タンパク質を含む、請求項1～9のいずれか一項に記載の方法。
11. モノPEG化タンパク質が、少なくとも20 kDaの分子量を有するPEG残基を含む、請求項1～10のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記モノPEG化タンパク質組成物が薬学的組成物であり、前記方法が、前記第2のHIC溶出液を薬学的賦形剤と共に製剤化する工程をさらに含む、請求項1～11のいずれか一項に記載の方法。

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