ES2909454T3 - Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para producir una composición de proteína mono-PEGilada que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada b) someter la primera mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio iónico (CII) para proporcionar una solución de flujo continuo de CII en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla; comprendiendo la etapa de CII aplicar la primera mezcla a un material de CII en condiciones adecuadas para unir proteína no PEGilada; c) recoger la solución de flujo continuo de CII de la etapa b) para proporcionar una segunda mezcla que comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; y d) someter la segunda mezcla a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) para proporcionar una composición de proteína mono-PEGilada en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, en la que la composición de proteína mono-PEGilada comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para proporcionar una composición de proteína PEGilada
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar composiciones de proteína PEGilada, en particular, procedimientos para proporcionar composiciones de proteína mono-PEGilada. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar composiciones de eritropoyetina (EPO) mono-PEGilada.
Antecedentes
La PEGilación, o pegilación, de proteínas se refiere a la adición de uno o más grupos PEG (polietilenglicol) a una proteína. La PEGilación es en particular útil para proteínas terapéuticas, por ejemplo, porque incrementa la semivida en circulación in vivo. Sin embargo, la PEGilación también puede reducir la actividad biológica de proteínas terapéuticas, reduciendo de este modo su eficacia. Por lo tanto, se ha de encontrar un equilibrio entre el incremento en el tiempo en circulación y la reducción en la eficacia terapéutica.
Para determinadas proteínas terapéuticas, la mono-PEGilación es en particular deseable porque proporciona una mejora en la estabilidad sin comprometer significativamente la eficacia terapéutica. Las proteínas terapéuticas mono-PEGiladas incluyen Mircera®, Peglntron® y Pegasys®. Micera® es una forma mono-PEGilada de eritropoyetina (EPO) y se usa para tratar la anemia.
Las reacciones de PEGilación tienden a producir mezclas que comprenden proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar), proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. Las condiciones de reacción que favorecen un alto grado de PEGilación (tales como tiempos de reacción largos, alta proporción molar PEG/proteína) tienden a producir una mezcla con una alta proporción de proteína oligo-PEGilada, lo que da como resultado bajos rendimientos cuando la proteína mono-PEGilada es el producto deseado. Las condiciones de reacción que favorecen un bajo grado de PEGilación (tales como tiempos de reacción cortos, baja proporción molar PEG/proteína) tienden a producir mezclas con una alta proporción de proteína sin reaccionar (no PEGilada), lo que también da como resultado bajos rendimientos cuando la proteína mono-PEGilada es el producto deseado.
Las proteínas terapéuticas a menudo son costosas de fabricar y, por lo tanto, los procedimientos que proporcionan buenos rendimientos de proteína terapéutica mono-PEGilada (desperdicio mínimo de proteína terapéutica sin reaccionar y/u oligo-PEGilada) son económicamente favorables y por lo tanto son en particular deseables.
Se han desarrollado procedimientos de PEGilación de una proteína de interés mientras está unida a una columna de cromatografía de intercambio iónico en un intento de manipular la especificidad de la PEGilación y mejorar, de este modo, los rendimientos de proteínas con un grado deseado de PEGilación (los así llamados procedimientos "en columna"). Dichos procedimientos son técnicamente complejos y requieren mucho tiempo y en consecuencia tienen baja productividad. Dichos procedimientos también pueden consumir cantidades relativamente grandes de reactivo de PEGilación, lo que los hace económicamente desfavorables. Se analizan diversos procedimientos de PEGilación "en columna" en Pfister (Reac React. Chem. Eng., 2016, 1,204), Ingold (2016) y Fee y Van Alstine (2006).
Los procedimientos de provisión de proteínas mono-PEGiladas pueden comprender realizar una reacción de PEGilación para proporcionar una mezcla que comprende proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar), proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada, y, a continuación, realizar una etapa de purificación para purificar la proteína mono-PEGilada. Los documentos WO 2009/010270 y WO 2012/035037 se refieren a procedimientos para purificar EPO mono-PEGilada de una mezcla que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. Los procedimientos de purificación implican someter la mezcla que resulta de una reacción de PEGilación a al menos una etapa de cromatografía de intercambio catiónico (CIC). La etapa de CIC se realiza en modo de unión y elución y las diferentes fracciones de elución comprenden principalmente EPO no PEGilada, mono-PEGilada u oligo-PEGilada. Dichos procedimientos de CIC se deben llevar a cabo por debajo del punto isoeléctrico de la proteína, que en el caso de la EPO (punto isoeléctrico en el intervalo de 4,0 a 5,5) implica la CIC a un pH de alrededor de 3,0. El documento WO 2007/010552 divulga la purificación de EPO monoPEGilada usando cromatografía de intercambio aniónico en modo de unión y elución.
Los procedimientos para producir proteínas mono-PEGiladas realizando una reacción de PEGilación y, a continuación, purificando la proteína mono-PEGilada de la mezcla resultante pueden implicar reciclar la proteína sin reaccionar (no PEGilada). Estos procedimientos implican recuperar la proteína sin reaccionar y añadirla a una reacción de PEGilación posterior. Dicho reciclado mejora el rendimiento global de proteína mono-PEGilada.
Pfister (Biotech and Bioeng, 2016) describe un procedimiento en el que se realiza una reacción de PEGilación seguida de purificación de proteína mono-PEGilada de una mezcla que comprende proteína sin reaccionar (no PEGilada), mono-PEGilada y oligo-PEGilada. En el procedimiento, la proteína sin reaccionar se recupera y se usa en una reacción de PEGilación posterior. El procedimiento de purificación comprende una cromatografía de intercambio catiónico (CIC) en modo de unión y elución, en el que la proteína sin reaccionar, la proteína mono-PEGilada y la proteína oligo-PEGilada se separan en elución secuencial. La proteína sin reaccionar se eluye por último, usando un tampón de elución con contenido alto en sal. Por lo tanto, el reciclado de proteína sin reaccionar requiere la retirada de sal por diafiltración antes de que se pueda someter a otra reacción de PEGilación. El requisito de retirada de sal reduce la productividad e incrementa la complejidad del procedimiento.
La presente invención se ha concebido en vista de las consideraciones anteriores.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar composiciones de proteína mono-PEGilada. Los procedimientos de la invención son, en particular, adecuados para proporcionar composiciones de EPO mono-PEGilada. Las ventajas del procedimiento descrito en el presente documento incluyen alto rendimiento y productividad.
La presente invención proporciona un procedimiento para producir una composición de proteína que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada (b) someter la primera mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio iónico (CII) para proporcionar una solución de flujo continuo de CII; comprendiendo la etapa de CII aplicar la primera mezcla a un material de CII en condiciones adecuadas para unir proteína no PEGilada; (c) recoger la solución de flujo continuo de CII de la etapa b) para proporcionar una segunda mezcla que comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; y (d) someter la segunda mezcla a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) para proporcionar una composición de proteína en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, en la que la composición de proteína comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada.
La etapa de CII puede ser una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) o una etapa de cromatografía de intercambio catiónico (CIC). La presente invención proporciona un procedimiento para producir una composición de proteína que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada (b) someter la primera mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) para proporcionar una solución de flujo continuo de CIA; comprendiendo la etapa de CIA aplicar la primera mezcla a un material de CIA en condiciones adecuadas para unir proteína no PEGilada; (c) recoger la solución de flujo continuo de CIA de la etapa b) para proporcionar una segunda mezcla que comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; y (d) someter la segunda mezcla a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) para proporcionar una composición de proteína en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, en la que la composición de proteína comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada.
La primera mezcla puede contener una proporción relativamente baja de proteína oligo-PEGilada. Por ejemplo, la primera mezcla puede comprender menos de un 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de proteína oligo-PEGilada.
La solución de flujo continuo de CII (solución de flujo continuo de CIA o CIC) puede contener una proporción relativamente alta de proteína PEGilada. Por ejemplo, la solución de flujo continuo de CII puede comprender al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o al menos aproximadamente un 99,9 % de proteína PEGilada. La solución de flujo continuo de CIA puede contener una proporción relativamente alta de proteína PEGilada. Por ejemplo, la solución de flujo continuo de CIA puede comprender al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o al menos aproximadamente un 99,9 % de proteína PEGilada.
La composición de proteína mono-PEGilada puede contener una proporción relativamente alta de proteína mono-PEGilada. Por ejemplo, la composición de proteína puede comprender al menos aproximadamente un 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de proteína mono-PEGilada.
El material de CII puede tener una capacidad de unión para proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,5 g/l. El material de CII puede tener una capacidad de unión para proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,0 g/l, 0,75 g/l, 0,5 g/l, 0,25 g/l, 0,10 g/l o 0,05 g/l. La capacidad de unión puede ser la capacidad de unión dinámica. El material de CIA puede tener una capacidad de unión para proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,5 g/l. El material de CIA puede tener una capacidad de unión para proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,0 g/l, 0,75 g/l, 0,5 g/l, 0,25 g/l, 0,10 g/l o 0,05 g/l. La capacidad de unión puede ser la capacidad de unión dinámica. El material de CII puede ser un material de CIA y la proteína PEGilada puede ser eritropoyetina PEGilada.
El material de CII puede tener una capacidad de unión relativamente alta para proteína no PEGilada (por ejemplo, EPO no PEGilada) de 20 - 50 g/l, 30 - 40 g/l o de aproximadamente 35 g/l. El material de CII puede tener una capacidad de unión para proteína no PEGilada (por ejemplo, EPO no PEGilada) de al menos aproximadamente 20 g/l, 25 g/l, 30 g/l o de aproximadamente 35 g/l. La capacidad de unión puede ser la capacidad de unión dinámica. El material de CII puede ser un material de CIA y la proteína no PEGilada puede ser eritropoyetina no PEGilada.
La proteína puede ser eritropoyetina (EPO). La proteína puede ser una hormona. La proteína puede ser una hormona, una citocina, una enzima o un anticuerpo.
El procedimiento puede comprender una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) y la proteína puede ser eritropoyetina.
Las proteínas mono-PEGiladas pueden ser deseables porque proporcionan un equilibrio entre el incremento en la semivida y una actividad biológica comparable con respecto a las versiones no PEGiladas y oligo-PEGiladas de la proteína. Sin embargo, las reacciones de PEGilación tienden a producir mezclas que comprenden proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar), proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. Las proteínas, especialmente proteínas terapéuticas, son a menudo caras de fabricar y por lo tanto los procedimientos que proporcionan buenos rendimientos de proteína terapéutica mono-PEGilada son en particular deseables. Los procedimientos que proporcionan buenos rendimientos de EPO mono-PEGilada (Mircera®) son en particular deseables.
Los procedimientos divulgados en el presente documento son ventajosos porque son relativamente rápidos y por lo tanto permiten una productividad relativamente alta. Los procedimientos divulgados en el presente documento también permiten un alto rendimiento, ya que una alta proporción de la proteína de partida se vuelve mono-PEGilada. Los procedimientos divulgados en el presente documento también proporcionan composiciones de proteína mono-PEGilada de pureza relativamente alta.
Los procedimientos divulgados en el presente documento se realizan usando una primera mezcla que contiene proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada. La proporción de proteína oligo-PEGilada en la primera mezcla puede ser relativamente baja. Los procedimientos implican una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) que proporciona una solución de flujo continuo de CIA en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla. Los procedimientos implican una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) que proporciona una solución de flujo continuo de CIA en la que la fracción de proteína no PEGilada disminuye con respecto a la primera mezcla. La solución de flujo continuo de CIA puede contener una alta proporción de proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada consiste en proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. Es decir, los procedimientos de la invención implican una etapa de CIA que se realiza en modo de flujo continuo. La etapa de CIA en el modo de flujo continuo es relativamente rápida.
La solución de flujo continuo de la etapa de CII (CIA o bien CIC) se usa para proporcionar una segunda mezcla que se somete a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) para separar la proteína mono-PEGilada de la proteína oligo-PEGilada y de este modo proporcionar una composición que comprende una proporción relativamente alta de proteína mono-PEGilada. Tanto la etapa de intercambio iónico como la etapa de CIH son relativamente rápidas, proporcionando de este modo un procedimiento relativamente rápido para producir una composición de proteína mono-PEGilada. La etapa de CIH se puede realizar en modo de flujo continuo, lo que es en particular rápido, para proporcionar un procedimiento rápido para producir una composición de proteína mono-PEGilada.
La etapa de CII (CIA o CIC) relativamente rápida de la invención contribuye a la productividad relativamente alta global de los procedimientos de la invención.
Los procedimientos de la invención que implican cromatografía de intercambio aniónico son en particular adecuados para producir composiciones de EPO mono-PEGilada. En los procedimientos para producir EPO mono-PEGilada, la etapa de CIA se realiza a un pH de aproximadamente 7,0 a 10,0, de aproximadamente 7,0 a 9,0, de aproximadamente de 7,5 a 8,5 o de aproximadamente 8,0. Esto es ventajoso sobre procedimientos que implican cromatografía de intercambio catiónico (CIC) que se realiza en general a un pH de 3,0 o menor. Las condiciones ácidas de aproximadamente pH 3,0 o menor pueden tener efectos adversos sobre la calidad de la EPO, dichos efectos adversos se reducen en los procedimientos de la presente invención, que no requieren la CIC y, por tanto, no requieren las condiciones de pH bajo necesarias para la purificación basada en CIC de EPO.
Además, las formas ácidas (variantes ácidas) de EPO pueden tener alta actividad terapéutica, lo que las hace en particular útiles. Sin embargo, la recuperación de formas ácidas mono-PEGiladas de EPO por CIC puede ser mala porque sus condiciones de elución en CIC son similares a las de las formas no ácidas di-PEGiladas de EPO. Las condiciones ácidas dan como resultado la oxidación de las cadenas laterales de aminoácidos en una molécula de proteína. A medida que la CIC separa las moléculas de proteína de acuerdo con su carga, las variantes básicas de una especie se eluirán más tarde que las variantes ácidas. Por este motivo, el perfil de elución de CIC de formas no ácidas di-pegiladas de EPO se tiende a solapar con las formas ácidas mono-PEGiladas de EPO. La mala recuperación de estas formas de EPO ácidas mono-PEGiladas útiles por CIC se reduce en los procedimientos divulgados en el presente documento, que no se basan en la CIC para separar EPO mono-PEGilada de la oligo-PEGilada.
Las ventajas asociadas con la invención para proporcionar EPO mono-PEGilada se pueden aplicar a otras proteínas, en particular otras proteínas terapéuticas. Es decir, evitar las condiciones de pH bajo y recuperar las variantes ácidas puede hacer que la invención sea útil para proporcionar proteínas monoPEGiladas distintas de EPO monoPEGilada.
Los procedimientos de la invención pueden implicar realizar una reacción de PEGilación a aproximadamente pH 7,0 a 9,0, lo que se puede realizar usando un reactivo de PEG activado con N-hidroxisuccinimida (NHS). La reacción de PEGilación se puede realizar a aproximadamente pH 7,5 a 8,5, o a aproximadamente pH 8,0, y se puede realizar usando un reactivo de PEG activado con n Hs . Esto proporciona una etapa de PEGilación relativamente rápida, lo que contribuye a la rapidez global y la alta productividad del procedimiento.
Los procedimientos pueden comprender llevar a cabo las etapas de CII y CIH sustancialmente al mismo pH. Los procedimientos pueden comprender llevar a cabo las etapas de reacción de PEGilación, CII y CIH sustancialmente al mismo pH. Los procedimientos pueden comprender llevar a cabo las etapas CIA y CIH sustancialmente al mismo pH. Los procedimientos pueden comprender llevar a cabo las etapas de reacción de PEGilación, CIA y CIH sustancialmente al mismo pH. El pH puede ser de aproximadamente 7,0 a 9,0, o de aproximadamente 7,5 a 8,5, o de aproximadamente 8,0. Sustancialmente el mismo pH se puede referir a ±0,5 unidades de pH. Realizar etapas del procedimiento sustancialmente al mismo pH es ventajoso porque evita la necesidad de ajustes de pH entre etapas, ajustes de pH que pueden requerir mucho tiempo y por lo tanto reducir la productividad. El procedimiento puede comprender llevar a cabo una reacción de PEGilación para proporcionar una primera mezcla y aplicar la primera mezcla directamente al material de CII. Es decir, el procedimiento puede comprender llevar a cabo una reacción de PEGilación y aplicar la mezcla resultante al material de CII sin ajustar el pH de la mezcla.
Los procedimientos pueden implicar realizar una reacción de PEGilación y reciclar proteína no PEGilada. Dichos procedimientos son ventajosos porque permiten un rendimiento relativamente alto.
Los procedimientos pueden implicar realizar una reacción de PEGilación para proporcionar la primera mezcla y reciclar la proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar) de esa reacción de PEGilación. La proteína no PEGilada se puede recuperar de la primera mezcla como parte de la etapa de CII. La etapa de CII implica poner en contacto la primera mezcla con un material de intercambio iónico. El flujo continuo de CII comprende una proporción relativamente alta de proteína PEGilada (proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada) porque la mayoría de la proteína no PEGilada se une al material de intercambio iónico. Por tanto, la proteína no PEGilada se puede recuperar de la primera mezcla eluyéndola del material de CII. La proteína no PEGilada recuperada se puede añadir a una reacción de PEGilación posterior, reciclando de este modo la proteína no PEGilada.
Los procedimientos pueden implicar realizar una reacción de PEGilación para proporcionar la primera mezcla y reciclar la proteína no PEGilada (proteína sin reaccionar) de esa reacción de PEGilación. La proteína no PEGilada se puede recuperar de la primera mezcla como parte de la etapa de CIA. La etapa de CIA implica poner en contacto la primera mezcla con un material de intercambio aniónico. El flujo continuo de CIA comprende una proporción relativamente alta de proteína PEGilada (proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada) porque la mayoría de la proteína no PEGilada se une al material de intercambio aniónico. Por tanto, la proteína no PEGilada se puede recuperar de la primera mezcla eluyéndola del material de CIA. La proteína no PEGilada recuperada se puede añadir a una reacción de PEGilación posterior, reciclando de este modo la proteína no PEGilada.
El reciclaje de proteína no PEGilada en los procedimientos divulgados en el presente documento se logra eluyendo proteína no PEGilada en la etapa de CII. La elución de proteína no PEGilada de un material de intercambio iónico es relativamente sencilla y rápida, permitiendo de este modo una recuperación simple y rápida de la proteína sin reaccionar para su reciclaje. El reciclaje de proteína no PEGilada en los procedimientos divulgados en el presente documento se puede lograr eluyendo proteína no PEGilada en la etapa de CIA. La elución de proteína no PEGilada de un material de intercambio aniónico es relativamente sencilla y rápida, permitiendo de este modo una recuperación simple y rápida de la proteína sin reaccionar para su reciclaje. La rapidez de la elución para el reciclaje de proteína no PEGilada contribuye a la rapidez y productividad globales de los procedimientos divulgados en el presente documento.
La solución de flujo continuo de CII tiene un incremento en la fracción de proteína PEGilada con respecto a la primera mezcla. La solución de flujo continuo de CII tiene una disminución en la fracción de proteína no PEGilada con respecto a la primera mezcla. Por ejemplo, la solución de flujo continuo de CIA tiene un incremento en la fracción de proteína PEGilada con respecto a la primera mezcla. La solución de flujo continuo de CIA tiene una disminución en la fracción de proteína no PEGilada con respecto a la primera mezcla.
Una etapa de CIA comprende aplicar la primera mezcla a un material de intercambio aniónico. El material de intercambio aniónico puede ser un material de intercambio aniónico fuerte. Puede ser Toyopearl SuperQ 650M, que es un material de intercambio aniónico fuerte. El material de intercambio aniónico puede tener una capacidad de unión baja para la forma PEGilada de la proteína. El material de intercambio aniónico puede tener una capacidad de unión para proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,5 g/l, menos de aproximadamente 1,0 g/l, menos de aproximadamente 0,75 g/l, menos de aproximadamente 0,5 g/l, menos de aproximadamente 0,1 g/l, menos de aproximadamente 0,05 g/l, menos de aproximadamente 0,01 g/l o menos de aproximadamente 0,001 g/l. El material de intercambio aniónico puede tener una capacidad de unión para proteína PEGilada de casi 0 g/l (es decir, de casi 0 g de proteína PEGilada/l de resina de CIA). En particular, el material de intercambio aniónico puede tener una capacidad de unión para EPO PEGilada de menos de aproximadamente 0,5 g/l, menos de aproximadamente 0,05 g/l, menos de aproximadamente 0,01 g/l o menos de aproximadamente 0,001 g/l. El material de intercambio aniónico puede tener una capacidad de unión para EPO PEGilada de casi 0 g/l (es decir, de casi 0 g de EPO PEGilada/l de resina de CIA).
Una etapa de CIC comprende aplicar la primera mezcla a un material de intercambio catiónico. El material de intercambio catiónico puede ser un material de intercambio aniónico fuerte. El material de intercambio catiónico puede comprender grupos funcionales cargados negativamente, tales como grupos funcionales ácido sulfónico. El material de intercambio catiónico puede tener una capacidad de unión baja para la forma PEGilada de la proteína. El material de intercambio catiónico puede tener una capacidad de unión para proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,5 g/l, menos de aproximadamente 1,0 g/l, menos de aproximadamente 0,75 g/l, menos de aproximadamente 0,5 g/l, menos de aproximadamente 0,1 g/l, menos de aproximadamente 0,05 g/l, menos de aproximadamente 0,01 g/l o menos de aproximadamente 0,001 g/l. El material de intercambio catiónico puede tener una capacidad de unión para proteína PEGilada de casi 0 g/l (es decir, de casi 0 g de proteína PEGilada/l de resina de CIC). En particular, el material de intercambio catiónico puede tener una capacidad de unión para EPO PEGilada de menos de aproximadamente 0,5 g/l, menos de aproximadamente 0,05 g/l, menos de aproximadamente 0,01 g/l o menos de aproximadamente 0,001 g/l. El material de intercambio catiónico puede tener una capacidad de unión para EPO PEGilada de casi 0 g/l (es decir, de casi 0 g de EPO PEGilada/l de resina de CIC).
El uso de un material de intercambio iónico (material de CIA o CIC) con una capacidad de unión baja para la forma PEGilada de la proteína es ventajoso porque facilita la separación rápida de la proteína no PEGilada de la proteína PEGilada. La etapa de CII (CIA o CIC) se puede realizar en modo de flujo continuo para proporcionar rápidamente una solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) de la que se ha retirado la mayoría, o casi toda, la proteína sin reaccionar (no PEGilada). Por lo tanto, la solución de flujo continuo de la etapa de CII (CIA o CIC) comprende una proporción relativamente alta de proteína PEGilada. Puede comprender al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de proteína PEGilada, o un 80-95 % de proteína PEGilada. Puede comprender al menos aproximadamente un 90 % de proteína PEGilada. Puede comprender al menos aproximadamente un 95 % de proteína PEGilada. Puede comprender una proporción baja, casi ninguna o ninguna proteína no PEGilada. Puede comprender menos de aproximadamente un 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de proteína no PEGilada, o aproximadamente un 20-5 % de proteína no PEGilada. Puede comprender menos de un 10 % de proteína no PEGilada. Puede comprender menos de un 5 % de proteína no PEGilada. Por ejemplo, la etapa de CIA se puede realizar en modo de flujo continuo para proporcionar rápidamente una solución de flujo continuo de CIA de la que se ha retirado la mayoría, o casi toda, la proteína sin reaccionar (no PEGilada). Por lo tanto, la solución de flujo continuo de la etapa de CIA comprende una proporción relativamente alta de proteína PEGilada. Puede comprender al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de proteína PEGilada, o un 80-95 % de proteína PEGilada. Puede comprender al menos aproximadamente un 90 % de proteína PEGilada. Puede comprender al menos aproximadamente un 95 % de proteína PEGilada. Puede comprender una proporción baja, casi ninguna o ninguna proteína no PEGilada. Puede comprender menos de aproximadamente un 20 %, 15 %, 10 % o 5 % de proteína no PEGilada, o aproximadamente un 20-5 % de proteína no PEGilada. Puede comprender menos de un 10 % de proteína no PEGilada. Puede comprender menos de un 5 % de proteína no PEGilada.
Otra ventaja de uso de un material de intercambio iónico, tal como un material de intercambio aniónico, con una capacidad de unión baja para la forma PEGilada de la proteína es que facilita la recuperación rápida de la proteína sin reaccionar (no PEGilada) del material de intercambio iónico. La proteína no PEGilada se puede recuperar rápidamente por elución por etapas, lo que puede proporcionar un eluido que comprende la proteína no PEGilada en una forma relativamente concentrada lo que puede ser adecuado para la adición directa a una reacción de PEGilación. La proteína no PEGilada se puede eluir del material de intercambio iónico en una etapa de elución realizada con una conductividad relativamente baja o una concentración de sal baja, lo que facilita el reciclaje de la proteína no PEGilada, por ejemplo, debido a la retirada de concentraciones de sal altas (por ejemplo, por diafiltración, reconcentración o intercambio de tampón) no se requiere antes de que se añada el eluido a una reacción de PEGilación posterior. El uso de un material de intercambio iónico, como un material de intercambio aniónico, con una capacidad de unión baja para la forma PEGilada de la proteína es ventajoso por tanto porque proporciona una recuperación rápida de la proteína sin reaccionar (no PEGilada) en una forma que es en particular adecuada para reciclar en una reacción de PEGilación posterior.
Los procedimientos de la invención implican proporcionar una segunda mezcla, que comprende recoger la solución de flujo continuo de la etapa de CII (que puede ser una etapa de CIA o CIC). Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden implicar proporcionar una segunda mezcla, lo que comprende recoger la solución de flujo continuo de la etapa de CIA. Recoger la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) puede comprender recoger lotes o fracciones de solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) de ciclos de CII (CIA o CIC) separados, de esta manera se proporciona una segunda mezcla que es una segunda mezcla agrupada. Recoger la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) puede comprender suministrar la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) a un material de CIH por medio de una conexión en línea, en una operación de "acondicionamiento en línea". Recoger la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) puede comprender suministrar la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) a un recipiente para acondicionar la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) para proporcionar una segunda mezcla. Recoger la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) puede comprender suministrar la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) directamente al material de CIH. Cuando la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) se suministra directamente al material de CIH, la solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) se puede acondicionar por ejemplo acondicionando en línea para proporcionar una segunda mezcla al material de CIH. Puede existir un flujo continuo de solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) desde el material de CII (CIA o CIC) al material de CIH que se acondiciona en línea para proporcionar un flujo continuo de segunda mezcla al material de CIH. La solución de flujo continuo de CII (CIA o CIC) puede comprender una proporción baja de proteína no PEGilada y una proporción alta de proteína PEGilada (proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada). Los procedimientos de la invención implican además separar la proteína mono-PEGilada de la proteína oligo-PEGilada en la segunda mezcla realizando una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH).
Por ejemplo, recoger la solución de flujo continuo de CIA puede comprender recoger lotes o fracciones de solución de flujo continuo de CIA de ciclos de CIA separados, de esta manera se proporciona una segunda mezcla que es una segunda mezcla agrupada. Recoger la solución de flujo continuo de CIA puede comprender suministrar la solución de flujo continuo de CIA a un material de CIH por medio de una conexión en línea, en una operación de "acondicionamiento en línea". Recoger la solución de flujo continuo de CIA puede comprender suministrar la solución de flujo continuo de CIA a un recipiente para acondicionar la solución de flujo continuo de CIA para proporcionar una segunda mezcla. Recoger la solución de flujo continuo de CIA puede comprender suministrar la solución de flujo continuo de CIA directamente al material de CIH. Cuando la solución de flujo continuo de CIA se suministra directamente al material de CIH, la solución de flujo continuo de CIA se puede acondicionar por ejemplo acondicionando en línea para proporcionar una segunda mezcla al material de CIH. Puede existir un flujo continuo de solución de flujo continuo de CIA desde el material de CIA al material de CIH que se acondiciona en línea para proporcionar un flujo continuo de segunda mezcla al material de CIH. La solución de flujo continuo de CIA puede comprender una proporción baja de proteína no PEGilada y una proporción alta de proteína PEGilada (proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada). Los procedimientos de la invención implican además separar la proteína mono-PEGilada de la proteína oligo-PEGilada en la segunda mezcla realizando una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH).
Acondicionar la solución de flujo continuo de CII se puede denominar proporcionar una segunda mezcla acondicionada. Las segundas mezclas acondicionadas se describen con más detalle a continuación. Acondicionar una solución de flujo continuo de CII (o proporcionar una segunda mezcla acondicionada) puede comprender la adición de sal. Acondicionar una solución de flujo continuo de CII la adición de bicina. Acondicionar una solución de flujo continuo de CII (o proporcionar una segunda mezcla acondicionada) puede comprender la adición de sal y bicina. Acondicionar una solución de flujo continuo de CII (o proporcionar una segunda mezcla acondicionada) puede comprender la adición de sal y/o bicina para proporcionar una segunda mezcla acondicionada como se describe a continuación.
La etapa de CIH se puede realizar en modo de flujo continuo. La etapa de CIH en el modo de flujo continuo puede comprender poner en contacto la segunda mezcla con un material de interacción hidrófobo y recoger el flujo continuo. El flujo continuo comprende una proporción relativamente alta de proteína mono-PEGilada. Realizar la etapa de CIH en modo de flujo continuo es ventajoso porque se puede realizar relativamente rápido, contribuyendo de este modo a la rapidez y productividad globales del procedimiento. Realizar la etapa de CIH en el modo de flujo continuo, en lugar del modo de unión y elución, es ventajoso porque se puede realizar usando una columna de tamaño relativamente pequeño.
La etapa de proporcionar la segunda mezcla puede comprender agrupar la solución de flujo continuo de dos etapas de CII, o tres etapas de CII, o más de tres etapas de CII, o cuatro etapas de CII, o cinco etapas de CII. Las etapas de CII se pueden realizar en procedimientos que implican el reciclaje de proteína no PEGilada. Dicho agrupamiento de solución de flujo continuo de CII permite que la etapa de CIH produzca una composición de proteína mono-PEGilada a partir de los productos de múltiples reacciones de PEGilación, lo que es relativamente eficaz. Las etapas de CII pueden ser etapas de CIA o CIC. La etapa de proporcionar la segunda mezcla puede comprender agrupar la solución de flujo continuo de dos etapas de CIA, o tres etapas de CIA, o más de tres etapas de CIA, o cuatro etapas de CIA, o cinco etapas de CIA. Las etapas de CIA se pueden realizar en procedimientos que impliquen el reciclaje de proteína no PEGilada. Dicho agrupamiento de solución de flujo continuo de CIA permite que la etapa de CIH produzca una composición de proteína mono-PEGilada a partir de los productos de múltiples reacciones de PEGilación, lo que es relativamente eficaz.
Sumario de las figuras
En las figuras, "EPO" se refiere a EPO sin reaccionar (EPO no PEGilada), "mono" se refiere a EPO mono-PEGilada, "oligo" se refiere a EPO oligo-PEGilada. "F/T" se refiere a solución de flujo continuo.
Figura 1: secuencia esquemática y datos clave de un modo de realización de un procedimiento de acuerdo con la presente invención. El material de partida no PEGilado se usa en otros dos ciclos sin complementar con EPO recién obtenida. Se calcula que la productividad se incrementa con respecto a un procedimiento de producción conocido para EPO mono-PEGilada (Mircera®) divulgado en el documento WO 2009/010270, en el que se usan dos columnas cromatográficas de CIC. La capacidad de unión dinámica del material de CIA es de 35 g/l (35 g de proteína no PEGilada/l de resina) (un factor de 30 mayor que el material de CIC del procedimiento del documento WO 2009/010270). La columna de CIH se puede cargar en modo de flujo continuo con una capacidad de unión dinámica de 5 g/l (5 g de proteína oligo-PEGilada/l de resina) (un factor de ~4 mayor que el material de CIC usado en el procedimiento del documento WO 2009/010270). En comparación con el procedimiento divulgado en el documento WO 2009/010270, la primera columna se puede hacer más pequeña y las fracciones combinadas (flujo continuo) de los 3 ciclos se pueden procesar en una tanda en una segunda columna de igual tamaño.
Figura 2: secuencia esquemática y datos clave de un modo de realización de un procedimiento de acuerdo con la presente invención. El tamaño de lote se incrementa reemplazando la EPO reaccionada con una cantidad idéntica de EPO recién obtenida para el ciclo posterior. El número de ciclos se puede variar aquí como se desee. Aquí se seleccionó el tamaño de lote de modo que se pueda completar en una semana. La productividad calculada se incrementa en un factor de 10 con respecto a un procedimiento de producción conocido para EPO mono-PEGilada divulgado en el documento WO 2009/010270.
Figura 3: secuencia esquemática y datos clave de un modo de realización de un procedimiento de acuerdo con la presente invención. El tamaño de lote se incrementa porque la EPO consumida en la reacción de PEGilación se reemplaza con una cantidad idéntica de EPO recién obtenida en el siguiente ciclo. Además, la concentración de la EPO para la reacción de PEGilación se incrementó hasta 10 g/l. De esta manera, se puede procesar el doble de la cantidad en el mismo volumen de reacción. El número de ciclos se puede variar como se desee en este caso. Aquí se seleccionó el tamaño de lote de modo que se pueda completar en una semana. Se calcula que la productividad se incrementa en un factor de 20 con respecto a un procedimiento de producción conocido para EPO mono-PEGilada divulgado en el documento WO 2009/010270.
Figura 4: cromatograma de muestras de CIA en modo de flujo continuo, mostrando la recuperación de EPO de la mezcla de reacción de PEGilación en las fracciones de flujo continuo y de eluido. EPO mono-PEGilada y EPO oligo-PEGilada están presentes en la solución de flujo continuo. La EPO se puede recuperar por elución por etapas casi cuantitativamente y con pureza alta para otra reacción de PEGilación. La composición de fracciones se determinó por RP-HPLC.
Figura 5: ejemplos de cromatogramas de CIA para la recuperación de EPO de la mezcla de reacción de PEGilación en tres ciclos secuenciales. La cantidad total de EPO en los ciclos 2 y 3 se reduce, porque solo se usó EPO sin reaccionar recuperada del ciclo previo para la PEGilación en los ciclos 2 y 3. EPO mono-PEGilada y oligo-PEGilada están presentes en la solución de flujo continuo. La EPO sin reaccionar se puede recuperar por elución por etapas casi cuantitativamente y con pureza alta para otras reacciones de PEGilación. La composición de fracciones se determinó por RP-HPLC.
Figura 6: ejemplo de cromatograma de CIH para la realización de la purificación en Toyopearl Phenyl 650 M en modo de unión y elución. Se retiró EPO no PEGilada en la solución de flujo continuo a Na2SO4 500 mM. En un gradiente de Na2SO4 descendente, la EPO mono-PEGilada se eluye a aproximadamente Na2SO4 300 mM con buena resolución de las especies oligo. La composición de fracciones se determinó por RP-HPLC.
Figura 7: ejemplo de cromatograma de CIH para la capacidad de realización de la purificación en Toyopearl Phenyl 650 M en modo de flujo continuo. EPO mono-PEGilada está presente en la solución de flujo continuo a aproximadamente Na2SO4 300 mM. Las especies de EPO oligo-PEGilada permanecen en la columna hasta la regeneración. La composición de fracciones se determinó por RP-HPLC.
Figura 8: las figuras 8A, 8B y 8C muestran cromatogramas de CIA para la recuperación de EPO de la mezcla de reacción de PEGilación en tres ciclos secuenciales.
Figura 9: cromatograma de CIH para la capacidad de realización de la purificación en Toyopearl Phenyl 650 M en modo de unión y elución.
Figura 10: cromatograma de CIH para la capacidad de realización de la purificación en Toyopearl Phenyl 650 M en modo de flujo continuo.
Descripción detallada de la invención
Los modos de realización y experimentos que ilustran los principios de la invención se analizarán ahora con referencia a las figuras adjuntas.
Composiciones de proteína mono-PEGilada
La presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar composiciones de proteína mono-PEGilada. La presente invención se refiere a procedimientos para proporcionar una composición de proteína que comprende al menos un 90 % de proteína mono-PEGilada. En particular, la presente invención proporciona procedimientos para proporcionar una composición de EPO que comprende al menos un 90 % de EPO mono-PEGilada.
En el presente contexto, una composición de proteína mono-PEGilada es una composición que comprende una proteína, en la que una proporción relativamente alta de la proteína presente en la composición está presente como proteína mono-PEGilada. Una composición de proteína mono-PEGilada puede comprender al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o 99,99 % de proteína mono-PEGilada.
Una composición de proteína que comprende al menos un x % de proteína mono-PEGilada se refiere a una composición de proteína en la que al menos un x % de la proteína presente en esa composición está mono-PEGilada. Por ejemplo, una composición de proteína que comprende al menos un 99 % de proteína mono-PEGilada es una composición de proteína en la que al menos un 99 % de esa proteína presente en la composición está mono-PEGilada. Las composiciones de proteína producidas por los procedimientos de la invención pueden comprender al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o 99,99 % de proteína mono-PEGilada.
En particular, en el presente contexto, una composición de EPO mono-PEGilada es una composición que comprende EPO, en la que una proporción relativamente alta de la EPO presente en la composición está presente como EPO mono-PEGilada. Una composición de EPO que comprende al menos un "x %" de EPO mono-PEGilada se refiere a una composición de EPO en la que al menos un "x %" de la EPO presente en esa composición está mono-PEGilada. Por ejemplo, una composición de EPO que comprende al menos un 99 % de EPO mono-PEGilada es una composición de EPO en la que al menos un 99 % de la EPO presente en la composición está mono-PEGilada. Las composiciones de EPO producidas por los procedimientos de la invención pueden comprender al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o 99,99 % de proteína mono-PEGilada. Las composiciones de EPO producidas por los procedimientos de la invención pueden comprender al menos aproximadamente un 98 % de EPO mono-PEGilada. Las composiciones de EPO producidas por los procedimientos de la invención pueden comprender al menos aproximadamente un 99 % de EPO mono-PEGilada.
Son conocidos procedimientos para la determinación de la pureza para los expertos en la técnica. La pureza de una proteína no PEGilada, mono-PEGilada u oligo-PEGilada se puede determinar por cualquier procedimiento de análisis adecuado (por ejemplo, intensidad de banda en gel, ELISA, HPLC y similares). La determinación de pureza puede implicar usar una curva de calibración generada usando un material de referencia de pureza conocida. La pureza también se puede determinar en una base de peso a peso. La pureza de una proteína no PEGilada o PEGilada expresada en el presente documento en términos de porcentaje (%) se puede determinar, por ejemplo, usando valores de "área bajo la curva" relativos, que típicamente se pueden obtener para picos en un cromatograma, tal como un cromatograma de HPLC. Los procedimientos de determinación de pureza incluyen RP-HPLC y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
Cromatografía
El "punto isoeléctrico" o "pI" de una proteína es el pH al que la proteína tiene una carga total neta cero. Es decir, el pI de una proteína es el pH al que la proteína tiene un número igual de cargas positivas y negativas. La determinación del pI para cualquier proteína dada se puede realizar de acuerdo con técnicas bien establecidas, tales como enfoque isoeléctrico. El pI de EPO está en el intervalo de 4,0 a 5,5. Los procedimientos alternativos de medición de pI pueden dar valores ligeramente diferentes, por ejemplo, el enfoque isoeléctrico de microchip da un pI aparente de aproximadamente 3,5 - 4,0 (Vlckova 2008). El pI preciso de EPO puede depender, por ejemplo, del grado de glucosilación y residuos de ácido siálico, o de la existencia de variantes de carga, que a su vez pueden depender de los medios por los que se han producido (por ejemplo, células huésped usadas para expresión recombinante).
La cromatografía de intercambio iónico separa moléculas en base a diferencias en su carga superficial neta. Se puede usar para separar moléculas de proteína. En la cromatografía de intercambio iónico, una mezcla que incluye una proteína de interés puede pasar sobre un material de intercambio iónico, que lleva una carga. Cuando el material de intercambio iónico tiene una carga negativa, el procedimiento se denomina cromatografía de intercambio catiónico (CIC), y cuando tiene una carga positiva, el procedimiento se denomina cromatografía de intercambio aniónico (CIA). La proteína de interés se puede separar del resto de la mezcla manipulando las interacciones basadas en la carga entre la proteína y el material de intercambio iónico. Esto se realiza típicamente manipulando la fuerza iónica, o conductividad, de la mezcla y/o de los tampones que se pasan sobre el material de intercambio iónico.
El término cromatografía de intercambio iónico (CII) usado en el presente documento se puede referir a cromatografía de intercambio catiónico (CIC) o cromatografía de intercambio aniónico (CIA). Cuando un procedimiento implica múltiples etapas de CII, son todas etapas de CIA o bien todas etapas de CIC. Asimismo, la referencia a una solución de flujo continuo de CII o un material de CII se puede referir a una solución de flujo continuo de CIC o bien CIA, y a un material de CIC o bien CIA. Cuando un procedimiento implica una etapa de CII que es una etapa de CIA, todas las etapas de CII son etapas de CIA, los materiales de CII son materiales de CIA, la solución de flujo continuo de CII es una solución de flujo continuo de CIA, cualquier eluido de CII es un eluido de CIA. Cuando un procedimiento implica una etapa de CII que es una etapa de CIC, la etapa de CII es una etapa de CIC, los materiales de CII son un material de CIC, la solución de flujo continuo de CII es una solución de flujo continuo de CIC y cualquier eluido de CII es un eluido de CIC.
Por ejemplo, una mezcla que contiene una proteína de interés se puede cargar sobre un material de intercambio iónico. Las condiciones de carga (y condiciones de lavado, si se usan) se seleccionan para promover la unión de solo determinados componentes de la mezcla al material de intercambio iónico.
Por ejemplo, las condiciones de carga pueden promover la unión de la proteína de interés al material de intercambio iónico, y el material de intercambio iónico se puede lavar a continuación con un tampón de lavado para retirar los componentes no deseados de la mezcla (por ejemplo, contaminantes) y, finalmente la proteína de interés se puede eluir (retirar del material de intercambio iónico) incrementando la fuerza iónica (conductividad) del tampón. Este tipo de procedimiento es conocido como modo de "unión y elución", porque la proteína de interés se une al material de intercambio iónico y a continuación se eluye. La solución que sale de la matriz en la etapa de elución y contiene la proteína de interés se puede conocer como eluyente o eluido.
De forma alternativa, las condiciones de carga pueden promover la unión de componentes no deseados de la mezcla (por ejemplo, contaminantes). En este modo, la proteína de interés puede fluir a través de una matriz del material de intercambio iónico y recogerse. Este tipo de procedimiento es conocido como modo de "flujo continuo". La composición que se recoge después de fluir a través de una matriz de material de intercambio iónico es el "flujo continuo" o "solución de flujo continuo". La solución de flujo continuo que sale de la matriz y contiene la proteína de interés también se puede denominar "efluente". A diferencia del modo de "unión y elución", que implica un cambio en la conductividad y/o pH para eluir la proteína de interés de la columna, el modo de "flujo continuo" se lleva a cabo en condiciones isocráticas. La solución de flujo continuo se puede recoger como fracciones, que se pueden agrupar para proporcionar un agrupamiento de flujo continuo.
Las proteínas, tales como EPO, se componen de aminoácidos que incluyen residuos ácidos y básicos. A pH bajo (concentración de H+ alta), los grupos ácido carboxílico de las proteínas tienden a estar descargados (-COOH) y sus grupos básicos que contienen nitrógeno están totalmente cargados (-NH3+), dando a la mayoría de proteínas una carga positiva neta. A pH alto, los grupos ácido carboxílico están cargados negativamente (-COO-) y los grupos básicos tienden a estar descargados (-NH2), dando a la mayoría de proteínas una carga negativa neta.
El punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH al que esa proteína no tiene carga neta porque las cargas positivas y negativas se equilibran.
La cromatografía de intercambio iónico aprovecha el hecho de que la relación entre la carga superficial neta y el pH es única para una proteína en particular. A un pH por debajo de su punto isoeléctrico, una proteína tendrá una carga positiva global y se unirá por lo tanto a un material cargado negativamente (es decir, en CIC). A un pH por encima de su punto isoeléctrico, una proteína tendrá una carga negativa global y se unirá por lo tanto a un material cargado positivamente (es decir, en CIA).
Por este motivo en CIA se usan en general mezclas de proteínas (composiciones de carga) y tampones de lavado de un pH relativamente alto, para que la proteína de interés (o contaminante, por ejemplo, proteína no deseada) tenga una carga negativa neta y por lo tanto se una al material de intercambio aniónico cargado positivamente. Cuando una proteína de interés se une al material de intercambio aniónico, se puede lavar opcionalmente para retirar contaminantes y a continuación se puede eluir. Cuando un contaminante (tal como proteína no deseada) se une al material de intercambio aniónico, se retira de la mezcla, purificando de este modo una o más proteínas de interés en el flujo continuo.
Por este motivo en CIC se usan en general mezclas de proteínas y tampones de lavado de un pH relativamente bajo, para que la proteína de interés (o contaminante, por ejemplo, proteína no deseada) tenga una carga positiva neta y por lo tanto se una al material de intercambio catiónico cargado negativamente. Cuando una proteína de interés se une al material de intercambio catiónico, se puede lavar opcionalmente para retirar contaminantes y a continuación se puede eluir. Cuando un contaminante (tal como proteína no deseada) se une al material de intercambio catiónico, se retira de la mezcla, purificando de este modo una o más proteínas de interés en el flujo continuo.
La cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) separa moléculas en base a diferencias en su hidrofobia superficial. Se puede usar para separar moléculas de proteína. En CIH, una mezcla que incluye una proteína de interés se puede pasar por un material de CIH. La interacción entre proteínas y un material de CIH se altera por la presencia de determinadas sales. El incremento en la concentración de sal incrementa la interacción y la reducción en la concentración de sal reduce la interacción. Para la elución selectiva, la concentración de sal se puede reducir y los componentes de la mezcla se eluyen en orden de hidrofobia, eluyéndose, por último, los componentes más hidrófobos. La CIH se puede realizar en modo de flujo continuo o en modo de unión y elución como se describe para la cromatografía de intercambio iónico anteriormente.
Un "material" de cromatografía en el presente contexto, tal como un material de intercambio aniónico o un material de CIH, se refiere a la fase estacionaria o fase sólida. Esto también se puede denominar resina, matriz o medio. El "material" en este contexto proporciona una matriz a la que se puede unir un componente de una mezcla, tal como una proteína de interés. El material puede ser o puede comprender una columna, por ejemplo, una columna de lecho expandido o de lecho de relleno. El material puede estar en forma de partículas o microesferas discretas. El material puede estar en forma de membrana. En el presente contexto, la fase móvil fluye a través de la fase estacionaria y lleva consigo las sustancias que se van a separar por cromatografía. La fase móvil es una mezcla, tal como una primera o segunda mezcla, o una solución tal como una solución de flujo continuo. Un tampón, tal como un tampón de elución o tampón de lavado, también es una fase móvil.
En el presente contexto, el término "carga" se refiere a una etapa de poner en contacto una mezcla o composición sobre material de cromatografía. El material de cromatografía se puede equilibrar antes de la etapa de carga.
El equilibrado implica aplicar un tampón de equilibrado al material de cromatografía. El pH, fuerza iónica, conductividad y/o concentración de sal del tampón de equilibrado se seleccionan para garantizar que cuando una mezcla de proteínas se carga sobre la matriz de cromatografía, se logre la unión y/o flujo continuo o proteínas específicas o contaminantes deseados.
La elución de un material de cromatografía, tal como un material de intercambio aniónico o un material de intercambio catiónico o un material de interacción hidrófobo, se puede lograr cambiando la fuerza iónica, pH, conductividad o concentración de sal de un tampón usando elución por gradiente o elución por etapas. La elución por gradiente, o elución por gradiente lineal, se puede usar cuando muchos componentes de interés individual están unidos al material y se pueden eluir de forma diferente, y para una separación de alta resolución. La elución por etapas es útil para retirar un único componente (o retirar conjuntamente un grupo específico de componentes) de un material de cromatografía. La elución por etapas es relativamente rápida y consume menos tampón. La elución por etapas se puede usar para eluir una proteína de interés de un material de cromatografía en una forma relativamente concentrada. Un gradiente ascendente de fuerza iónica se usa comúnmente para la elución en CIA y en CIC. Un gradiente descendente de concentración de sal se usa comúnmente para la elución en CIH.
Producción de una composición de proteína mono-PEGilada
La presente invención proporciona un procedimiento para producir una composición de proteína mono-PEGilada. La presente invención proporciona un procedimiento para purificar proteína mono-PEGilada de una mezcla que comprende proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada.
En comparación con procedimientos de la técnica anterior que usan CIC para proporcionar una composición de proteína mono-PEGilada, los procedimientos divulgados en el presente documento son más productivos. Un procedimiento de la técnica anterior para la producción de EPO mono-PEGilada se describe en el documento WO 2009/010270.
La presente invención proporciona un procedimiento para producir una composición de proteína que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada (b) someter la primera mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio iónico (CII) para proporcionar una solución de flujo continuo de CII en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla; comprendiendo la etapa de CII aplicar la primera mezcla a un material de CII en condiciones adecuadas para unir proteína no PEGilada; (c) recoger la solución de flujo continuo de CII de la etapa b) para proporcionar una segunda mezcla que comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; y (d) someter la segunda mezcla a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) para proporcionar una composición de proteína en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, en la que la composición de proteína comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada. La etapa de CII puede ser una etapa de CIA o una etapa de CIC.
Por ejemplo, la presente invención proporciona un procedimiento para producir una composición de proteína que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento: (a) proporcionar una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada (b) someter la primera mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) para proporcionar una solución de flujo continuo de CIA en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla; comprendiendo la etapa de CIA aplicar la primera mezcla a un material de CIA en condiciones adecuadas para unir proteína no PEGilada; (c) recoger la solución de flujo continuo de CIA de la etapa b) para proporcionar una segunda mezcla que comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; y (d) someter la segunda mezcla a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) para proporcionar una composición de proteína en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, en la que la composición de proteína comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada. Las figuras 1 a 3 muestran modos de realización de procedimientos de acuerdo con la presente divulgación.
Proporcionar una primera mezcla
Los procedimientos de la invención comprenden proporcionar una primera mezcla (etapa a). Los procedimientos de la invención se realizan usando una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada. La primera mezcla comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. La proteína puede ser e Po .
Los procedimientos de la invención se realizan usando una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada, en la que la proporción de proteína oligo-PEGilada es relativamente baja. La primera mezcla puede comprender menos de aproximadamente un 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 % de proteína oligo-PEGilada, la proteína oligo-PEGilada puede ser EPO oligo-PEGilada. La primera mezcla puede comprender menos de aproximadamente un 10 % de proteína oligo-PEGilada. La primera mezcla puede comprender menos de aproximadamente un 10 % de EPO oligo-PEGilada.
La primera mezcla puede comprender al menos aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 70 % de proteína no PEGilada. La primera mezcla puede comprender aproximadamente un 20-70 %, 40-60 %, 45-55 % de proteína no PEGilada.
La primera mezcla puede comprender al menos aproximadamente un 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 70 % de proteína mono-PEGilada. La primera mezcla puede comprender aproximadamente un 30-70 %, 40-60 % o 45­ 55 % de proteína mono-PEGilada.
La primera mezcla puede comprender (A) proteína no PEGilada en el intervalo de un 40-60 %, y (B) proteína mono-PEGilada en el intervalo de un 40-60 %, y (C) proteína oligo-PEGilada en el intervalo de un 1-10 %, en la que el total de (A), (B) y (C) es de un 100 %. La primera mezcla puede comprender (A) proteína no PEGilada en el intervalo de un 45-55 %, y (B) proteína mono-PEGilada en el intervalo de un 45-55 %, y (C) proteína oligo-PEGilada en el intervalo de un 1-5 %, en la que el total de (A), (B) y (C) es de un 100 %.
La primera mezcla puede comprender (A) proteína no PEGilada y (B) proteína mono-PEGilada y (C) proteína oligo-PEGilada. La proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada pueden estar presentes en la proporción A:B:C, en la que A es de aproximadamente 40-60, B es de aproximadamente 30-50 y C es de aproximadamente 1-10; o en la que A es de aproximadamente 45-55, B es de aproximadamente 35-45 y C es de aproximadamente 1-10; o en la que A es de aproximadamente 35-55, B es de aproximadamente 35-45 y C es de aproximadamente 1-25. La proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada pueden estar presentes en la proporción (A+B):C en la que (A+B):C es de aproximadamente 19:1; de aproximadamente 9:1 o de aproximadamente 9-19:1.
La proporción puede ser una proporción en peso o en masa. La proporción puede ser una proporción molar.
La etapa de proporcionar una primera mezcla puede implicar realizar una reacción de PEGilación. Realizar una reacción de PEGilación implica hacer reaccionar la proteína (que puede ser la proteína no PEGilada) con un reactivo de PEGilación. La proteína puede ser EPO. La reacción de PEGilación se puede realizar como se describe anteriormente con respecto a la PEGilación de EPO. La reacción de PEGilación se puede realizar a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0, en el que la proporción molar PEG/proteína es de aproximadamente 0,6 - 1,0.
La reacción de PEGilación se puede realizar a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0, o de aproximadamente 7,5 a 8,5, o de aproximadamente 8,0. La reacción de PEGilación se puede realizar a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0, o de aproximadamente 7,5 a 8,5, o de aproximadamente 8,0 usando reactivo de PEG activado (NHS). El pH al que se realiza la reacción de PEGilación puede depender del reactivo de PEG usado. El reactivo de PEG puede ser mPEG-NHS, mPEG-SPA, mPEG-SVA o mPEG-CI. La relación entre tasas de reacción de PEGilación y pH se revisa en Pfister 2016. Otros reactivos para las reacciones de PEGilación son conocidos en la técnica. El pH de la reacción de PEGilación se puede seleccionar de modo que la mezcla resultante (la primera mezcla) se pueda cargar directamente sobre el material de CII, el pH de la reacción de PEGilación se puede seleccionar por lo tanto en base al pI de la proteína y el tipo de material de CII (CIA o CIC) que se va a usar.
La proporción molar PEG/proteína en la reacción de PEGilación puede ser de <1,0. La proporción molar PEG/proteína en la reacción de PEGilación puede ser de aproximadamente 0,8. La proporción molar PEG/proteína puede ser de aproximadamente 0,25 a 1,0, de 0,3 a 1,0, de 0,4 a 1,0, de 0,5 a 1,0, de 0,6 a 1,0 o de 0,7 a 1,0. La proporción molar PEG/proteína puede ser de aproximadamente 0,25 a 1,2, de 0,3 a 1,2, de 0,4 a 1,2, de 0,5 a 1,2, de 0,6 a 1,2 o de 0,7 a 1,2. La proporción molar PEG/proteína puede ser de aproximadamente 0,25 a 1,5, de 0,3 a 1,5, de 0,4 a 1,5, de 0,5 a 1,5, de 0,6 a 1,5 o de 0,7 a 1,5. La proporción molar PEG/proteína puede tener un límite inferior de aproximadamente 0,4, 0,5, 0,6 o 0,7 y puede tener un límite superior de 0,8. 0,9. 1,0. 1,1. 1,2. 1,3.
1,4. o 1,5.
Cromatografía de intercambio iónico
La primera mezcla se somete a una etapa de cromatografía de intercambio iónico (CIA) (etapa b). Esto proporciona una solución de flujo continuo de CII en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla. Esto proporciona una solución de flujo continuo de CII en la que la fracción de proteína no PEGilada se reduce con respecto a la primera mezcla. La etapa de CII puede ser una etapa de CIA o una etapa de CIC.
Cromatografía de intercambio aniónico
La primera mezcla se puede someter a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) (etapa b). Esto proporciona una solución de flujo continuo de CIA en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla. Esto proporciona una solución de flujo continuo de CIA en la que la fracción de proteína no PEGilada se reduce con respecto a la primera mezcla.
En el contexto de la presente divulgación, una fracción que se incrementa se puede incrementar en una cantidad de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. Una fracción que se incrementa se puede incrementar en al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces.
En el contexto de la presente divulgación, una fracción que disminuye puede disminuir en una cantidad de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. Una fracción que disminuye se puede incrementar en al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces.
Una etapa de CIA comprende poner en contacto la primera mezcla con un material de intercambio aniónico, o aplicar la primera mezcla a un material de intercambio aniónico. La etapa de CIA puede comprender cargar la primera mezcla sobre una columna que comprende un material de intercambio aniónico. El material de intercambio aniónico tiene una capacidad de unión baja a la proteína PEGilada, tal como EPO PEGilada. Es decir, el material de CIA tiene una capacidad de unión relativamente baja para la versión PEGilada de la especie de proteína para la que se desea una composición mono-PEGilada. Se usan condiciones de CIA que son adecuadas para la unión de la proteína no PEGilada al material de intercambio aniónico. La solución que fluye a través del material de intercambio aniónico es la solución de flujo continuo de CIA. La capacidad de unión baja del material de intercambio aniónico para proteína PEGilada tiene el efecto de que la mayoría de la proteína PEGilada fluye a través del material de intercambio aniónico y está presente por lo tanto en la solución de flujo continuo de CIA. Las condiciones de unión adecuadas para la unión de la proteína no PEGilada al material de intercambio aniónico tienen el efecto de que la mayoría de la proteína no PEGilada se retira (por unión al material de intercambio aniónico) y no está presente en la solución de flujo continuo.
El material de CIA puede ser un material que no se una significativamente a la proteína PEGilada. Esto puede querer decir que el material de CIA se une a menos de aproximadamente un 10 %, 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,01 % de la proteína PEGilada que se le aplica. La unión de la proteína PEGilada al material de intercambio aniónico también se puede reducir aplicando cantidades altas de proteína no PEGilada al material de intercambio aniónico. De esta manera, la proteína PEGilada unida se desplaza por proteína no PEGilada. La cantidad de proteína no PEGilada aplicada al material de intercambio aniónico puede ser de aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 % o 120 % de capacidad de ruptura dinámica del material de intercambio aniónico. La cantidad de proteína no PEGilada aplicada al material de intercambio aniónico puede estar en el intervalo de aproximadamente un 70-110 %, de aproximadamente un 80-100 % o de aproximadamente un 85-95 % de la capacidad de ruptura dinámica del material de intercambio aniónico. La cantidad de proteína no PEGilada aplicada al material de intercambio aniónico puede estar en el intervalo de aproximadamente un 80-95 % de la capacidad de ruptura dinámica del material de intercambio aniónico.
La solución de flujo continuo de CIA comprende proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada. La solución de flujo continuo de CIA también puede comprender proteína no PEGilada, en la que la proporción de proteína no PEGilada es relativamente baja o casi nula. La solución de flujo continuo de CIA puede contener cero proteína no PEGilada o cantidades de proteína no PEGilada por debajo del límite de detección. La proteína puede ser EPO. La solución de flujo continuo puede comprender menos de aproximadamente un 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1,5 %, 1,0 %, 0,5 % o 0,1 % de proteína no PEGilada. La solución de flujo continuo puede comprender menos de aproximadamente un 2 % de proteína no PEGilada. La solución de flujo continuo puede comprender menos de aproximadamente un 2 % de EPO no PEGilada.
La solución de flujo continuo de CIA puede comprender al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o al menos aproximadamente un 99,9 % de proteína PEGilada.
El flujo continuo de CIA puede comprender aproximadamente un 80 % de proteína mono-PEGilada y aproximadamente un 20 % de proteína oligo-PEGilada. La solución de flujo continuo de CIA puede comprender al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de proteína mono-PEGilada. La solución de flujo continuo puede comprender aproximadamente un 60-90 %, 70-90 % o 75-85 % de proteína mono-PEGilada. La solución de flujo continuo de CIA puede comprender al menos aproximadamente un 20 %, 25 %, 30 %, 35 % o 40 % de proteína oligo-PEGilada. La solución de flujo continuo puede comprender aproximadamente un 10-40 %, 10-30 % o 15-25 % de proteína oligo-PEGilada.
La solución de flujo continuo de CIA puede comprender (A) proteína no PEGilada en el intervalo de un 0,1-5 %, y (B) proteína mono-PEGilada en el intervalo de un 60-90 %, y (C) proteína oligo-PEGilada en el intervalo de un 10­ 40 %, en la que el total de (A), (B) y (C) es de un 100 %. La solución de flujo continuo puede comprender (A) proteína no PEGilada en el intervalo de un 0,1-1,5 %, y (B) proteína mono-PEGilada en el intervalo de un 75-85 %, y (C) proteína oligo-PEGilada en el intervalo de un 15 %-25 %, en la que el total de (A), (B) y (C) es de un 100 %.
La solución de flujo continuo de CIA puede comprender (A) proteína no PEGilada y (B) proteína mono-PEGilada y (C) proteína oligo-PEGilada. La proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada pueden estar presentes en la proporción A : B : C, en la que A es aproximadamente 1-5, B es aproximadamente 10-20 y C es aproximadamente 5-15; o en la que A es aproximadamente 1-3, B es aproximadamente 25-35 y C es aproximadamente 5-10. La proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada pueden estar presentes en la proporción A:(B+C) en la que A:(B+C) es de aproximadamente 1:25; 1:50; 1:100; de aproximadamente 1:150, de aproximadamente 1:200 o de aproximadamente 1:100-200. La proporción puede ser una proporción en peso o en masa. La proporción puede ser una proporción molar.
La etapa de CIA se realiza en condiciones adecuadas para que la proteína no PEGilada se una al material de CIA. Las condiciones adecuadas para la unión de proteína no PEGilada se pueden determinar empíricamente cribando uno o más del material de CIA, o el pH, conductividad, contenido de sal o el contenido de tampón del tampón de equilibrado.
Los grupos funcionales en un material de intercambio iónico determinan su carga. Los términos "fuerte" y "débil" en este contexto se refieren a la medida en que el estado de ionización de los grupos funcionales varía con la variación del pH. Los intercambiadores de iones fuertes muestran poca o ninguna variación en la capacidad de intercambio iónico con el cambio en el pH. Los intercambiadores de iones fuertes permanecen totalmente cargados en un amplio intervalo de pH. Los intercambiadores de iones débiles muestran una función dependiente del pH y suministran una realización óptima sobre un intervalo de pH más estrecho.
Los materiales de intercambio aniónico fuerte pueden incluir un grupo amonio cuaternario (Q) o un grupo aminoetilo cuaternario (QAE). Un material de intercambio aniónico débil puede incluir residuos de dietilaminoetilo (DEAE). Una ventaja de uso de materiales de intercambio aniónico fuerte es que la capacidad de unión se mantiene a pH alto o bajo puesto que no existe pérdida de carga.
Los materiales de CIA pueden comprender una resina que se ha funcionalizado con un grupo funcional o ligando cargado positivamente, es decir, con un grupo funcional o ligando básico.
El material de intercambio aniónico usado en los procedimientos de la invención puede ser un material de intercambio aniónico fuerte. El material de intercambio aniónico es preferentemente un material de intercambio aniónico fuerte. Puede tener un grupo amonio cuaternario (Q). Puede ser una perla de polímero polimetacrílico hidroxilado funcionalizado con grupos Q. Puede tener un tamaño de poro de 50-150 nm, 70-120 nm, 70-100 nm o 90-110 nm. El tamaño de poro en el presente documento se puede referir a tamaño de poro medio. Puede tener un tamaño de partícula de 40-150 |jm, 40-120 |jm, 40-100 |jm, 40-80 |jm, o de aproximadamente 60, 65, 70, 80 o 90 100 jim. El tamaño de partícula (o tamaño de perla) se puede referir a tamaño de partícula medio. Puede tener un tamaño de poro de 70-100 nm y un tamaño de perla de 35-100 jim. Puede tener un tamaño de poro de 100 nm y un tamaño de perla de 65 jim. Puede ser Toyopearl Super Q 650M (Tosoh Bioscience LLC; número de producto 43205). El material de intercambio aniónico usado en los procedimientos de la invención se puede usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El material de intercambio aniónico usado en los procedimientos de la invención puede ser un material de intercambio aniónico débil. Puede tener grupos funcionales amina terciaria y/o secundaria. Puede no tener grupos funcionales amina primaria. Puede tener solo un tipo de grupo amina o puede tener dos o más tipos de grupo amina.
El material de intercambio aniónico puede ser o puede comprender una columna, por ejemplo, una columna de lecho expandido o de lecho de relleno. El material de intercambio aniónico puede ser o puede comprender un sistema de cromatografía tangencial en contracorriente continuo. El material de intercambio aniónico puede estar en forma de partículas discretas o perlas. El material de intercambio aniónico puede estar en forma de membrana. El material de intercambio aniónico puede estar en forma de filtro funcionalizado o fibra, vellón o malla funcionalizados. El material de intercambio aniónico puede estar en forma de cualquier otro soporte sólido que puede transportar grupos funcionales o presentar propiedades de intercambio aniónico.
Los ejemplos de intercambiadores de aniones incluyen Toyopearl Super Q 650C, Toyopearl Super Q 650S, Toyopearl GigaCap Q 650M, GigaCap Q 650S, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl DEAE 650S, Toyopearl DEAE 650m and Toyopearl DEAE 650C, Toyopearl Super Q 650, Toyopearl Super Q 650 QAE, Toyopearl Super Q 550C, Macroprep High Q, Fractoprep TMAE, Q Hyper DF, Capto Q, Q-Sepharose FF, Q-Sepharose BB, Q-Sepharose XL, Q-Sepharose HP, MiniQ, MonoQ, MonoP, DEAE Sepharose FF, Source SQ, Source 30Q, ANX Sepharose 4 FF (high sub), Streamline DEAE, Streamline QXL, Poros HQ, Poros PI, Poros D, DEAEHyperD, Q Ceramic Hyper D, Fractogel DMAE.
El material de CIA en los procedimientos de la invención puede ser un material de intercambio aniónico que tiene una capacidad de unión baja para la forma PEGilada de la proteína. En particular, puede ser un material de intercambio aniónico que tiene una capacidad de unión baja para EPO PEGilada. El material de intercambio aniónico puede ser Toyopearl Super Q 650 M que tiene capacidad de unión baja para EPO PEGilada, por ejemplo, una capacidad de unión de menos de aproximadamente 0,5 g/l, 0,05 g/l, 0,01 g/l o 0,001 g/l, o de casi 0 g/l. El material de intercambio aniónico puede ser un material de intercambio aniónico que tiene sustancialmente la misma capacidad de unión para EPO PEGilada que Toyopearl Super Q 650 M equilibrado con bicina 25 mM, Na2SO4 7,5 mM, a pH 8,0.
El material de CIA puede tener una capacidad de unión relativamente alta para proteína no PEGilada, por ejemplo, EPO no PEGilada, de 20 - 50 g/l, 30 - 40 g/l o de aproximadamente 35 g/l. El material de CIA puede tener una capacidad de unión para proteína no PEGilada, por ejemplo, EPO no PEGilada, de al menos aproximadamente 35 g/l.
Un material de intercambio aniónico se puede equilibrar antes de aplicarle la primera mezcla. Un tampón de equilibrado de CIA puede comprender una sal tal como Na2SO4 y/o bicina. Un tampón de equilibrado de CIA puede comprender una sal de fosfato. Un tampón de equilibrado de CIA puede no comprender compuestos que tengan grupos amina primaria, por ejemplo, tris(hidroximetil)aminometano (Tris). Un tampón de equilibrado de CIA puede tener un pH de aproximadamente 6,5 a 9,5, de 7,0 a 9,0, de 7,5 a 8,5 u 8,0. Un tampón de equilibrado de CIA puede comprender bicina aproximadamente 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM o bicina aproximadamente 25 mM. Un tampón de equilibrado de CIA puede comprender sal aproximadamente 1-20 mM, 1-10 mM, 2,5-10 mM, 5­ 10 mM o sal aproximadamente 7,5 mM. Un tampón de equilibrado para su uso en CIA puede comprender bicina aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 7,5 mM, pH 8,0. Un tampón de equilibrado puede tener una conductividad de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 mS/cm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mS/cm, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3,0 mS/cm, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0 mS/cm, o de aproximadamente 1,0 a 3,0 mS/cm. Si la primera mezcla tiene una conductividad fuera del intervalo de conductividad del tampón de equilibrado, a continuación se puede acondicionar (por ejemplo, por la adición de sal y/o tampón) para proporcionar una primera mezcla que tiene una conductividad que está dentro del intervalo de conductividad del tampón de equilibrado, o está dentro de 0,5 mS/cm o 0,05 mS/cm del tampón de equilibrado.
La primera mezcla, que comprende proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada, se puede acondicionar para proporcionar una primera mezcla que tiene los valores de pH, tampón y sal establecidos anteriormente para el tampón de equilibrado. Una primera mezcla acondicionada también se puede denominar solución de carga o composición de carga de CIA. Una solución de carga de CIA puede ser una solución acuosa de proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada en bicina aproximadamente 10-30 mM, Na2SO4 aproximadamente 5,0 - 10,0 mM, pH 7,0 - 9,0. Una solución de carga de CIA puede ser una solución acuosa de proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada en bicina aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 7,5 mM, pH 8,0.
La etapa de CIA se puede realizar a un pH de al menos 1,0 a 2,0 unidades de pH por encima del pI de la proteína. Muchas proteínas tienen un pI en el intervalo de 5,5 a 7,5 y por lo tanto los procedimientos de la invención se pueden usar para producir una proteína mono-PEGilada en los que la etapa de CIA se realiza a pH de aproximadamente 6,5 a 9,5, o de 6,5 a 8,5, o de 7,5 a 8.5.
El pI de EPO está en el intervalo de 4,0 a 5,5. Los procedimientos en los que la proteína es EPO se pueden realizar al menos 2,0, 2,5 o 3,0 unidades de pH por encima del pI de la proteína. Esto permite la unión de EPO eficaz al material de CIA. Los procedimientos para producir una composición de EPO mono-PEGilada pueden implicar una etapa de CIA realizada a un pH de al menos aproximadamente 7,0, o aproximadamente pH de 7,0 a 10,0, o pH de 7,0 a 9,0. El pH puede ser de aproximadamente 7,5 a 8,5, o de aproximadamente 7,8 a 8,2, o de aproximadamente 8,0.
La etapa de CIA se puede realizar a una conductividad de aproximadamente 1,0 - 3,0 mS/cm, 1,5 - 2,5 mS/cm o de aproximadamente 2,2 mS/cm. La conductividad de la etapa de CIA se puede ajustar ajustando la concentración de una sal, tal como NaCl o Na2SO4 en el tampón de equilibrado de CIA o el tampón de lavado de CIA. La etapa de CIA se puede realizar a una concentración de Na2SO4 de aproximadamente 5,0 - 15 mM, 5,0 - 10 mM, o de aproximadamente 7,5 mM. La etapa de CIA se puede realizar usando otras sales, a concentraciones que proporcionan fuerzas iónicas equivalentes a las mencionadas aquí para Na2SO4.
Después de que se haya aplicado la primera mezcla, o solución de carga de CIA, al material de CIA, se puede lavar el material de CIA. El material de CIA se puede lavar con tampón de equilibrado. El material de CIA se puede lavar con un tampón de lavado. un tampón de lavado puede comprender bicina aproximadamente 10-40 mM, 15­ 35 mM, 20-30 mM o bicina aproximadamente 25 mM. Un tampón de lavado puede comprender sal aproximadamente 1-20 mM, 1-10 mM, 2,5-10 mM, 5-10 mM o sal aproximadamente 7,5 mM. Puede comprender bicina aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 7,5 mM, pH 8,0. Un tampón de lavado puede tener una conductividad de aproximadamente 1 a aproximadamente 8 mS/cm, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mS/cm, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 3,0 mS/cm, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0 mS/cm. El material de CIA se puede lavar con de 1 a 10, de 1 a 5 o aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrado o tampón de lavado. El material de CIA se puede lavar con un volumen de tampón de equilibrado o tampón de lavado que se determina siguiendo el contenido en proteína de la solución de flujo continuo (por ejemplo, por espectrometría UV) y deteniendo el procedimiento de lavado una vez que el contenido en proteína está por debajo de un valor de referencia (por ejemplo, cuando la señal UV vuelve al valor de referencia). La solución de flujo continuo, o efluente, se puede recoger como fracciones, y algunas o todas de esas estas fracciones de flujo continuo se pueden agrupar.
Los procedimientos que implican cromatografía de intercambio aniónico son en particular preferentes para la producción de EPO mono-PEGilada porque permiten el uso de condiciones de pH relativamente alto a las que la EPO es relativamente estable.
El procedimiento de la invención puede comprender una etapa de CIA en el que el material de CIA es Toyopearl Super Q 650 M; la etapa de CIA se realiza a pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; la etapa de CIA se realiza a una conductividad de aproximadamente 1,0 a 3,0 mS/cm; y la primera mezcla se aplica al material de CIA como una solución de carga de CIA que comprende bicina aproximadamente 10 - 30 mM y Na2SO4 aproximadamente 1 -10 mM. La proteína puede ser eritropoyetina.
Cromatografía de intercambio catiónico
La etapa de CII puede ser una etapa de CIC. La primera mezcla se puede someter a una etapa de cromatografía de intercambio catiónico (CIC) (etapa b). Esto proporciona una solución de flujo continuo de CIC en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla. Esto proporciona una solución de flujo continuo de CIC en la que la fracción de proteína no PEGilada se reduce con respecto a la primera mezcla.
En el contexto de la presente divulgación, una fracción que se incrementa se puede incrementar en una cantidad de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. Una fracción que se incrementa se puede incrementar en al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces.
En el contexto de la presente divulgación, una fracción que disminuye puede disminuir en una cantidad de al menos aproximadamente un 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. Una fracción que disminuye se puede incrementar en al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces.
Una etapa de CIC comprende poner en contacto la primera mezcla con un material de intercambio catiónico, o aplicar la primera mezcla a un material de intercambio catiónico. La etapa de CIC puede comprender cargar la primera mezcla sobre una columna que comprende un material de intercambio catiónico. El material de intercambio catiónico tiene una capacidad de unión baja a la proteína PEGilada, tal como EPO PEGilada. Es decir, el material de CIC tiene una capacidad de unión relativamente baja para la versión PEGilada de la especie de proteína para la que se desea una composición mono-PEGilada. Se usan condiciones de CIC que son adecuadas para la unión de la proteína no PEGilada al material de intercambio aniónico. La solución que fluye a través del material de intercambio catiónico es la solución de flujo continuo de CIC. La capacidad de unión baja del material de intercambio catiónico para proteína PEGilada tiene el efecto de que la mayoría de la proteína PEGilada fluye a través del material de intercambio catiónico y está presente por lo tanto en la solución de flujo continuo de CIC. Las condiciones de unión adecuadas para la unión de la proteína no PEGilada al material de intercambio catiónico tienen el efecto de que la mayoría de la proteína no PEGilada se retira (por unión al material de intercambio catiónico) y no está presente en la solución de flujo continuo.
El material de CIC puede ser un material que no se una significativamente a la proteína PEGilada. Esto puede querer decir que el material de CIC se une a menos de aproximadamente un 10 %, 5 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % o 0,01 % de la proteína PEGilada que se le aplica. La unión de la proteína PEGilada al material de intercambio catiónico también se puede reducir aplicando cantidades altas de proteína no PEGilada al material de intercambio catiónico. De esta manera, la proteína PEGilada unida se desplaza por proteína no PEGilada. La cantidad de proteína no PEGilada aplicada al material de intercambio catiónico puede ser de aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 % o 120 % de capacidad de ruptura dinámica del material de intercambio catiónico. La cantidad de proteína no PEGilada aplicada al material de intercambio catiónico puede estar en el intervalo de aproximadamente un 70-110 %, de aproximadamente un 80-100 % o de aproximadamente un 85-95 % de la capacidad de ruptura dinámica del material de intercambio catiónico. La cantidad de proteína no PEGilada aplicada al material de intercambio catiónico puede estar en el intervalo de aproximadamente un 80­ 95 % de la capacidad de ruptura dinámica del material de intercambio catiónico.
La solución de flujo continuo de CIC comprende proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada. La solución de flujo continuo de CIC también puede comprender proteína no PEGilada, en la que la proporción de proteína no PEGilada es relativamente baja o casi nula. La solución de flujo continuo de CIC puede contener cero proteína no PEGilada o cantidades de proteína no PEGilada por debajo del límite de detección. La proteína puede ser EPO. La solución de flujo continuo puede comprender menos de aproximadamente un 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1,5 %, 1,0 %, 0,5 % o 0,1 % de proteína no PEGilada. La solución de flujo continuo puede comprender menos de aproximadamente un 2 % de proteína no PEGilada. La solución de flujo continuo puede comprender menos de aproximadamente un 2 % de EPO no PEGilada.
La solución de flujo continuo de CIC puede comprender al menos aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o al menos aproximadamente un 99,9 % de proteína PEGilada.
El flujo continuo de CIC puede comprender aproximadamente un 80 % de proteína mono-PEGilada y aproximadamente un 20 % de proteína oligo-PEGilada. La solución de flujo continuo de CIC puede comprender al menos aproximadamente un 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de proteína mono-PEGilada. La solución de flujo continuo puede comprender aproximadamente un 60-90 %, 70-90 % o 75-85 % de proteína mono-PEGilada. La solución de flujo continuo de CIC puede comprender al menos aproximadamente un 20 %, 25 %, 30 %, 35 % o 40 % de proteína oligo-PEGilada. La solución de flujo continuo puede comprender aproximadamente un 10-40 %, 10-30 % o 15-25 % de proteína oligo-PEGilada.
La solución de flujo continuo de CIC puede comprender (A) proteína no PEGilada en el intervalo de un 0,1-5 %, y (B) proteína mono-PEGilada en el intervalo de un 60-90 %, y (C) proteína oligo-PEGilada en el intervalo de un 10­ 40 %, en la que el total de (A), (B) y (C) es de un 100 %. La solución de flujo continuo puede comprender (A) proteína no PEGilada en el intervalo de un 0,1-1,5 %, y (B) proteína mono-PEGilada en el intervalo de un 75-85 %, y (C) proteína oligo-PEGilada en el intervalo de un 15 %-25 %, en la que el total de (A), (B) y (C) es de un 100 %.
La solución de flujo continuo de CIC puede comprender (A) proteína no PEGilada y (B) proteína mono-PEGilada y (C) proteína oligo-PEGilada. La proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada pueden estar presentes en la proporción A : B : C, en la que A es aproximadamente 1-5, B es aproximadamente 10-20 y C es aproximadamente 5-15; o en la que A es aproximadamente 1-3, B es aproximadamente 25-35 y C es aproximadamente 5-10. La proteína no PEGilada, proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada pueden estar presentes en la proporción A:(B+C) en la que A:(B+C) es de aproximadamente 1:25; 1:50; 1:100; de aproximadamente 1:150, de aproximadamente 1:200 o de aproximadamente 1:100-200. La proporción puede ser una proporción en peso o en masa. La proporción puede ser una proporción molar.
La etapa de CIC se realiza en condiciones adecuadas para que la proteína no PEGilada se una al material de CIC. Las condiciones adecuadas para la unión de proteína no PEGilada se pueden determinar empíricamente cribando uno o más del material de CIC, o el pH, conductividad, contenido de sal o el contenido de tampón del tampón de equilibrado.
Los grupos funcionales en un material de intercambio iónico determinan su carga. Los términos "fuerte" y "débil" en este contexto se refieren a la medida en que el estado de ionización de los grupos funcionales varía con la variación del pH. Los intercambiadores de iones fuertes muestran poca o ninguna variación en la capacidad de intercambio iónico con el cambio en el pH. Los intercambiadores de iones fuertes permanecen totalmente cargados en un amplio intervalo de pH. Los intercambiadores de iones débiles muestran una función dependiente del pH y suministran una realización óptima sobre un intervalo de pH más estrecho.
Los materiales de intercambio catiónico fuerte pueden incluir un grupo ácido sulfónico. Un material de intercambio catiónico débil puede incluir grupos funcionales ácido carboxílico o fosfónico. Una ventaja de uso de materiales de intercambio catiónico fuerte es que la capacidad de unión se mantiene a pH alto o bajo puesto que no existe pérdida de carga.
Los materiales de CIC pueden comprender una resina que se ha funcionalizado con un grupo funcional o ligando cargado negativamente, es decir, con un grupo funcional o ligando ácido.
Los materiales de CIC incluyen materiales POROS HS, materiales Fractogel S, materiales Fractogel EMD SO3-(S), Fractogel EMD SO3-(M), Fractogel SMD SE HiCap (M), Fractogel EMD COO-(M) y Capto S.
El material de intercambio catiónico usado en los procedimientos de la invención puede ser un material de intercambio catiónico fuerte. Puede tener un tamaño de poro de 50-150 nm, 70-120 nm, 70-100 nm o 90-110 nm. El tamaño de poro en el presente documento se puede referir a tamaño de poro medio. Puede tener un tamaño de partícula de 40-150 |jm, 40-120 |jm, 40-100 |jm, 40-80 |jm, o de aproximadamente 60, 65, 70, 80 o 90 100 |jm. El tamaño de partícula (o tamaño de perla) se puede referir a tamaño de partícula medio. Puede tener un tamaño de poro de 70-100 nm y un tamaño de perla de 35-100 jim. Puede tener un tamaño de poro de 100 nm y un tamaño de perla de 65 jim. Puede ser SP Toyopearl 650 M.
El material de intercambio catiónico puede ser o puede comprender una columna, por ejemplo, una columna de lecho expandido o de lecho de relleno. El material de intercambio catiónico puede ser o puede comprender un sistema de cromatografía tangencial en contracorriente continuo. El material de intercambio catiónico puede estar en forma de partículas discretas o perlas. El material de intercambio catiónico puede estar en forma de membrana. El material de intercambio catiónico puede estar en forma de filtro funcionalizado o fibra, vellón o malla funcionalizados. El material de intercambio aniónico puede estar en forma de cualquier otro soporte sólido que puede transportar grupos funcionales o presentar propiedades de intercambio aniónico.
El material de CIC en los procedimientos de la invención puede ser un material de intercambio catiónico que tiene una capacidad de unión baja para la forma PEGilada de la proteína. En particular, puede ser un material de intercambio catiónico que tiene una capacidad de unión baja para EPO PEGilada. El material de intercambio catiónico puede ser SP Toyopearl 650 M que tiene capacidad de unión baja para EPO PEGilada, por ejemplo, una capacidad de unión de menos de aproximadamente 0,5 g/l, 0,05 g/l, 0,01 g/l o 0,001 g/l, o de casi 0 g/l.
El material de CIC puede tener una capacidad de unión relativamente alta para proteína no PEGilada, por ejemplo, EPO no PEGilada, de 20 - 50 g/l, 30 - 40 g/l o de aproximadamente 35 g/l. El material de CIC puede tener una capacidad de unión para proteína no PEGilada, por ejemplo, EPO no PEGilada, de al menos aproximadamente 35 g/l. Proporcionar una segunda mezcla
Como se describe anteriormente, los procedimientos de la invención implican someter una primera mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) (etapa b). El flujo continuo de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico se usa para proporcionar una segunda mezcla (etapa c). Por ejemplo, la segunda mezcla puede comprender el flujo continuo recogido de una o más etapas de CIA. La etapa de proporcionar una segunda mezcla puede comprender proporcionar un lote de la segunda mezcla a un aparato de CIH (por ejemplo, una columna de CIH). De forma alternativa, la etapa de proporcionar una segunda mezcla puede comprender proporcionar el flujo continuo a un aparato de CIH (por ejemplo, una columna de CIH) por medio de una conexión en línea.
La etapa de proporcionar una segunda mezcla (etapa c) comprende recoger la solución de flujo continuo de la etapa de CIA. La etapa de proporcionar una segunda mezcla puede comprender agrupar la solución de flujo continuo de dos, tres, cuatro o cinco etapas de CIA, o más de tres etapas de CIA. La etapa de proporcionar una segunda mezcla puede comprender acondicionar la segunda mezcla. Acondicionar la segunda mezcla puede proporcionar una segunda mezcla acondicionada que tiene una mejora en la idoneidad para separar la proteína mono-PEGilada de la proteína oligo-PEGilada contenida en la misma por CIH. Una segunda mezcla acondicionada se puede denominar solución de carga o composición de carga de CIH. Acondicionar la segunda mezcla puede comprender adición de sal y/o adición de bicina. Es decir, la etapa (c) puede comprender recoger la solución de flujo continuo de CIA de la etapa (b) y acondicionarla por la adición de sal y/o bicina para proporcionar una segunda mezcla que comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada. Recoger la solución de flujo continuo de CIA puede implicar recoger fracciones o lotes de solución de flujo continuo de CIA, que se pueden agrupar. Recoger la solución de flujo continuo de CIA puede implicar el suministro directo o flujo continuo de solución de flujo continuo de CIA con acondicionamiento en línea para proporcionar una segunda mezcla al material de CIH. Puede existir un mecanismo, tal como una línea de alimentación, que conecta un módulo que contiene la solución de flujo continuo de CIA a un módulo que contiene el material de CIH.
Cromatografía de interacción hidrófoba
Los materiales de CIH pueden comprender una resina que se ha funcionalizado con un ligando hidrófobo. Los ligandos hidrófobos en materiales de CIH pueden interactuar con superficies hidrófobas de proteínas. El ligando y el grado de sustitución ("sus.", sustitución, alta o baja) en un material de CIH pueden contribuir a su hidrofobia final y, de este modo, a su selectividad. El ligando puede contener grupos alquilo o arilo. La hidrofobia de los materiales de CIH se incrementa a través de la serie de ligandos: éter, polipropilenglicol (PPG), fenilo, butilo y hexilo.
El material de CIH usado en los procedimientos de la invención puede comprender un ligando fenilo. Puede comprender una resina metacrílica funcionalizada con un ligando de fenilo. Puede ser una perla de polímero polimetacrílico hidroxilado funcionalizado con un ligando fenilo. Puede tener un tamaño de poro de 50-150 nm, 70­ 120 nm, 70-100 nm, 90-110 nm. Puede tener un tamaño de partícula de 40-150 |jm, 40-120 |jm, 40-100 |jm, 40­ 80 jim, o de aproximadamente 60, 65, 70, 80 o 90 100 jim. Puede tener un tamaño de poro de 70-100 nm y un tamaño de perla de 30-65 jim. Puede tener un tamaño de poro de 100 nm y un tamaño de perla de 65 jim. Puede ser Toyopearl Phenyl 650M (Tosoh Bioscience LLC; número de producto 14478). El material de CIH usado en los procedimientos de la invención se puede usar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El material de CIH puede ser o puede comprender una columna, por ejemplo, una columna de lecho expandido o de lecho de relleno. El material de CIH puede estar en forma de material monolítico poroso. El material de CIH puede estar en forma de fibra, vellón o malla funcionalizados. El material de CIH puede estar en forma de cualquier otro soporte sólido que puede transportar grupos funcionales o presentar propiedades de CIH.
Los materiales de CIH incluyen Toyopearl Phenyl 650M, Toyopearl Phenyl 650S, Toyopearl PPG 600M, TSKgel Phenyl 5PW, Butyl Sepharose 4 FF, Butyl-S Sepharose FF, Octyl Sepharose 4 FF, Phenyl Sepharose BB, Phenyl Sepharose HP, Phenyl Sepharose 6 FF High Sub, Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub, Source I SETH, Source 151 SO, Source 1 SPHE, Phenyl Sepharose BB, Phenyl Sepharose HP, Phenyl Sepharose 6 FF High Sub, Phenyl Sepharose 6 FF Low Sub, Source I SETH, Source 151 SO, Source 1 s Ph E, Cellufine Butyl, Cellufine Octyl, Cellufine Phenyl, WP Hl-Propyl (C3), Macroprep t-Butyl, Macroprep Methyl.
El procedimiento de la invención puede comprender una etapa de CIH en modo de flujo continuo. En el modo de flujo continuo, la segunda mezcla se aplica a un material de CIH en condiciones adecuadas para que la proteína mono-PEGilada fluya a través del material de CIH y esté presente por lo tanto en la solución de flujo continuo de CIH. Las condiciones son adecuadas para que la proteína oligo-PEGilada se una al material de CIH.
El procedimiento de la invención puede comprender una etapa de CIH en el modo de unión y elución. En el modo de unión y elución, la segunda mezcla se aplica a un material de CIH en condiciones adecuadas para que la proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada se unan al material de CIH. La proteína mono-PEGilada se eluye del material de CIH. Se usa un gradiente de sal decreciente para eluir la proteína mono-PEGilada. La proteína oligo-PEGilada se eluye a una concentración de sal menor y por lo tanto en una fracción separada de la proteína mono-PEGilada.
Un material de CIH se puede equilibrar antes de que la segunda mezcla, o solución de carga de CIH, se cargue sobre el mismo. Un tampón de equilibrado de CIH puede comprender una sal tal como Na2SO4 y/o bicina. Un tampón de equilibrado de CIH puede tener un pH de aproximadamente 6,5 a 9,0, de 7,5 a 8,5 u 8,0. Un tampón de equilibrado de CIH puede comprender bicina aproximadamente 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM o bicina aproximadamente 25 mM. Un tampón de equilibrado CIH puede comprender bicina aproximadamente 10-40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM o NaPO4 aproximadamente 25 mM.
Las condiciones adecuadas para que la proteína mono-PEGilada fluya a través del material de CIH mientras la proteína oligo-PEGilada se une al material de CIH se pueden determinar fácilmente. El pH, fuerza iónica, y composición del tampón de equilibrado se puede seleccionar para garantizar que cuando una mezcla de proteínas se carga sobre la matriz de cromatografía, se logre la unión y/o flujo continuo o proteínas específicas o contaminantes deseados. Por ejemplo, el pH, fuerza iónica y composición del tampón de equilibrado se pueden seleccionar para garantizar que la proteína mono-PEGilada fluya a través del material de CIH mientras que la proteína oligo-PEGilada se une al material de CIH.
Para el equilibrado antes de que se lleve a cabo una etapa de CIH en modo de flujo continuo, un tampón de equilibrado puede comprender sal aproximadamente 200-500 mM, 250-450 mM, 300-450 mM, 300-400 mM, 350­ 400 mM o sal aproximadamente 390 mM o sal aproximadamente 300 mM. Un tampón de equilibrado para su uso en CIH en modo de flujo continuo puede comprender bicina aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 390 mM, pH 8,0. Un tampón de equilibrado para su uso en CIH en modo de flujo continuo puede comprender bicina aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 300 mM, pH 8,0. Un tampón de equilibrado para su uso en CIH en modo de flujo continuo puede comprender NaPO4 aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 300 mM, pH 8,0. Un tampón de equilibrado para su uso en CIH en modo de flujo continuo puede tener una conductividad de aproximadamente 30-70 mS/cm, 40-60 mS/cm o de aproximadamente 50 mS/cm.
Cuando el procedimiento comprende una etapa de CIH en modo de flujo continuo, el procedimiento puede implicar proporcionar una segunda mezcla acondicionada que comprende sal (tal como Na2SO4) y bicina, que puede estar presente como Na2SO4 aproximadamente 300 mM y bicina aproximadamente 25 mM, o que puede estar presente como Na2SO4 aproximadamente 390 mM y bicina aproximadamente 25 mM. Una segunda mezcla acondicionada se puede denominar solución de carga de CIH. Una segunda mezcla acondicionada para su uso en CIH en modo de flujo continuo puede comprender sal aproximadamente 200-500 mM, 250-450 mM, 250-350 mM, o sal aproximadamente 300 mM, o sal aproximadamente 350-450 mM, o sal aproximadamente 390 mM. La sal puede ser Na2SO4. Una segunda mezcla acondicionada puede comprender bicina aproximadamente 10-40 mM, 15­ 35 mM, 20-30 mM o bicina aproximadamente 25 mM. Una segunda mezcla acondicionada puede comprender Na2SO4 aproximadamente 300 mM y bicina aproximadamente 25 mM.
En el modo de flujo continuo de CIH, después de que se haya aplicado la segunda mezcla al material de CIH se puede lavar el material de CIH. El material de CIH se puede lavar con tampón de equilibrado que sea adecuado para su uso en modo de flujo continuo. El material de CIH se puede lavar con un tampón de lavado de CIH, que puede comprender sal aproximadamente 200-500 mM, 250-450 mM, 300-450 mM, 300-400 mM, 350-400 mM, o sal aproximadamente 390 mM, o sal aproximadamente 300 mM. Un tampón de lavado para su uso en CIH en modo de flujo continuo puede comprender bicina aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 390 mM, pH 8,0. Un tampón de lavado para su uso en CIH en modo de flujo continuo puede comprender bicina aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 300 mM, pH 8,0. El material de c Ih se puede lavar con de 1 a 10, de 1 a 5 o aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 volúmenes de columna de tampón. El material de CIH se puede lavar con un volumen de tampón de equilibrado o tampón de lavado que se determina siguiendo el contenido en proteína de la solución de flujo continuo (por ejemplo, por espectrometría UV) y deteniendo el procedimiento de lavado una vez que el contenido en proteína está por debajo de un valor de referencia (por ejemplo, cuando la señal UV vuelve al valor de referencia). La solución de flujo continuo, o efluente, se puede recoger como fracciones, y algunas o todas de esas estas fracciones de flujo continuo se pueden agrupar.
La segunda mezcla puede comprender ninguna, o casi ninguna, proteína no PEGilada. La segunda mezcla puede comprender menos de aproximadamente un 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1,5 %, 1,0 %, 0,5 % o 0,1 % de proteína no PEGilada. La segunda mezcla puede comprender menos de aproximadamente un 2 % de proteína no PEGilada. La segunda mezcla puede comprender menos de aproximadamente un 2 % de EPO no PEGilada.
Cuando el procedimiento de la invención comprende una etapa de CIH en modo de flujo continuo, el contenido en proteína no PEGilada de la segunda mezcla debe estar por debajo de la especificación de referencia para el producto terapéutico final.
Cuando la etapa de CIH se realiza en modo de flujo continuo, el flujo continuo de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada. Es decir, el flujo continuo de CIH es una composición de proteína mono-PEGilada como se describe en el presente documento. El flujo continuo de CIH puede comprender al menos un 90 % de proteína mono-PEGilada.
Cuando la etapa de CIH se realiza en modo de flujo continuo, la proteína oligo-PEGilada se puede eluir del material de CIH. Por ejemplo, por una elución por gradiente o por etapas a una conductividad de 0 mS/cm.
Para el equilibrado antes de que se lleve a cabo una etapa de CIH en modo de unión y elución, un tampón de equilibrado puede comprender sal aproximadamente 400-600 mM, sal 450-550 mM o sal aproximadamente 500 mM. Un tampón de equilibrado para su uso en CIH en modo de unión y elución puede comprender bicina aproximadamente 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 500 mM, pH 8,0. Un tampón de equilibrado para su uso en CIH en modo de unión y elución puede tener una conductividad de aproximadamente 40-80 mS/cm, 50-70 mS/cm, o de aproximadamente 60 mS/cm o de aproximadamente 58 mS/cm.
Cuando el procedimiento comprende una etapa de CIH en modo de unión y elución, el procedimiento puede implicar proporcionar un segundo medio acondicionado que comprende sal (tal como Na2SO4) y bicina, que pueden estar en cualquier combinación de las concentraciones mencionadas anteriormente, y que pueden estar presentes como Na2SO4 aproximadamente 500 mM y bicina aproximadamente 25 mM, y la etapa de elución puede comprender elución con un gradiente decreciente de Na2SO4 de 500 mM a 0 mM. Una segunda mezcla acondicionada se puede denominar solución de carga de CIH. Una segunda mezcla acondicionada para su uso en el modo de unión y elución de CIH puede comprender sal aproximadamente 250-750 mM, 400-600 mM, 450­ 550 mM, o sal aproximadamente 500 mM. La sal puede ser Na2SO4. Se pueden usar otras sales, tales como NaCl. Se pueden usar otras sales a concentraciones que proporcionan una fuerza iónica equivalente a las concentraciones de Na2SO4. Una segunda mezcla acondicionada puede comprender bicina aproximadamente 10­ 40 mM, 15-35 mM, 20-30 mM o bicina aproximadamente 25 mM. Una segunda mezcla acondicionada puede comprender Na2SO4 aproximadamente 500 mM y bicina aproximadamente 25 mM.
Cuando la etapa de CIH se realiza en modo de unión y elución, la proteína mono-PEGilada se eluye del material de CIH. La elución es por gradiente de sal decreciente. La elución puede comprender aplicar un gradiente de elución lineal de sal de 500 mM a 0 mM, tal como Na2SO4. La elución puede comprender aplicar un gradiente de elución lineal de aproximadamente 60 mS/cm a 0 mS/cm. En gradiente de sal decreciente, la EPO mono-PEGilada se eluye en aproximadamente Na2SO4300 mM (véase la figura 6). Eluir la proteína mono-PEGilada del material de CIH para proporcionar un eluido de CIH, en el que el eluido de CIH proporciona la proteína mono-PEGilada.
Cuando la etapa de CIH se realiza en modo de flujo continuo, el flujo continuo de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada. Es decir, el flujo continuo de CIH es una composición de proteína mono-PEGilada como se describe en el presente documento. El flujo continuo de CIH puede comprender al menos un 90 % de proteína mono-PEGilada.
La segunda mezcla se puede acondicionar para la etapa de CIH en uno o más lotes. La segunda mezcla se puede acondicionar en línea. La etapa de proporcionar una segunda mezcla (etapa c) puede comprender acondicionar la mezcla en línea, para proporcionar un medio acondicionado directamente desde el aparato de CII (por ejemplo, una columna de CIA o CIC) al aparato de CIH (por ejemplo, columna de CIH). Por ejemplo, la etapa de proporcionar una segunda mezcla (etapa c) puede comprender acondicionar la mezcla en línea, para proporcionar un medio acondicionado directamente desde el aparato de CIA (por ejemplo, columna de CIA) al aparato de CIH (por ejemplo, columna de CIH).
La temperatura ambiente puede ser de aproximadamente 18-25 °C, 20-22 °C, de aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 21 °C o de aproximadamente 22 °C. Los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden realizar a temperatura ambiente. La CIH se puede realizar a temperatura ambiente. La CIH se puede realizar a una temperatura de 15-25 °C. Para la reproducibilidad, los procedimientos pueden realizar la CIH a una temperatura específica y estable. Una temperatura estable puede ser una temperatura específica ± 1,0 °C o ± 1,0 °C.
El procedimiento de la invención puede comprender someter la segunda mezcla a una etapa de CIH en modo de flujo continuo para proporcionar una solución de flujo continuo de CIH en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, comprendiendo la etapa de CIH aplicar el segunda mezcla a un material de CIH en condiciones adecuadas para unir proteína oligo-PEGilada, en el que el flujo continuo de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada. En dichos procedimientos, el material de CIH puede ser Toyopearl Phenyl 650M, la etapa de CIH se realiza a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0 y una conductividad de aproximadamente 30-40 mS/cm; y la segunda mezcla se aplica al material de CIH como una solución de carga de CIH que comprende bicina aproximadamente 25 mM y Na2SO4 aproximadamente 390 mM. La proteína puede ser eritropoyetina.
Reciclaje de proteína sin reaccionar
El procedimiento puede implicar realizar una reacción de PEGilación para proporcionar una primera mezcla. En dichos procedimientos, la proteína no PEGilada (sin reaccionar) se puede reciclar incluyéndola en una reacción de PEGilación posterior.
El procedimiento puede implicar las etapas de (a) proporcionar una primera mezcla realizando una reacción de PEGilación, (b) realizar una etapa de CII y (c) proporcionar una segunda mezcla que comprende recoger el flujo continuo de la etapa de CII. En procedimientos que implican reciclaje, se realiza un ciclo de etapas a, b y c en el que la proteína no PEGilada se recupera en la etapa b; y a continuación se realiza otro ciclo de etapas a, b y c y en el que la proteína no PEGilada recuperada se usa en la reacción de PEGilación de la etapa a. Es decir, se realiza otro ciclo en el que se usa proteína no PEGilada de un ciclo previo en la reacción de PEGilación de ese otro ciclo. La etapa de CII puede ser CIA o CIC.
En particular, los procedimientos pueden comprender realizar un primer ciclo que comprende las etapas a), b) y c), en el que la etapa b) comprende además eluir proteína no PEGilada del material de CII para proporcionar un eluido de CII, y realizar un segundo ciclo de etapas a), b) y c), en el que la proteína no PEGilada eluida en la etapa b) del primer ciclo se añade a la reacción de PEGilación de la etapa a). El procedimiento puede comprender tres, cuatro o cinco ciclos, y en el que la etapa b) de cada ciclo comprende eluir proteína no PEGilada del material de CII para proporcionar un eluido de CII, y en el que la proteína no PEGilada eluida en la etapa b) se añade a la reacción de PEGilación de la etapa a) en el siguiente ciclo. La etapa de CII puede ser CIA o CIC.
El procedimiento puede comprender añadir el eluido de CII de la etapa b) de un ciclo directamente a la reacción de PEGilación de la etapa a) del siguiente ciclo. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender añadir el eluido de CII de la etapa b) de un primer ciclo directamente a la reacción de PEGilación de la etapa a) del segundo ciclo. Añadir directamente en este contexto quiere decir que no se produce ninguna etapa intermedia de purificación o limpieza de la proteína no PEGilada en el eluido (por ejemplo, por diafiltración o ultrafiltración). En cambio, el eluido del material de CII que contiene la proteína no PEGilada se añade a una reacción de PEGilación posterior.
La proteína no PEGilada usada en una reacción de PEGilación posterior se puede complementar con proteína recién obtenida. El procedimiento puede comprender añadir proteína recién obtenida a la reacción de PEGilación además de la proteína no PEGilada recuperada del material de CII. La etapa de reciclar proteína no PEGilada comprende añadir proteína no PEGilada recuperada del material de CII a una reacción de PEGilación posterior, y esto puede comprender además añadir proteína recién obtenida a la reacción de PEGilación de modo que la concentración de partida de proteína en las reacciones de PEGilación es sustancialmente constante. Sustancialmente constante en este contexto puede querer decir que la concentración de partida de proteína en la segunda y posteriores reacciones de PEGilación es sustancialmente la misma que en la reacción de PEGilación del primer ciclo. Sustancialmente lo mismo puede querer decir ± 10 %. Proteína recién obtenida se refiere a proteína que no se ha sometido previamente a una reacción de PEGilación.
Por ejemplo, el procedimiento puede implicar realizar una reacción de PEGilación para proporcionar una primera mezcla. En dichos procedimientos, la proteína no PEGilada (sin reaccionar) se puede reciclar incluyéndola en una reacción de PEGilación posterior. El procedimiento puede implicar las etapas de (a) proporcionar una primera mezcla realizando una reacción de PEGilación, (b) realizar una etapa de CIA y (c) proporcionar una segunda mezcla que comprende recoger el flujo continuo de la etapa de CIA. En procedimientos que implican reciclaje, se realiza un ciclo de etapas a, b y c en el que la proteína no PEGilada se recupera en la etapa b; y a continuación se realiza otro ciclo de etapas a, b y c y en el que la proteína no PEGilada recuperada se usa en la reacción de PEGilación de la etapa a. Es decir, se realiza otro ciclo en el que se usa proteína no PEGilada de un ciclo previo en la reacción de PEGilación de ese otro ciclo.
En particular, los procedimientos pueden comprender realizar un primer ciclo que comprende las etapas a), b) y c), en el que la etapa b) comprende además eluir proteína no PEGilada del material de CIA para proporcionar un eluido de CIA, y realizar un segundo ciclo de etapas a), b) y c), en el que la proteína no PEGilada eluida en la etapa b) del primer ciclo se añade a la reacción de PEGilación de la etapa a). El procedimiento puede comprender tres, cuatro o cinco ciclos, y en el que la etapa b) de cada ciclo comprende eluir proteína no PEGilada del material de CIA para proporcionar un eluido de CIA, y en el que la proteína no PEGilada eluida en la etapa b) se añade a la reacción de PEGilación de la etapa a) en el siguiente ciclo.
El procedimiento puede comprender añadir el eluido de CIA de la etapa b) de un ciclo directamente a la reacción de PEGilación de la etapa a) del siguiente ciclo. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender añadir el eluido de CIA de la etapa b) de un primer ciclo directamente a la reacción de PEGilación de la etapa a) del segundo ciclo. Añadir directamente en este contexto quiere decir que no se produce ninguna etapa intermedia de purificación o limpieza de la proteína no PEGilada en el eluido (por ejemplo, por diafiltración o ultrafiltración). En cambio, el eluido del material de CIA que contiene la proteína no PEGilada se añade a una reacción de PEGilación posterior.
La proteína no PEGilada usada en una reacción de PEGilación posterior se puede complementar con proteína recién obtenida. El procedimiento puede comprender añadir proteína recién obtenida a la reacción de PEGilación además de la proteína no PEGilada recuperada del material de CIA. La etapa de reciclar proteína no PEGilada comprende añadir proteína no PEGilada recuperada del material de CIA a una reacción de PEGilación posterior, y esto puede comprender además añadir proteína recién obtenida a la reacción de PEGilación de modo que la concentración de partida de proteína en las reacciones de PEGilación es sustancialmente constante. Sustancialmente constante en este contexto puede querer decir que la concentración de partida de proteína en la segunda y posteriores reacciones de PEGilación es sustancialmente la misma que en la reacción de PEGilación del primer ciclo. Sustancialmente lo mismo puede querer decir ± 10 %. Proteína recién obtenida se refiere a proteína que no se ha sometido previamente a una reacción de PEGilación.
Los procedimientos pueden implicar otro ciclo de etapas a, b y c, de modo que se realizan un primer y un segundo ciclo y el segundo ciclo es el ciclo final. De forma alternativa, los procedimientos de la invención pueden implicar otros dos ciclos de etapas a, b y c, de modo que se realizan un primer, un segundo y un tercer ciclo, y el tercer ciclo es el ciclo final. Los procedimientos pueden implicar más de otros dos ciclos de etapas a, b y c. Los procedimientos pueden implicar un total de uno, dos, tres, cuatro o cinco ciclos de etapas a, b y c.
El ciclo final puede comprender realizar una reacción de PEGilación en la que la proporción molar PEG/proteína es de aproximadamente 1,4 a 1 a de aproximadamente 2 a 1. La proporción molar PEG/proteína puede ser de aproximadamente 1,4 a 1,0, de 1,5 a 1,0, de 1,6 a 1,0, de 1,7 a 1,0, de 1,8 a 1,0, de 1,9 a 1,0, de 2,0 a 1,0, de 2,1 a 1,0, de 2,2 a 1,0, de 2,3 a 1,0, de 2,4 a 1,0 o de 2,5 a 1,0. Una proporción PEG/proteína relativamente alta puede ser ventajosa en el ciclo final. Después del ciclo final no existe reciclaje de proteína sin reaccionar (no PEGilada) y por lo tanto puede ser ventajoso minimizar el residuo de proteína minimizando la proteína sin reaccionar. Es decir, en el ciclo final puede ser ventajoso maximizar la PEGilación de proteína y en particular la mono-PEGilación.
El ciclo final puede comprender realizar una reacción de PEGilación a aproximadamente pH de 7,0 a 9,0. La reacción de PEGilación se puede realizar a aproximadamente pH de 7,5 a 8,5, o a aproximadamente pH 8,0. La reacción de PEGilación se puede realizar a aproximadamente 15-25 °C, o aproximadamente 20 °C. La reacción de PEGilación puede tener un tiempo de reacción de 30 - 120 minutos o aproximadamente 60 minutos. La PEGilación puede usar una PEG activada con NHS.
La proteína no PEGilada se puede recuperar en la etapa de CII eluyéndola del material de CII. La recuperación de la proteína no PEGilada puede implicar por lo tanto proporcionar un eluido que comprende la proteína no PEGilada en una forma relativamente concentrada y/o una forma relativamente pura. El eluido puede comprender al menos aproximadamente un 95 % de proteína no PEGilada. La etapa de CII puede ser CIA o CIC. Por ejemplo, la proteína no PEGilada se puede recuperar en la etapa de CIA eluyéndola del material de CIA. La recuperación de la proteína no PEGilada puede implicar por lo tanto proporcionar un eluido que comprende la proteína no PEGilada en una forma relativamente concentrada y/o una forma relativamente pura. El eluido puede comprender al menos aproximadamente un 95 % de proteína no PEGilada.
Eluir la proteína no PEGilada del material de CII puede comprender poner en contacto el material de CII con un tampón de elución. La etapa de CII puede ser una etapa de CIA o CIC, por lo tanto el tampón de elución puede ser un tampón de elución de CIA o CIC. El tampón de elución puede comprender sal menos de o igual a aproximadamente 70 mM, 60 mM, 50 mM o 45 mM. El tampón de elución puede comprender sal menos de o igual a aproximadamente 45 mM. El tampón de elución puede comprender NaCl aproximadamente 40-100 mM, 50­
90 mM, 60-80 mM o NaCl aproximadamente 70 mM, o NaCl aproximadamente 20-60 mM, 40-50 mM o aproximadamente 45 mM, o sal al menos aproximadamente 40 mM, 50 mM, 60 mM o 70 mM. El tampón de elución
puede comprender NaCl menos de o igual a aproximadamente 45 mM. El tampón de elución puede comprender
Na2SO4 aproximadamente 20-50 mM, 25-45 mM, 30-40 mM o Na2SO4 aproximadamente 35 mM, o Na2SO4 al
menos aproximadamente 20 mM, 25 mM, 30 mM o 35 mM. Otras sales pueden ser adecuadas para su uso en el
tampón de elución, lo que puede proporcionar la misma cantidad de iones cargados negativamente que los
intervalos de concentración indicados para NaCl y Na2SO4. Por ejemplo, el tampón de elución puede contener
NaCl aproximadamente 70 mM o Na2SO4 aproximadamente 35 mM. El tampón de elución puede comprender
bicina aproximadamente 20-30 mM o aproximadamente 25 mM. El tampón de elución puede tener un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0, de 7,5 a 8,5 o de aproximadamente 8,0. El tampón de elución puede comprender
Na2SO4 aproximadamente 35 mM, bicina aproximadamente 25 mM, pH aproximadamente 8,0.
Eluir la proteína no PEGilada de un material de CIA puede comprender poner en contacto el material de CIA con
un tampón de elución. El tampón de elución puede comprender sal menos de o igual a aproximadamente 70 mM,
60 mM, 50 mM o 45 mM. El tampón de elución puede comprender sal menos de o igual a aproximadamente
45 mM. El tampón de elución de CIA puede comprender NaCl aproximadamente 40-100 mM, 50-90 mM, 60-80 mM
o NaCl aproximadamente 70 mM, o NaCl aproximadamente 20-60 mM, 40-50 mM o aproximadamente 45 mM, o
sal al menos aproximadamente 40 mM, 50 mM, 60 mM o 70 mM. El tampón de elución puede comprender NaCl
menos de o igual a aproximadamente 45 mM. El tampón de elución puede comprender Na2SO4 aproximadamente
20-50 mM, 25-45 mM, 30-40 mM o Na2SO4 aproximadamente 35 mM, o Na2SO4 al menos aproximadamente
20 mM, 25 mM, 30 mM o 35 mM. Otras sales pueden ser adecuadas para su uso en el tampón de elución de CIA,
lo que puede proporcionar la misma cantidad de iones cargados negativamente que los intervalos de concentración
indicados para NaCl y Na2SO4. Por ejemplo, el tampón de elución puede contener NaCl aproximadamente 70 mM
o Na2SO4 aproximadamente 35 mM. El tampón de elución puede comprender bicina aproximadamente 20-30 mM
o aproximadamente 25 mM. El tampón de elución puede tener un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0, de 7,5 a 8,5
o de aproximadamente 8,0. El tampón de elución puede comprender Na2SO4 aproximadamente 35 mM, bicina aproximadamente 25 mM, pH aproximadamente 8,0.
El tampón de elución puede contener sal en una cantidad de menos de o igual a aproximadamente 60 mM, 55 mM,
50 mM, 45 mM, 40 mM o 35 mM. El tampón de elución puede contener sal en una cantidad de menos de aproximadamente 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM o 40 mM. La sal puede ser Na2SO4. La sal puede ser una mezcla
de sales que comprende Na2SO4. El tampón de elución puede tener una conductividad de aproximadamente 5­
20 mS/cm, 5-15 mS/cm u 8-10 mS/cm. El tampón de elución puede tener una conductividad de menos de o igual
a aproximadamente 20 mS/cm, 15 mS/cm o 10 mS/cm.
El tampón de elución para el material de CIA puede contener sal en una cantidad de menos de o igual a aproximadamente 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM o 35 mM. El tampón de elución puede contener sal en
una cantidad de menos de aproximadamente 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM o 40 mM. La sal puede ser Na2SO4.
La sal puede ser una mezcla de sales que comprende Na2SO4. El tampón de elución para el material de CIA puede
tener una conductividad de aproximadamente 5-20 mS/cm, 5-15 mS/cm o 8-10 mS/cm. El tampón de elución
puede tener una conductividad de menos de o igual a aproximadamente 20 mS/cm, 15 mS/cm o 10 mS/cm.
Las alternativas a bicina, para su uso en el tampón de elución de CII (CIA o CIC) (o en otras soluciones tampón analizadas en el presente documento), incluyen por ejemplo otros "tampones de Good". Se pueden usar tampones
que tienen una pKa de aproximadamente 6 a 10. Se puede usar fosfato o HEPES. Los tampones que no contienen
una amina primaria son en particular adecuados (porque una amina primaria puede actuar como compañero para
el reactivo PEG dando como resultado algunas moléculas tampón PEGiladas).
Las alternativas a bicina, para su uso en el tampón de elución de CIA (o en otras soluciones tampón analizadas en
el presente documento), incluyen por ejemplo otros "tampones de Good". Se pueden usar tampones que tienen
una pKa de aproximadamente 6 a 10. Se puede usar fosfato o HEPES. Los tampones que no contienen una amina
primaria son en particular adecuados (porque una amina primaria puede actuar como compañero para el reactivo
PEG dando como resultado algunas moléculas tampón PEGiladas).
Las alternativas a Na2SO4 , para su uso en el tampón de elución de CII (CIA o CIC) (o en otras soluciones de
tampón analizadas en el presente documento) pueden incluir por ejemplo sales que comprenden un anión seleccionado de: PO43 - , SO42 - , CH3COO- , Cl- , Br- , NO3- , ClO4- , l- , SCN- ; y un catión seleccionado de: NH4+, Rb+ ,
K+ , Na+ , Cs+ , Li2+, Mg2+, Ca2+, Ba2+. Las sales alternativas a Na2SO4 pueden incluir NaCl, KCl, NaHPO4 , LiCl y
KSCN.
Las alternativas a Na2SO4 , para su uso en el tampón de elución de CIA (o en otras soluciones de tampón analizadas
en el presente documento) pueden incluir por ejemplo sales que comprenden un anión seleccionado de: PO43 - ,
SO42 - , CH3COO- , Cl- , Br- , NO3- , ClO4- , l- , SCN- ; y un catión seleccionado de: NH4+, Rb+ , K+ , Na+, Ca2+, Ba2+. Las sales alternativas a Na2SO4 pueden incluir NaCl, KCl, NaHPO4 , LiCl y KSCN.
Realización de etapas de CIA y CIH
Las etapas de CII y CIH en los procedimientos de la invención se pueden realizar de forma secuencial. Por ejemplo, las etapas de CIA y CIH en los procedimientos de la invención se pueden realizar de forma secuencial. Es decir, el procedimiento puede comprender etapas secuenciales de a) proporcionar una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada b) someter la primera mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA) para proporcionar una solución de flujo continuo de CIA en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla; comprendiendo la etapa de CIA aplicar la primera mezcla a un material de CIA en condiciones adecuadas para unir proteína no PEGilada; c) recoger la solución de flujo continuo de CIA de la etapa b) para proporcionar una segunda mezcla que comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; y d) someter la segunda mezcla a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) para proporcionar una composición de proteína mono-PEGilada en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, en la que la composición de proteína mono-PEGilada comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada.
El término "secuencial" quiere decir que no se produce ninguna etapa de cromatografía intermedia entre cualquiera de las etapas a a d (ninguna etapa de cromatografía entre las etapas (a) y (b), (b) y (c), (c) y (d)). El término "secuencial" quiere decir que no se produce ninguna etapa de cromatografía intermedia entre cualquiera de las etapas enumeradas en una cualquiera de las reivindicaciones. Las etapas de los procedimientos de la invención se pueden realizar directamente, por ejemplo, lo que quiere decir que cada una de las etapas (b) a (d) se realiza directamente después de la etapa previa. Las etapas (b) a (d) se pueden realizar de forma discontinua o continua. Las etapas (b) a (d) se pueden realizar de forma secuencial y discontinua o de forma secuencial y continua. De forma continua quiere decir que el material de CIA y el material de CIH están conectados directamente o que existe algún otro mecanismo que permite el flujo continuo entre el material de CIA y el material de CIH. De forma discontinua quiere decir que no existe flujo continuo entre el material de CIA y el material de CIH, por ejemplo, la solución o efluente de flujo continuo de CIA se recoge y se agrupa para proporcionar la segunda mezcla. La realización de las etapas de forma continua puede querer decir que se usa el mismo caudal para todo el procedimiento.
La solución de flujo continuo de CII se puede aplicar directamente al material de CIH. Preferentemente, se realiza una etapa de acondicionamiento para proporcionar directamente al material de CIH una segunda mezcla acondicionada. El material de CII y material de CIH se pueden conectar directamente en serie. Por ejemplo, el material de CII puede estar comprendido en una columna de CII y el material de CIH puede estar comprendido en una columna de CIH, y la columna de CII está conectada directamente a la columna de CIH. La solución de flujo continuo de CII de la columna de CII se puede suministrar directamente a la columna de CIH. Puede existir una conexión en línea entre la columna de CII y la columna de CIH. Puede existir un mecanismo que permite el flujo continuo entre la columna de CII y la columna de CIH. Las etapas del procedimiento se pueden realizar de forma continua. Las etapas del procedimiento se pueden realizar en paralelo, es decir, la etapa (d) se puede comenzar antes de que se complete la etapa (b), de modo que las etapas (b) y (d) se ejecutan en paralelo. Es decir, la etapa de CIH y etapa de CII se pueden ejecutar en paralelo. La realización del procedimiento de forma continua (o en paralelo) es ventajoso porque es relativamente rápido y eficaz.
Cuando la etapa de CII es una etapa de CIC, las etapas de CIC y CIH se pueden realizar de forma secuencial y/o se pueden realizar de forma continua o discontinua, como se describe anteriormente para las etapas de CIA y CIH.
Los procedimientos divulgados en el presente documento son ventajosos
Los procedimientos de la invención usan un material de CII con una capacidad de unión relativamente baja para la forma PEGilada de la proteína y una capacidad de unión relativamente alta para la forma no PEGilada de la proteína. Esto es ventajoso porque facilita la separación rápida de proteína no PEGilada de la proteína PEGilada. Gran parte de la capacidad de unión de la columna se usa para unirse a la forma no PEGilada de la proteína, lo que facilita el procesamiento de volúmenes relativamente grandes de la primera mezcla (comprendiendo la mezcla proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada) usando un columna relativamente pequeña. Esto es porque la primera mezcla es en general relativamente baja en proteína no PEGilada (para la que el material de unión de CII tiene una capacidad de unión relativamente alta) y alta en proteína PEGilada (para la que el material de unión de CII tiene una capacidad de unión relativamente baja), esto quiere decir que en funcionamiento los procedimientos divulgados en el presente documento pueden procesar volúmenes relativamente grandes de la primera mezcla en la etapa de CII. La separación relativamente rápida de proteína no PEGilada de la proteína PEGilada facilita el reciclaje rápido de la proteína no PEGilada y la eficacia del procedimiento global.
Los procedimientos de la invención pueden comprender reciclar proteína no PEGilada sin realizar una etapa de diafiltración o ultrafiltración. Esto proporciona un procedimiento más rápido permitiendo mayor productividad en comparación con procedimientos que implican el reciclaje de proteína no PEGilada pero que requieren la retirada o reducción de sal de la fracción de proteína no PEGilada.
Los procedimientos de la invención también tienen un rendimiento relativamente alto en comparación con el procedimiento de la técnica anterior tal como el divulgado en el documento WO 2009/010270. El reciclaje de proteína no PEGilada (sin reaccionar) incrementa el rendimiento global. Como se analiza en los ejemplos a continuación, los procedimientos divulgados en el presente documento proporcionan un rendimiento de proteína mono-PEGilada que es más de un 40 % mayor que el del procedimiento divulgado en el documento WO 2009/010270. Se espera que la productividad de los procedimientos divulgados en el presente documento sea al menos el doble que la de los procedimientos de la técnica anterior del tipo divulgado en el documento WO 2009/010270, y puede ser muchas veces mayor. Se espera que la productividad de los procedimientos divulgados en el presente documento sea al menos el doble que la de los procedimientos de la técnica anterior del tipo divulgado en el documento WO 2009/010270, cuando se usan equipos de igual tamaño, y puede ser muchas veces mayor.
En comparación con el procedimiento divulgado en Pfister (Biotech y BioEng 2016; 113), se calcula que los procedimientos divulgados en el presente documento son alrededor del doble de productivos (alrededor de 1,7 veces más productivos). El incremento en la productividad es principalmente el resultado de evitar la necesidad de diafiltración de EPO no PEGilada (sin reaccionar) que requiere mucho tiempo, antes de que se pueda reciclar por la adición a una reacción de PEGilación posterior. Debido a que la EPO sin reaccionar se recupera más rápido en los procedimientos divulgados actualmente, la productividad global es mayor. Los procedimientos divulgados en el presente documento también implican una reacción de PEGilación más rápida. Se calcula que los procedimientos de PEGilación divulgados en el presente documento producen entre un 20-33 % más de EPO mono-PEGilada por reacción que el procedimiento divulgado en Pfister.
En comparación con el procedimiento divulgado en el documento WO 2009/010270, los procedimientos divulgados en el presente documento son más productivos y tienen mayores rendimientos de proteína mono-PEGilada.
Capacidad de unión
La capacidad de unión de un material de cromatografía se refiere a la cantidad de proteína que se puede unir al medio en condiciones experimentales definidas. La capacidad de unión en el presente documento se puede referir a la capacidad de unión dinámica. La capacidad de unión dinámica se refiere a la cantidad de proteína que se puede unir al medio en condiciones experimentales definidas que incluyen el caudal de la fase móvil (o solución tampón). La capacidad de unión se puede referir a la capacidad de unión estática, que se refiere a condiciones experimentales definidas que no incluyen el caudal.
La capacidad de unión dinámica para una proteína específica se puede determinar usando técnicas convencionales. La capacidad de unión dinámica para una proteína específica se puede determinar cargando una muestra que contiene una concentración conocida de esa proteína específica y midiendo la concentración de proteína en el flujo continuo a la solución para establecer la cantidad de proteína que se puede unir antes de que comience una cantidad significativa de proteína a "romperse". Esto se puede lograr generando una "curva de ruptura" para el material de cromatografía en condiciones experimentales definidas. Las condiciones experimentales en las que se mide la capacidad de unión dinámica pueden ser las condiciones de funcionamiento. Las condiciones experimentales pueden ser las condiciones usadas en el procedimiento usado para proporcionar la composición de proteína mono-PEGilada. En procedimientos que emplean materiales de cromatografía, las condiciones de carga se pueden ajustar por tanto de modo que una proteína de interés se aplica en un intervalo menor que la capacidad de "de ruptura" del material de cromatografía, para evitar la sobrecarga del material de cromatografía.
La referencia a la capacidad de unión dinámica en el presente documento se refiere a la capacidad de unión dinámica en las condiciones elegidas para el procedimiento o etapa de cromatografía. La capacidad de unión dinámica de un medio de cromatografía en condiciones de cromatografía particulares para una proteína particular se puede considerar como la máxima cantidad de esa proteína que se puede cargar sobre el medio de cromatografía sin provocar una pérdida de proteína innecesaria. Es decir, la máxima cantidad de proteína de interés que se puede cargar sin provocar una "ruptura". Se puede seguir la ruptura de proteína por espectrofotometría, por ejemplo, a 280 nm (A280). El punto de ruptura puede ser de un 10 %. Las condiciones de cromatografía pueden ser el pH, conductividad y caudal, y las concentraciones de cualquier sal u otros aditivos para la fase móvil. El material de cromatografía de capacidad de unión dinámica se determina en las condiciones de funcionamiento (las condiciones elegidas para) para la etapa de cromatografía pertinente. Por ejemplo, la capacidad de unión dinámica del material de CIA se determina en las condiciones de funcionamiento para la etapa de CIA de los procedimientos de la invención.
En el presente contexto, la capacidad de unión se puede referir a la capacidad de unión dinámica en las condiciones de cromatografía usadas para preparar la composición de proteína mono-PEGilada. Por ejemplo, la capacidad de unión del material de CIA se puede referir a la capacidad de unión dinámica de un material de CIA en bicina 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 7,5 mM, pH 8, a un caudal de 200 cm/h, tiempo de permanencia de 3,3 minutos.
La capacidad de unión del material de CIH puede ser de aproximadamente 5 g/l de proteína PEGilada en el modo de flujo continuo y de 2 g/l de proteína PEGilada en el modo de unión y elución. La capacidad de unión dinámica del material de CIH usado en el modo de flujo continuo para proteína oligo-PEGilada puede ser de al menos aproximadamente 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l o 5 g/l, o de aproximadamente 2-8 g/l, 3-7 g/l, 4-6 g/l, o de aproximadamente 5 g/l. La capacidad de unión dinámica del material de CIH usado en el modo de unión y elución para proteína PEGilada puede ser de al menos aproximadamente 0,5 g/l, 1 g/l, 2 g/l, 3 g/l, 4 g/l o 5 g/l, o de aproximadamente 0,5-4 g/l, 1-3 g/l, o de aproximadamente 5 g/l. La capacidad de unión se puede referir a la capacidad de unión dinámica para proteína PEGilada de un material de CIH en bicina 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 300 mM, pH 8,0, a un caudal de 150 cm/h, tiempo de permanencia de 3,3 minutos, o en bicina 25 mM, Na2SO4 aproximadamente 390 mM, pH 8,0, a un caudal de 150 cm/h, tiempo de permanencia de 3,3 minutos.
En modos de realización donde la etapa de cromatografía de intercambio iónico es cromatografía de intercambio aniónico, la etapa de CIA se realiza en condiciones adecuadas para que la proteína no PEGilada se una al material de CIA. La idoneidad de las condiciones se puede considerar en términos de capacidades de unión dinámica. La etapa de CIA se realiza en modo de flujo continuo. En modo de flujo continuo para CIA en los procedimientos de la invención, la proteína PEGilada se une de forma relativamente débil al material de CIA y la proteína no PEGilada se une de forma relativamente fuerte (firme). En dichas condiciones, la capacidad de unión dinámica del material de CIA para la proteína no PEGilada es relativamente alta y la capacidad de unión dinámica del material de CIA para la proteína PEGilada es relativamente baja. Las condiciones de cromatografía se pueden seleccionar para maximizar la capacidad de unión dinámica para la proteína no PEGilada. Las condiciones de cromatografía se pueden seleccionar para minimizar la capacidad de unión dinámica para la proteína PEGilada. Las condiciones de cromatografía se pueden seleccionar para ajustar, u optimizar, la capacidad de unión dinámica del material de CIA para la proteína PEGilada y la proteína no PEGilada para que la proteína no PEGilada se retenga en el material de CIA y la proteína PEGilada se recupere en la solución de flujo continuo. El material de CIA puede tener una capacidad de unión dinámica para la proteína PEGilada de menos de aproximadamente 2,5 g/l, 1,5 g/l o 1,0 g/l, o de aproximadamente 1,0 - 2,5 g/l. Por ejemplo, el material de CIA puede tener una capacidad de unión dinámica para la proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,5 g/l.
Por tanto, en los procedimientos de la invención, someter la primera mezcla a una etapa de CIA puede comprender cargar la primera mezcla sobre el material de CIA a una carga que es aproximadamente igual a, o a una carga que es menor que, la capacidad de unión dinámica del material de CIA para proteína no PEGilada. Puede comprender cargar la primera mezcla sobre el material de CIA a una carga al menos 2, 5, 10, 20, 25 o 30 veces menor que la capacidad de unión dinámica del material de CIA para proteína no PEGilada (de modo que el material no PEGilado se retiene sobre el material de CIA). La cantidad de proteína no PEGilada aplicada al material de intercambio aniónico puede estar en el intervalo de aproximadamente un 80-95 % de la capacidad de unión dinámica del material de intercambio aniónico. La primera mezcla se puede cargar sobre el material de CIA a una carga que es mayor que o al menos 2, 5, 20, 25 o 30 veces mayor que la capacidad de unión dinámica del material de CIA para proteína PEGilada (de modo que la proteína PEGilada se recupera en la solución de flujo continuo o efluente del material de CIA).
La elución posterior de proteína no PEGilada del material de CIA se lleva a cabo en condiciones en las que la capacidad de unión dinámica del material de CIA para la proteína no PEGilada es relativamente baja. Esto se puede lograr aplicando un tampón de elución de conductividad relativamente alta en comparación con los tampones de carga y/o lavado.
La etapa de CIH se puede realizar en modo de flujo continuo. En modo de flujo continuo de una etapa de CIH en un procedimiento de la invención, la proteína de interés (en este caso, proteína mono-PEGilada) se une de forma relativamente débil al material de CIH y la proteína no deseada (o contaminante, en este caso, proteína oligo-PEGilada) se une de forma relativamente fuerte (firme). En dichas condiciones, la capacidad de unión dinámica del material de CIH para la proteína oligo-PEGilada es mayor que la capacidad de unión dinámica del material de CIH para la proteína mono-PEGilada. Las condiciones de cromatografía se pueden seleccionar para maximizar la fuerza de unión para la proteína oligo-PEGilada y/o minimizar la fuerza de unión para la proteína mono-PEGilada.
La etapa de CIH se puede realizar en modo de unión y elución. En modo de unión y elución en una etapa de CIH en un procedimiento de la invención, la proteína de interés (en este caso, proteína mono-PEGilada) se une de forma relativamente débil al material de CIH y la proteína no deseada (o contaminante, en este caso, proteína oligo-PEGilada) se une de forma relativamente fuerte (firme) por el material de CIH. La proteína mono-PEGilada se puede eluir del material de CIH antes de la proteína oligo-PEGilada, usando un gradiente de sal decreciente.
En modos de realización donde la etapa de cromatografía de intercambio catiónico es cromatografía de intercambio aniónico, la etapa de CIC se realiza en condiciones adecuadas para que la proteína no PEGilada se una al material de CIC. La idoneidad de las condiciones se puede considerar en términos de capacidades de unión dinámica. La etapa de CIC se realiza en modo de flujo continuo. En modo de flujo continuo para CIC en los procedimientos de la invención, la proteína PEGilada se une de forma relativamente débil al material de CIC y la proteína no PEGilada se une de forma relativamente fuerte (firme). En dichas condiciones, la capacidad de unión dinámica del material de CIC para la proteína no PEGilada es relativamente alta y la capacidad de unión dinámica del material de CIC para la proteína PEGilada es relativamente baja. Las condiciones de cromatografía se pueden seleccionar para maximizar la capacidad de unión dinámica para la proteína no PEGilada y/o minimizar la capacidad de unión dinámica para la proteína PEGilada (o mono-PEGilada). Las condiciones de cromatografía se pueden seleccionar para ajustar, u optimizar, la capacidad de unión dinámica del material de CIC para la proteína PEGilada y la proteína no PEGilada para que la proteína no PEGilada se retenga en el material de CIC y la proteína PEGilada se recupere en la solución de flujo continuo. El material de CIC puede tener una capacidad de unión dinámica para la proteína PEGilada de menos de aproximadamente 2,5 g/l, 1,5 g/l o 1,0 g/l, o de aproximadamente 1,0 - 2,5 g/l. Por ejemplo, el material de CIC puede tener una capacidad de unión dinámica para la proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,5 g/l.
Por tanto, en los procedimientos de la invención, someter la primera mezcla a una etapa de CIC puede comprender cargar la primera mezcla sobre el material de CIC a una carga que es aproximadamente igual a, o a una carga que es menor que, la capacidad de unión dinámica del material de CIC para proteína no PEGilada. Puede comprender cargar la primera mezcla sobre el material de CIC a una carga al menos 2, 5, 10, 20, 25 o 30 veces menor que la capacidad de unión dinámica del material de CIC para proteína no PEGilada (de modo que el material no PEGilado se retiene sobre el material de CIC). La cantidad de proteína no PEGilada aplicada al material de intercambio aniónico puede estar en el intervalo de aproximadamente un 80-95 % de la capacidad de unión dinámica del material de intercambio aniónico. La primera mezcla se puede cargar sobre el material de CIC a una carga que es mayor que o al menos 2, 5, 20, 25 o 30 veces mayor que la capacidad de unión dinámica del material de CIC para proteína PEGilada (de modo que la proteína PEGilada se recupera en la solución de flujo continuo o efluente del material de CIC).
La elución posterior de proteína no PEGilada del material de CIC se lleva a cabo en condiciones en las que la capacidad de unión dinámica del material de CIC para la proteína no PEGilada es relativamente baja. Esto se puede lograr aplicando un tampón de elución de conductividad relativamente alta en comparación con los tampones de carga y/o lavado.
Condiciones de cromatografía
La cantidad de proteína cargada sobre un material de cromatografía puede depender de la capacidad de unión del material. Por ejemplo, si un material de CIA tiene una capacidad de unión para EPO no PEGilada de aproximadamente 35 g/l, y aproximadamente un 50 % de la EPO en la primera mezcla no está PEGilada, entonces la carga máxima de la primera mezcla (en términos de proteína total) aplicada al material de CIA sería de aproximadamente 70 g/l.
Los caudales para las etapas de cromatografía se pueden seleccionar y ajustar de acuerdo con técnicas convencionales. Los caudales más rápidos disminuirán la capacidad de unión, lo que significa que se puede alcanzar un equilibrio entre el logro de la máxima capacidad de unión dinámica y una separación rápida, en particular, cuando se aplican grandes volúmenes de mezclas de proteínas que se van a separar. Los caudales adecuados pueden ser de 50 - 400 cm/h. Los tiempos de permanencia pueden ser de 3-5 minutos, o posiblemente menores, dependiendo del material de cromatografía usado. Pueden ser deseables caudales más rápidos y tiempos de permanencia más cortos para mejorar la productividad del procedimiento global.
Las etapas de cromatografía se pueden realizar en condiciones "adecuadas para unir" una proteína particular (o forma de PEGilación de una proteína). El experto en la técnica está familiarizado con las técnicas de cromatografía y puede encontrar las condiciones adecuadas para unir de forma empírica una proteína particular, usando su conocimiento general común y guiado por la presente divulgación. Los parámetros tales como material de cromatografía, tipo y/o concentración de sal, pH, tampones, temperatura y caudal se pueden alterar para proporcionar condiciones adecuadas para unir una proteína particular (o forma de PEGilación de una proteína) en cromatografía.
Como se indica anteriormente, en CIA se usan en general mezclas de proteínas (composiciones de carga) y tampones de lavado de un pH relativamente alto, para que la proteína de interés (o contaminante, por ejemplo, proteína no deseada) tenga una carga negativa neta y por lo tanto se una al material de intercambio aniónico cargado positivamente. Por el contrario en CIC se usan en general mezclas de proteínas y tampones de lavado de un pH relativamente bajo, para que la proteína de interés (o contaminante, por ejemplo, proteína no deseada) tenga una carga positiva neta y por lo tanto se una al material de intercambio catiónico cargado negativamente.
Los procedimientos de la presente invención se pueden usar para producir una composición de proteína mono-PEGilada en la que la proteína tiene un pI de aproximadamente 8,0 o menos, o 7,0 o menos, o 6,0 o menos. Los procedimientos de la invención son en particular adecuados para proteínas que tienen un pI de 6,0 o menor. En este caso, la etapa de cromatografía de intercambio iónico puede ser una etapa de CIA y las condiciones de CIA son a un pH mayor que el pI de la proteína, preferentemente al menos 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 o 4,0 unidades de pH mayores que el pI de la proteína.
En este contexto, el pI se puede referir al pI de la isoforma más básica de la proteína, o al pI de la isoforma más abundante de la proteína, en la composición de proteína.
Los procedimientos de la presente invención se pueden usar para producir una composición de proteína mono-PEGilada en la que la proteína tiene un pI de aproximadamente 8,0 o mayor. En este caso, la etapa de cromatografía de intercambio iónico puede ser una etapa de CIC y las condiciones de CIC son a un pH menor que el pI de la proteína, preferentemente al menos 0,5, 1,0, 2,0 o 3,0 unidades de pH menores que el pI de la proteína. En este contexto, el pI se puede referir al pI de la isoforma más ácida de la proteína, o al pI de la isoforma más abundante de la proteína, en la composición de proteína. La proteína puede tener un pI de aproximadamente 2,0 - 6,0, 2,5 - 5,5, 3,0 - 5,5, 3,5 - 5,0 o aproximadamente 3,5-4,5.
Los procedimientos de la presente invención se pueden usar para producir una composición de proteína mono-PEGilada en la que la proteína tiene un pI de aproximadamente 6,0 - 8,0. En este caso, la etapa de cromatografía de intercambio iónico puede ser una etapa de CIA o CIC y las condiciones de pH seleccionadas se seleccionan para tener un pH menor que el pI de la proteína para CIA, y mayor que el pI de la proteína para CIC. Preferentemente, el pH de la etapa de intercambio iónico está al menos a 0,5, 1,0, 2,0 o 3,0 unidades de pH de (diferentes de) el pI de la proteína. En este contexto, el pI se puede referir al pI de la isoforma más ácida o básica de la proteína, o al pI de la isoforma más abundante de la proteína, en la composición de proteína. La cromatografía de intercambio iónico es una técnica establecida y, por lo tanto, el experto en la técnica no tendría dificultad para seleccionar condiciones de pH adecuadas para practicar los procedimientos de la presente invención (es decir, seleccionar condiciones de pH que favorezcan la unión de la proteína no PEGilada al material de intercambio iónico y permitan que la proteína PEGilada pase a través/sobre el material para recuperarse en la solución de flujo continuo).
El pH de la reacción de PEGilación puede ser sustancialmente el mismo que el pH de la etapa de intercambio iónico (la etapa de CIA o la etapa de CIC). El pH de la reacción de PEGilación se puede seleccionar para que sea sustancialmente el mismo que el pH de la etapa de intercambio iónico, de modo que la mezcla de proteínas resultante de la reacción de PEGilación se carga directamente sobre el material de intercambio iónico. En este contexto, sustancialmente el mismo significa dentro de 1,0, 0,9, 0,8, 0,6, 0,7, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 o 0,1 unidades de pH. En dichos procedimientos, la primera mezcla es la mezcla de productos de reacción que resulta de la reacción de PEGilación. Estos procedimientos son relativamente eficaces y rápidos. En este contexto, "cargado directamente" quiere decir que no se lleva a cabo ningún ajuste de pH de la mezcla de productos de reacción antes de que se someta a la etapa de cromatografía de intercambio iónico. El tampón para la reacción de PEGilación puede ser el mismo que el tampón para la etapa de intercambio iónico.
Una reacción de PEGilación se puede realizar a un pH de aproximadamente 6,5 a 9,5. El pH de la reacción de PEGilación se puede seleccionar para que esté al menos a 0,5, 1,0, 2,0 o 3,0 unidades de pH del pI de la proteína, de modo que la mezcla de productos de reacción se pueda cargar directamente en el material de intercambio iónico a un pH que favorece la unión de la proteína. En este contexto, una proteína que tiene un pH relativamente neutro (por ejemplo, pI de aproximadamente 7,5) se podría PEGilar en una reacción a aproximadamente pH 9,5 y la mezcla de productos de reacción someterse a una etapa de CIA. De forma alternativa, una proteína que tiene un pI de aproximadamente 7,5 se podría PEGilar en una reacción a aproximadamente pH 6,5 y la mezcla de productos de reacción someterse a una etapa de CIC. El pH de la reacción de PEGilación se puede seleccionar de modo que esté al menos a 0,5, 1,0, 2,0 o 3,0 unidades de pH del pI de la proteína, y el modo de cromatografía de intercambio iónico (CIA o CIC) se selecciona en consecuencia. De esta manera, la mezcla de productos de reacción se puede someter a la etapa de cromatografía de intercambio iónico.
En el presente contexto, las etapas de cromatografía (tales como CIA, CIC o CIH) pueden retirar un "contaminante" de una mezcla (tal como una primera mezcla o segunda mezcla), en la que el contaminante es una forma no deseada de proteína. Un contaminante también se puede denominar impureza. Por ejemplo, puesto que la forma deseada de proteína en el presente contexto es proteína mono-PEGilada, la etapa de cromatografía puede retirar la proteína no PEGilada o la proteína oligo-PEGilada. La etapa de cromatografía también puede retirar otros contaminantes, tales como agregados de proteínas o reactivos de PEGilación.
La presente divulgación proporciona el uso de un medio de CIA o un medio de CIC para retirar proteína no PEGilada de una mezcla que comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada. La proteína puede ser EPO. El uso del medio de CIA se puede llevar a cabo en los procedimientos para preparar una proteína mono-PEGilada, como se divulga en el presente documento.
Las condiciones de cromatografía y materiales de cromatografía para llevar a cabo la presente invención se pueden seleccionar usando un procedimiento de cribado. El procedimiento de cribado puede permitir el cribado de la selectividad de unión. La selectividad de unión es ventajosa. Por ejemplo, los materiales y condiciones de intercambio iónico se pueden cribar para obtener una selectividad que favorezca la unión de proteína no PEGilada al material de CIA y la no unión de proteína PEGilada al material de intercambio iónico. Por ejemplo, los materiales de CIH y condiciones de flujo continuo se pueden cribar para obtener una selectividad que favorezca la unión de proteína oligo-PEGilada y la no unión de proteína mono-PEGilada. Un procedimiento de cribado para un material de intercambio iónico, tal como un material de CIA o un material de CIC, puede implicar aplicar una mezcla de proteínas no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada al material de intercambio iónico a una conductividad relativamente baja, y a continuación aplicar un incremento en el gradiente de conductividad (por ejemplo, sal) al material y seguir la aparición de la no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada en el eluido. Este procedimiento se podría llevar a cabo a varios valores de pH diferentes. Un procedimiento de cribado para un material de CIH puede implicar aplicar una mezcla de proteínas no PEGiladas, mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas para el material de CIH en condiciones con contenido alto en sal, a continuación aplicar un gradiente de sal decreciente al material y seguir la aparición no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada en el eluido. Los materiales y condiciones de cromatografía se pueden evaluar para determinar la selectividad de unión analizando el eluido por cromatografía UV y cribando materiales y condiciones que proporcionen una buena separación de picos en los cromatogramas.
PEG
El poli(etilenglicol) o PEG es un poliéter hidrófilo neutro. El término "peso molecular" (en kDa) en el presente contexto se debe entender como el peso molecular medio del PEG porque PEG, como compuesto polimérico, no se obtiene con un peso molecular definido, sino que, de hecho, tiene una distribución de peso molecular; el término "aproximadamente" indica que algunas moléculas, o residuos, de PEG pesarán más y otras menos que el peso molecular indicado, es decir, el término "aproximadamente" en este contexto se puede referir a una distribución de peso molecular en la que un 95 % de las moléculas de PEG tienen un peso molecular dentro de /- un 10 % del peso molecular indicado. Por ejemplo, un peso molecular de 30 kDa puede indicar un intervalo de desde 27 kDa a 33 kDa.
Un residuo de PEG puede contener otros grupos químicos, que son necesarios para las reacciones de unión, que resultan de la síntesis química de la molécula PEGilada, o que son espaciadores para la distancia óptima de partes de la molécula. Estos otros grupos químicos no se usan para el cálculo del peso molecular del residuo de PEG. Además, un residuo de PEG de este tipo puede consistir en una o más cadenas de PEG que están enlazadas covalentemente entre sí. Los residuos de PEG con más de una cadena de PEG se llaman residuos de PEG con múltiples ramas o ramificado. Se pueden preparar residuos de PEG ramificado, por ejemplo, por la adición de poli(óxido de etileno) a diversos polioles, incluyendo glicerol, pentaeritriol y sorbitol. Se informa de residuos de PEG ramificado, por ejemplo, en los documentos EP 0473084, US 5.932.462.
Una molécula de PEG usada en una reacción de PEGilación, y un residuo de PEG en una proteína PEGilada, pueden tener cada uno un peso molecular de al menos aproximadamente 12 kDa, o de al menos aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 20 kDa a 40 kDa, o de aproximadamente 30 kDa. Un residuo de PEG puede tener un peso molecular de 20 kDa a 35 kDa y ser un residuo de PEG lineal. Un residuo de PEG puede tener un peso molecular de 35 kDa a 40 kDa y ser un residuo de PEG ramificado.
Una EPO mono-PEGilada puede comprender un único residuo de PEG que tenga un peso molecular de al menos aproximadamente 12 kDa, o de al menos aproximadamente 20 kDa, de aproximadamente 20 kDa a 40 kDa, de aproximadamente 20 kDa o de aproximadamente 30 kDa. Un residuo de PEG puede tener un peso molecular de al menos aproximadamente 20 kDa.
Una proteína mono-PEGilada es una proteína que comprende un único residuo de PEG. Es decir, la proteína mono-PEGilada solo tiene un residuo de PEG. Una proteína oligo-PEGilada comprende al menos dos residuos de PEG. Por ejemplo, una proteína oligo-PEGilada puede ser una proteína di, tri o tetra-PEGilada. El término proteína oligo-PEGilada (o proteína poli-PEGilada) se puede referir a un grupo de moléculas de proteína oligo-PEGilada que tienen grados variables de PEGilación (dos, tres o más residuos de PEG). El término proteína PEGilada se refiere a proteínas mono-PEGiladas y oligo-PEGiladas. El término proteína PEGilada se puede referir a una proteína que consiste en una proteína mono-PEGilada y oligo-PEGilada. Una proteína no PEGilada es una proteína que no comprende ningún residuo de PEG. Una proteína no PEGilada, en el contexto de una reacción de PEGilación, también se puede denominar proteína sin reaccionar. Una proteína no PEGilada se puede denominar proteína natural, o proteína no PEGilada o proteína libre.
El término "PEGilación" significa un enlace covalente de un residuo de PEG con una proteína. En particular, se puede referir a un enlace covalente en el extremo N del polipéptido y/o un residuo de lisina interno. La PEGilación de proteínas es ampliamente conocida en el estado de la técnica y se revisa, por ejemplo, por Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417. El PEG se puede enlazar usando diferentes grupos funcionales y polietilenglicoles con diferentes pesos moleculares, PEG lineales y ramificados, así como diferentes grupos de enlace (véanse también Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier 30 Systems 9 (1992) 249-304). Se puede realizar la PEGilación de eritropoyetina en solución acuosa con reactivos de PEGilación como se describe, por ejemplo, en el documento WO 00/44785, en un modo de realización usando moléculas de PEG lineal o ramificado activado con NHS de un peso molecular entre 5 kDa y 40 kDa. También se puede realizar la PEGilación en la fase sólida de acuerdo con Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229. También se puede producir de forma no aleatoria, de forma N terminal, el polipéptido PEGilado de acuerdo con el documento W o 94/01451. También se revisan reacciones de PEGilación en los documentos WO 2009/010270 y WO 2012/035037.
Los derivados de PEG adecuados son moléculas de PEG activado con un peso molecular promedio de desde aproximadamente 5 a aproximadamente 40 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 kDa. En un modo de realización, el derivado de PEG es un PEG lineal o uno ramificado. Se puede obtener una amplia variedad de derivados de PEG adecuados para su uso en la preparación de conjugados PEG-proteína y PEG-péptido de Shearwater Polymers (Huntsville, AL, U.S.A.; www.nektar.com). Los derivados de PEG activado son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368.
Se puede realizar una reacción de PEGilación a un pH de aproximadamente 6,5 a 9,5, de aproximadamente 7,0 a 9,0 o de aproximadamente 7,5 a 8,5 o de aproximadamente 8,0. El pH al que se realiza la reacción de PEGilación puede depender del reactivo de PEG usado. El reactivo de PEG puede ser mPEG-NHS, mPEG-SPA, mPEG-SVA o mPEG-CI. La reacción de PEGilación se puede realizar a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0, o de aproximadamente 7,5 a 8,5, o de aproximadamente 8,0 usando reactivo de p Eg activado (NHS). La reacción de PEGilación se puede realizar a aproximadamente 15-25 °C, o a aproximadamente 18-22 °C, o a aproximadamente 20 °C. La reacción de PEGilación se puede llevar a cabo durante al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50 o 60 minutos, o aproximadamente 30-90, o 30-60 minutos, o aproximadamente 40, 50 o 60 minutos.
Se puede realizar una reacción de PEGilación en una solución que comprende una sal y un tampón. La sal puede ser Na2SO4 y el tampón puede ser bicina. La sal puede estar presente en una cantidad de 5-10 mM o de aproximadamente 7,5 mM. El tampón puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 10-50 mM, 20­ 30 mM o de aproximadamente 25 mM. La reacción de PEGilación se puede realizar en Na2SO47,5 mM y bicina 25 mM.
EPO
El término "eritropoyetina" y su abreviatura "EPO" se refieren a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 2, o una proteína o polipéptido sustancialmente homólogo a la misma, relacionándose sus propiedades biológicas a la estimulación de la producción de glóbulos rojos y a la estimulación de la división y diferenciación de precursores eritroides sensibilizados en la médula ósea. Se puede preparar eritropoyetina recombinante por medio de la expresión en células eucariotas, por ejemplo en células CHO, o células BHK, o células HeLa por tecnología de ADN recombinante o por activación de genes endógenos, es decir, la glucoproteína eritropoyetina se expresa por activación de genes endógenos, véanse, por ejemplo, los documentos US 5.733.761, US 5.641.670, US 5.733.746, WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955. La EPO puede ser EPO humana. La EPO puede ser EPO glucosilada.
La EPO humana puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. La EPO humana puede tener la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1. El término "EPO" también indica variantes de la proteína de SEQ ID NO: 1 o de SEQ ID NO: 2, en la que se han cambiado, delecionado o insertado uno o más residuos de aminoácido, y que tiene actividad biológica comparable a la proteína no modificada, tal como, por ejemplo, se informa en los documentos EP 1064 951 o US 6.583.272. El número de aminoácidos cambiados, delecionados o insertados puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20 o 1-10. El término EPO indica proteínas que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2 o variantes de la misma. Una variante puede tener la secuencia de aminoácidos de eritropoyetina humana que tiene de 1 a 6 sitios adicionales para la glucosilación. La actividad específica de la eritropoyetina PEGilada se puede determinar por diversos ensayos conocidos en la técnica. La actividad biológica de la eritropoyetina PEGilada purificada es de tal modo que la administración de la proteína por inyección a pacientes humanos da como resultado células de médula ósea que incrementan la producción de reticulocitos y glóbulos rojos en comparación con grupos de sujetos no inyectados o de control. La actividad biológica de la eritropoyetina PEGilada obtenida y purificada de acuerdo con el procedimiento como se informa en el presente documento se puede someter a prueba por procedimientos de acuerdo con Bristow, A, Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48.
Las variantes de secuencia de aminoácidos de EPO se pueden preparar introduciendo modificaciones apropiadas en la secuencia de nucleótidos que codifica la EPO, o por síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de la eritropoyetina. Se puede preparar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea actividad biológica comparable con la EPO humana.
Se muestran sustituciones aminoacídicas conservadoras en la tabla a continuación bajo el encabezado "sustituciones preferentes". Se proporcionan cambios más sustanciales bajo el encabezado "sustituciones ejemplares" y como se describe a continuación en referencia a las clases de cadenas laterales de aminoácidos. Se pueden introducir sustituciones aminoacídicas en eritropoyetina humana y cribarse los productos para determinar la retención de la actividad biológica de eritropoyetina humana.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
La EPO puede ser una EPO variante. La EPO puede estar comprendida en una proteína de fusión con otra proteína, o se puede conjugar a otro resto además de PEG.
La PEGilación química de eritropoyetina, en general, da como resultado una preparación de proteína que comprende eritropoyetina que está PEGilada en uno o más grupos £-amino de residuos de lisina y/o en el grupo amino N terminal. La PEGilación selectiva en el aminoácido N terminal se puede realizar de acuerdo con Felix (1997). Se puede lograr la PEGilación N terminal selectiva durante la síntesis en fase sólida por acoplamiento de un derivado de aminoácido PEGilado en Na al aminoácido terminal N-1 de la cadena peptídica. Se puede realizar la PEGilación de la cadena lateral durante la síntesis en fase sólida por acoplamiento de derivados de lisina PEGilados en NE a la cadena en crecimiento. La PEGilación N terminal y de cadena lateral combinada es viable como se describe anteriormente dentro de la síntesis en fase sólida o bien por síntesis en fase de solución aplicando reactivos de PEG activado a un péptido con amino desprotegido.
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Los aminoácidos se pueden agrupar de acuerdo con propiedades de cadena lateral comunes:
(1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácidos: Asp, Glu;
(4) básicos: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservadoras conllevarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase.
Proteínas
Los procedimientos de la invención son especialmente adecuados para producir composiciones de EPO mono-PEGilada. La referencia a una proteína o proteína de interés en el presente documento se puede referir a EPO. Los procedimientos de la invención pueden ser adecuados para producir composiciones mono-PEGiladas de otras proteínas, en particular proteínas terapéuticas. Por ejemplo, interleucina-2 (IL-2), peginterferón alfa-2a, hormona del crecimiento humana (hGH), proteína morfogenética ósea 2 (BMP-2), proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7), proteína morfogenética ósea 15 (BMP-15), neurotrofina-3 (NT-3), proteasa del factor de Von Willebrand (vWF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, activador del plasminógeno de tipo tisular (IPA), leptina, hirudina, urocinasa, DNasa humana, insulina, proteína de superficie de hepatitis B (HbsAg), toxina diftérica-IL-2 quimérica, gonadotropina coriónica humana (hCG), peroxidasa tiroidea (TPO), alfa-galactosidasa, alfa-L-iduronidasa, beta-glucosidasa, alfa-galactosidasa A, a-glucosidasa ácida (maltasa ácida), antitrombina III (AT III), hormona foliculoestimulante (FSH), péptido I similar a glucagón (GLP-1), péptido 2 similar a glucagón (GLP-2), factor de crecimiento de fibroblastos 7 (FGF-7), factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21), factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF-23), factor X, factor XIII, procineticina, extendina-4, CD4, receptor del factor de necrosis tumoral (TNF-R), ligando I de glucoproteína para P-selectina (PSGL-I) a-CD20, complemento, transferrina, molécula de adhesión celular dependiente de glucosilación (GlyCAM), molécula de adhesión celular neural (N-CAM), proteína de fusión del receptor de INF-región Fc de IgG. Dichas proteínas también incluyen anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales contra uno cualquiera de: virus respiratorio sincicial, proteína F del virus respiratorio sincicial, INF-a, glucoproteína llb/llla, CD20, VEGF-A, PSGL-1, Cd 4, a-CD3, EGF, antígeno carcinoembrionario (CEA), TNFa y receptor de IL-2.
Los procedimientos de la invención pueden ser adecuados para producir composiciones mono-PEGiladas de proteínas tales como hormonas, citocinas, enzimas o anticuerpos. Dicha proteína puede ser eritropoyetina. La proteína puede ser interferón-a-2a o interferón-a-2b. La proteína puede ser el factor estimulante de colonias de granulocitos, hormona del crecimiento humana o urato oxidasa.
La invención es, en particular, útil para proteínas terapéuticas que tienen una semivida relativamente corta, porque la PEGilación incrementa la semivida en circulación in vivo. En general, las hormonas y citocinas tienen una semivida relativamente corta. Las moléculas biológicas más pequeñas tienden a tener una semivida relativamente corta. El perfil farmacocinético de moléculas biológicas relativamente pequeñas se puede mejorar por PEGilación y así la presente invención también puede ser, en particular, útil para proteínas terapéuticas relativamente pequeñas. En general, es más probable que las proteínas y péptidos menores de aproximadamente 70 kDa se eliminen por filtración renal que las proteínas más grandes. Las moléculas biológicas o proteínas, más pequeñas se pueden definir como aquellas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa. La eritropoyetina tiene un peso molecular de aproximadamente 37 kDa. La invención es útil para proteínas terapéuticas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa (en su forma no PEGilada). La invención es útil para proteínas terapéuticas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa o 40 kDa, o que tienen un peso molecular de aproximadamente 10-70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa o 30-40 kDa. La invención es útil para hormonas o citocinas que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa o 40 kDa, o que tienen un peso molecular de aproximadamente 10­ 70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa o 30-40 kDa.
La proteína puede ser un anticuerpo. Un anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo biológicamente funcional. Los fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab', F(ab')2 , scFv, (scFv)2 , anticuerpos de dominio único (sdAb o dAB), fragmentos de la región determinante de la complementariedad, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos monocatenarios, minicuerpos, diacuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Muchos fragmentos de anticuerpo tienen una semivida in vivo relativamente corta, lo que resulta de su tamaño relativamente pequeño y de que ya no tienen una región Fc. La invención es, en particular, útil para fragmentos de anticuerpo que tienen un tamaño relativamente pequeño, tales como anticuerpos de dominio único, Fab, Fab' y scFv. La invención es útil para fragmentos de anticuerpo que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 70 kDa, 60 kDa, 50 kDa o 40 kDa, o que tienen un peso molecular de aproximadamente 10­ 70 kDa, 20-60 kDa, 20-50 kDa o 30-40 kDa.
Las composiciones de proteína mono-PEGilada se pueden formular como composiciones farmacéuticas. Las composiciones de proteína mono-PEGilada producidas por los procedimientos divulgados en el presente documento se pueden formular con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y/o se pueden formular en un tampón fisiológicamente aceptable, tal como solución salina fisiológica. Las sales y/o tampones usados en los tampones de equilibrado, lavado o elución de la etapa de CIH se pueden retirar antes de formular la composición de proteína mono-PEGilada como una composición farmacéutica. Por ejemplo, las composiciones de proteína mono-PEGilada se pueden dializar. La proteína mono-PEGilada de la composición de proteína mono-PEGilada se puede liofilizar. La proteína mono-PEGilada de la composición de proteína mono-PEGilada se puede aislar y reformular en una composición farmacéutica.
Los procedimientos de lo divulgado en el presente documento pueden ser procedimientos a escala industrial. Un procedimiento a escala industrial puede ser un procedimiento que produzca al menos aproximadamente 5 g, 10 g, 25 g, 50 g, 100 g, 250 g o 500 g por lote o por ciclo. Un lote o ciclo en este contexto puede ser un procedimiento que comprende todos las etapas a) a d) como se divulga en el presente documento. Un procedimiento a escala industrial puede ser un procedimiento en el que el volumen de la primera mezcla (que comprende proteína no PEGilada, mono-PEGilada y oligo-PEGilada) que se somete a la etapa de CIA es de al menos 100 l, 500 l, 1000 l, 5000 l, 10000 l, 50000 l o 100000 l. La invención incluye la combinación de los aspectos y rasgos característicos preferentes descritos excepto cuando una combinación de este tipo es claramente inadmisible o se evita expresamente.
Los rasgos característicos divulgados en la descripción anterior, o en las siguientes reivindicaciones, o en los dibujos adjuntos, expresados en sus formas específicas o en términos de un medio para realizar la función divulgada, o un procedimiento para obtener los resultados divulgados, según sea apropiado, se pueden utilizar, por separado, o en cualquier combinación de dichos rasgos característicos para realizar la invención en diversas formas de la misma.
Aunque la invención se ha descrito junto con los modos de realización ejemplares descritos anteriormente, muchas modificaciones y variaciones equivalentes serán evidentes para los expertos en la técnica cuando se les proporcione la presente divulgación. En consecuencia, los modos de realización ejemplares de la invención expuestos anteriormente se consideran ilustrativos y no limitantes. El alcance de protección se define en las reivindicaciones adjuntas.
Para evitar cualquier duda, las explicaciones teóricas proporcionadas en el presente documento se proporcionan con el propósito de mejorar el entendimiento de un lector. Los autores de la invención no desean verse vinculados a ninguna de estas explicaciones teóricas.
Los encabezados de sección usados en el presente documento solo son por motivos de organización y no se deben entender como limitantes de la materia objeto descrita.
Los aspectos y modos de realización de la presente invención se ilustrarán ahora, a modo de ejemplo, con referencia a las figuras adjuntas. Otros aspectos y modos de realización serán evidentes para los expertos en la técnica.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, incluyendo las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra "comprenden" e "incluyen", y variaciones tales como "comprende", "que comprende" y "que incluye", implican la inclusión de un número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas indicados, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
Cabe destacar que, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes al plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Los intervalos se pueden expresar en el presente documento como de "aproximadamente" un valor particular y/o a "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa un intervalo de este tipo, otro modo de realización incluye de un valor particular y/o al otro valor particular. De forma similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, por el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otro modo de realización. El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico es opcional y quiere decir por ejemplo /-10 %.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos realizados y los resultados logrados, se proporcionan solo con propósitos ilustrativos y no se debe interpretar que incluyen todos los modos de realización posibles junto con el alcance total de equivalentes a los que acreditan dichas reivindicaciones.
Ejemplo 1
Se PEGiló EPO usando reactivo de PEG activado con NHS (peso molecular de aproximadamente 30 kDa) a pH 8,0 en bicina 25 mM y Na2SO47,5 mM para proporcionar una primera mezcla que comprende EPO no PEGilada, EPO mono-PEGilada y EPO oligo-PEGilada.
La primera mezcla se sometió a CIA a pH 8,0, bicina 25 mM, Na2SO47,5 mM. La resina de CIA fue Toyopearl SuperQ 650M. Esto tiene una capacidad de unión dinámica para EPO de aproximadamente 34 g/l. La elución se llevó a cabo por una elución por etapas a bicina 25 mM, sulfato de sodio 35 mM a pH 8. La EPO no PEGilada recuperada por elución se recicló en una reacción de PEGilación posterior, con un producto (una "primera mezcla" posterior) que se sometió a una segunda etapa de CIA. Este procedimiento se repitió de nuevo, de modo que el procedimiento incluyó tres ciclos de etapas de PEGilación y CIA.
En la figura 4 se muestra un cromatógrafo que muestra la elución de proteína en una etapa de CIA. En la figura 5 se muestran tres cromatógrafos que muestran las tres etapas de CIA, lo que muestra que la cantidad de EPO en el segundo ciclo es menor que en el primero, y la cantidad de EPO en el tercer ciclo es menor que en el segundo.
La tabla 1 muestra los contenidos de las diversas composiciones intermedias. El producto de PEGilación es la "primera mezcla", el agrupamiento de productos es la solución de flujo continuo de CIA y el agrupamiento de EPO es el eluido de CIA.
Tabla 1
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A continuación, se investigó la capacidad de CIH para separar EPO mono-PEGilada de EPO oligo-PEGilada tanto en modo de unión y elución como en modo de flujo continuo.
En el modo de unión y elución, la resina de CIH era Toyopearl Phenyl-650M. La resina se equilibró con bicina 25 mM y Na2SO4500 mM a pH 8,0. La mezcla aplicada a la resina comprendía EPO no PEGilada, EPO mono-PEGilada y EPO oligo-PEGilada para propósitos de prueba. La mezcla se acondicionó con bicina y 25 mM Na2SO4 500 mM a pH 8,0 y se aplicó a la resina de CIH. Se aplicó un gradiente de elución de concentración de sal decreciente, Na2SO4 de 500 mM a 0 mM. La figura 6 es un cromatograma que muestra que la EPO está en el flujo continuo y que la EPO mono-PEGilada se eluye con un contenido relativamente alto en sal mientras que la EPO oligo-PEGilada se eluye con un contenido relativamente bajo en sal.
En el modo de flujo continuo, la resina de CIH era Toyopearl Phenyl-650M. La resina se equilibró con bicina 25 mM y Na2SO4 390 mM a pH 8,0. La mezcla aplicada a la resina comprendía EPO mono-PEGilada y EPO oligo-PEGilada, no contenía cantidades significativas de EPO no PEGilada y es representativa por lo tanto de una “segunda mezcla” de acuerdo con la invención. La mezcla se acondicionó con bicina y Na2SO4 a pH 8,0 y se aplicó a la resina de CIH. La concentración de sal se ajustó a 390 mM. La figura 7 es un cromatograma que muestra que EPO mono-PEGilada está en el flujo continuo. La EPO oligo-PEGilada se eluyó usando un gradiente de sal decreciente.
Ejemplo 2
PEGilación de EPO
La solución madre de EPO se descongeló, se concentró a 6,5 g/l usando filtros centrífugos Centricon de 3 kDa y se tamponó en bicina 25 mM, pH 8. A continuación, se transfirieron 7,7 ml de esta solución a un tubo Falcon de 50 ml y se mezclaron con 0,3 ml de tampón bicina 25 mM, pH 8. Se pesaron 96 mg de reactivo PEG y se disolvieron en 3 ml de HCl 1 mM para preparar la solución de PEGilación.
La reacción de PEGilación comenzó por adición de 2 ml de solución de PEGilación (peso molecular de aproximadamente 30 kDa) a la solución de EPO. La reacción se llevó a cabo en un baño de agua a 20 °C durante 50 minutos.
PEGilación cíclica y purificación usando cromatografía iónica
Como primera etapa, se produjo EPO PEGilada como se explica anteriormente. Se transfirió 1 ml de la solución de EPO PEGilada a un tubo Eppendorf, y los 9 ml restantes se inyectaron en un Superloop de 150 ml usando una jeringa de 50 ml y comenzó la cromatografía de intercambio aniónico.
Se usó Toyopearl SuperQ-650M de 16 ml con un diámetro de 1 cm como columna de cromatografía de intercambio aniónico. La columna se equilibró con tampón bicina 25 mM, Na2SO4 7,5 mM, pH 8. La elución se llevó a cabo por una elución por etapas a bicina 25 mM, sulfato de sodio 35 mM a pH 8. El cromatograma correspondiente se muestra en la figura 8A.
Se extrajo 1 ml de fracción 1B3 y se midió su composición por HPLC. Posteriormente, se combinaron las fracciones 1B3 a 1C1, y también se midió la composición de una muestra de 1 ml de esta fracción mixta por RP HPLC. La concentración de proteína se determinó fotométricamente, y a un coeficiente de extinción de 1,25 fue de 0,097 g/l. Esta fracción mixta (eluido de CIA) es de la etapa de elución.
Los 21 ml restantes de la fracción mixta se transfirieron a un tubo Falcon de 50 ml y se colocaron en un baño de agua a 20 °C para una nueva PEGilación. Se añadió 1 ml de una solución de reactivo de PEGilación de 26,89 g/l y comenzó la segunda reacción de PEGilación.
El eluido de CIA (fracción de EPO) está en las mismas condiciones (sulfato de sodio 35 mM) que el tampón de elución de la primera cromatografía, explicado anteriormente. La solución de reacción se diluyó en un factor de 4,66 con tampón bicina 25 mM después de 50 min y se ajustó por tanto a las condiciones de equilibrado. La muestra de 97,9 ml resultante se inyectó de nuevo en la Superloop de 150 ml y comenzó la segunda cromatografía. El procedimiento de cromatografía se cambió solo en términos del mayor volumen de muestra. Todos los demás parámetros e ingredientes permanecieron sin cambios. El cromatograma correspondiente se muestra en la figura 8B.
Las fracciones 2A3 a 2A5 se agruparon de nuevo y el procedimiento anterior se repitió como un tercer ciclo. Las fracciones 1A1 a 1C5 de la tercera cromatografía se combinaron y concentraron usando filtros centrífugos Centricon de 3 kDa. El concentrado y los agrupamientos de las fracciones 2A1 a 2A3 se midieron por RP-HPLC. El cromatograma correspondiente se muestra en la figura 8C.
Todos los volúmenes pipeteados de las reacciones de PEGilación y las etapas de dilución se enumeran en la tabla 2.
Tabla 2 - Volúmenes de ingredientes y muestras de partida
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Resultados y análisis
Los resultados medidos del análisis de RP HPLC se muestran en la tabla 3. El porcentaje en masa de EPO en los agrupamientos de EPO PEGilada cíclicamente es en promedio de aproximadamente un 95 %.
Tabla 3 - Composición antes y después de la reacción de PEGilación y separación cromatográfica
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El equilibrio de masas para cada ciclo se enumera en la tabla 4, así como para todo el procedimiento. Cabe destacar que la información sobre los agrupamientos de productos no se basa en valores medidos, sino que se ha calculado.
Tabla 4 - Equilibrio de masas
Figure imgf000036_0002
Existió un 95,5 % de recuperación sobre todas las muestras al final del procedimiento. Se observó una pérdida de un 4,5 % de proteína total debido a muestreo y análisis. El agrupamiento de EPO 1 y el agrupamiento de EPO 2 se consumieron en la PEGilación 2 y 3. Un 63,6 % de EPO inicial se convirtió en EPO mono-PEG. 82,0 % de contenido de EPO mono-PEG en el agrupamiento intermedio.
En base al equilibrio de masas, se puede observar que se podían preparar 32,5 mg de EPO mono-PEGilada a partir de 50 mg de EPO no PEGilada usada, que existe como una mezcla de un 1,4 % de EPO, 82,0 % de EPO mono-PEG y 16,6 % de formas oligo. Por tanto, la etapa de CIA produjo una solución (solución de flujo continuo de CIA) que comprendía un 82 % de EPO mono-PEGilada (82 % de pureza).
El rendimiento de reacción de EPO mono-PEG es de un 63,6 %. Es decir, de la cantidad de proteína EPO al comienzo del procedimiento (50 mg) un 63,6 % se convirtió en EPO mono-PEGilada (32,5 mg). En comparación con el procedimiento de la técnica anterior del documento WO 2009/010270, en el que la reacción de PEGilación se lleva a cabo solo una vez con un rendimiento de aproximadamente un 44 %, esto corresponde a un incremento en el rendimiento de aproximadamente un 44 %.
Por motivos técnicos, en este experimento no fue posible retirar toda la EPO del flujo continuo en la CIA después de la 2.a reacción de PEGilación. La composición resultante de la 2.a reacción por lo tanto es diferente de los valores esperados. La PEGilación 1 y 3 proporcionó aproximadamente un 50 % de EPO, un 40 % de EPO mono-PEG y <10 % de EPO oligo-PEG. La 2.a reacción de PEGilación fue menos eficaz, produciendo solo un 33 % de EPO mono-PEG y un 5 % de EPO oligo-PEG.
Estos resultados demuestran que la CIA puede aislar y recuperar EPO sin reaccionar de la mezcla de reacción de PEGilación sin muchas de las formas PEGiladas. La suma de las formas PEGiladas en la fracción de EPO recuperada es de aproximadamente un 5 %; esto se podría deber al hecho de que se sobredimensionó la columna de CIA empleada en este experimento particular. Cuando se dimensiona para ajustar, se espera que la capacidad para especies PEGiladas disminuya debido a los efectos de desplazamiento o la competencia por ligandos. Estos resultados también muestran que en el ciclo 1 y ciclo 3 es posible retirar EPO casi cuantitativamente aplicando cromatografía de intercambio aniónico. El producto intermedio pasa a través de la columna en el flujo continuo y normalmente es de una composición de aproximadamente un 80 % de EPO mono-PEG y un 20 % de EPO oligo-PEG.
Ejemplo 3
PEGilación cíclica, retirada de eritropoyetina por cromatografía CIA y purificación de EPO mono-PEG por CIH
El objetivo de este experimento es PEGilar EPO en 3 ciclos y separar los productos de reacción (EPO no PEGilada, EPO PEGilada simple (EPO mono-PEG) y formas oligo-PEGiladas de EPO) usando cromatografía de intercambio aniónico (CIA) y CIH.
Para retirar la EPO en la fase de CIA, se usó Toyopearl SuperQ-650M de Tosoh Bioscience como adsorbente. Este es un intercambiador de aniones fuerte. Para separar e Po mono-PEG de las formas oligo en la fase de CIH, se usó Toyopearl Phenyl-650M de Tosoh Bioscience.
Diseño de la columna de CIA
Una columna con un diámetro interior de 7 mm y una altura de lecho de 100 mm se rellenó con material adsorbente Toyopearl SuperQ-650M y se hizo funcionar a un caudal de 200 cm/h (1,28 ml/min), dando como resultado un tiempo de etapa de procedimiento de aproximadamente 30 min a un volumen de columna de 3,847 ml.
PEGilación cíclica y CIA
Se usó una solución madre de EPO con una concentración de 12,5 g/l en bicina 25 mM, Na2SO47,5 mM. Se usó un volumen de partida de 18 ml de esta solución madre, correspondiente a 225 mg de EPO.
Para la primera reacción de PEGilación, se mezclaron 18 ml de solución madre de EPO con 22,5 ml de bicina 25 mM, Na2SO47,5 mM y se colocaron en un tubo Falcon de 50 ml.
Se pesaron 328 mg de reactivo PEG (peso molecular de aproximadamente 30 kDa) en un tubo Falcon de 15 ml y se disolvieron en 4,97 ml de HCl 1 mM.
Para comenzar la reacción, se pipetearon 4,5 ml de la solución de reactivo de PEG en la solución de EPO de 40,5 ml.
La mezcla de reacción se mezcló a 300 rpm y la temperatura se ajustó a 20 °C por medio de un criostato.
La reacción se ejecutó durante 60 min. A continuación se midió la concentración fotométricamente a 280 nm y se tomó una muestra de 250 pl. La concentración fue de 5,56 g/l. La conductividad se midió a partir de la solución restante. Fue de 2,19 mS/cm, por lo que no se realizó ningún acondicionamiento a las condiciones de equilibrado de la cromatografía AEX (2,21 mS/cm). La solución de 44,8 ml restante se purificó por medio de CIA. Se equilibró con bicina 25 mM, Na2SO47,5 mM, pH 8.
La elución se llevó a cabo por etapas con bicina 25 mM, Na2SO435 mM. Las fracciones 1B1-1B4 se combinaron entre sí para preparar 16,5 ml y a continuación en el presente documento se denominarán agrupamiento de EPO 1. La concentración del agrupamiento de EPO 1 se determinó fotométricamente en 5,263 g/l. Se tomó una muestra de 200 pl.
Las fracciones 1A1-1A5 se combinaron para preparar 62,17 ml y a continuación en el presente documento se denominan agrupamiento de productos 1. La concentración de esto fue de 2,27 g/l. Se tomó una muestra de 500 pl. El volumen restante del agrupamiento de EPO 1 se transfirió a un tubo Falcon de 50 ml para una segunda PEGilación. Se pesaron 164,73 mg de reactivo PEG y se disolvieron con 2,4 ml de HCl 1 mM. Se añadieron 1,62 ml de esta solución al agrupamiento de EPO 1 y comenzó la segunda reacción de PEGilación. La reacción se llevó a cabo de nuevo a 20 °C durante 60 min. A continuación se midió la concentración, se tomó una muestra de 250 pl. La concentración fue de 4,73 g/l.
La conductividad de la solución restante se ajustó a una conductividad de 2,1 mS/cm usando 22 ml de tampón bicina 25 mM, pH 8 y se purificó por cromatografía.
Las fracciones 1B2-1B4 de la segunda cromatografía se combinaron para formar el agrupamiento de EPO 2. El volumen fue de 15 ml. Se tomó una muestra de 500 pl. La medición de concentración dio una concentración de 2,5 g/l.
Las fracciones 1A1-1A5 se combinaron con 62,7 ml del agrupamiento de productos 2. Se tomó una muestra de 2 ml. La concentración fue de 0,75 g/l.
El volumen restante del agrupamiento de EPO 2 se transfirió a un tubo Falcon de 50 ml. Se pesaron 119,4 mg de reactivo PEG y se disolvieron con 1,9 ml de HCl 1 mM. Se añadieron 1,72 ml de esta solución al agrupamiento de EPO 2 y se comenzó la tercera reacción de PEGilación. Se llevó a cabo de nuevo a 20 °C. Después de un tiempo de reacción de 60 min, se determinó la concentración y se tomó una muestra de 500 pl. La concentración fue de 2,8 g/l.
El producto de reacción se ajustó de nuevo a las condiciones de equilibrado por medio de tampón bicina 25 mM y se purificó por cromatografía.
Las fracciones 1C2-1C5 se combinaron para preparar 15 ml del agrupamiento de EPO 3. De esto se tomó una muestra de 4 ml. La concentración fue de 0,429 g/l.
Las fracciones 1A1-1C1 se combinaron en 160,5 ml del agrupamiento de productos 3. La concentración fue de 0,15 g/l. Se tomó una muestra de 10 ml.
Purificación de EPO mono-PEG usando CIH
Se usó una columna de 220 mm de altura que tiene un diámetro interno de 10 mm. El adsorbente usado fue Toyopearl Phenyl-650M de Tosoh. El volumen de la columna fue de 17,27 ml. Se hizo funcionar con un caudal de 150 cm/h. Esta columna se usó para extraer el producto objetivo EPO mono-PEG de una mezcla de EPO mono-PEG y oligo.
Para este propósito, se llevaron a cabo dos experimentos. En el primero, EPO mono-PEG y oligo se unieron al material de la columna y a continuación se eluyeron selectivamente por medio de un gradiente. En el segundo, las formas oligo se unieron al material de la columna mientras que la e Po mono-PEG no.
Separación en modo de unión y elución de CIH
Del agrupamiento de productos 1 descrito anteriormente (una "segunda mezcla" de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento; concentración de proteína de 2,27 g/l) se tomaron 15 ml y se ajustaron a una conductividad de 56 mS/cm con 20 ml de solución de bicina 25 mM, Na2SO4 1 M, pH 8. Esta muestra se distribuyó completamente a través de un Superloop de 150 ml.
Para equilibrar la columna Phenyl-650M, se usó tampón bicina 25 mM, Na2SO4500 mM, pH 8. La elución se llevó a cabo usando un gradiente de Na2SO4500 mM a Na2SO40 mM sobre 15 CV. El cromatograma correspondiente se muestra en la figura 9.
Las fracciones 1A1-1B1, 1B5-2A3 y 2A4 a 2B4 se agruparon cada una y se analizó para determinar su composición por RP-HPLC.
Separación en modo de flujo continuo de CIH
Los 62,7 ml completos del agrupamiento de productos 2 (una "segunda mezcla" de acuerdo con los procedimientos divulgados en el presente documento) se usaron como muestra para la separación, correspondientes a un nivel de proteína de 47,03 mg, compuesto por un 0,58 % de EPO, 79,9 % de EPO mono-PEG y 19,52% de formas oligo. La conductividad de la muestra se ajustó por medio de tampón bicina 25 mM, Na2SO4 1 M, pH 8, a un objetivo a una conductividad de 50 mS/cm, y se inyectó por medio de un Superloop de 150 ml.
La resina de CIH se equilibró con bicina 25 mM, Na2SO4390 mM. La elución se llevó a cabo como un gradiente de Na2SO4390 mM a Na2SO40 mM. El cromatograma correspondiente se muestra en la figura 10.
En la práctica, la muestra se ajustó involuntariamente a 56 mS/cm (en lugar del objetivo de 50 mS/cm). Por lo tanto, una curva de ruptura en etapas se puede observar en la figura 10. Al principio, solo EPO está en el flujo continuo. Después de aproximadamente 80 ml, la señal UV aumenta a aproximadamente 120 mUA debido a una ruptura de la EPO mono-PEG. Cuando la conductividad disminuye en la transición de carga al equilibrado posterior a la carga, se eluye un pico de EPO mono-PEG unida anteriormente. Las formas EPO oligo-PEG se eluyen en el siguiente gradiente. No obstante, se ha demostrado la separación de EPO mono-PEG de EPO oligo-PEG. El modo de flujo continuo no es adecuado si los niveles de EPO sin reaccionar son mayores que el valor objetivo para las especificaciones de producto.
Resultados y análisis
PEGilación cíclica y CIA
La tabla 5 muestra la composición de las muestras individuales, así como un equilibrio de las cantidades de proteína.
Tabla 5 - Composición, masas y volúmenes de las muestras individuales durante el procedimiento
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El primer ciclo de la CIA se sobrecargó de forma accidental. Debido a esto, la recuperación de EPO sin reaccionar en este experimento es solo de aproximadamente un 78 %. Debido a que la columna se ha sobrecargado con EPO, no existe forma PEGilada en el agrupamiento de elución. Eso corrobora que el dimensionamiento apropiado de la columna de CIA reduce el contenido de formas PEGiladas en el agrupamiento de elución de CIA y de este modo maximiza el rendimiento de formas PEGiladas en el agrupamiento intermedio. Las tandas de CIA después de la PEGilación 2 y 3 no se cargan totalmente con EPO y por lo tanto existe una pequeña cantidad de EPO PEGilada en el agrupamiento de elución, en ambos casos <2 %.
Los resultados de la PEGilación 1 y 2 muestran la consistencia del resultado de la reacción. En las condiciones elegidas, los resultados son de aproximadamente un 50 % de EPO, 40 % de EPO mono-PEG y <10 % de EPO oligo-PEG.
La PEGilación 3 como PEGilación final usa diferentes condiciones para favorecer la formación del máximo contenido de EPO mono-PEG que sea posible. Esto funcionó bien con un contenido de EPO mono-PEG de un 46%.
La composición de cada uno de los agrupamientos de productos intermedios es diferente. El agrupamiento de la primera operación de flujo continuo consiste en aproximadamente un 10 % de EPO (debido la ruptura mencionada anteriormente), un 72 % de EPO mono-PEG y un 16 % de EPO oligo-PEG. Sin la ruptura de EPO, la composición habría sido idéntica a la de la tanda 2 (80 % EPO mono-PEG y 20 % EPO oligo-PEG). La 3.a tanda empleó diferentes condiciones de PEGilación, lo que dio como resultado un mayor contenido de EPO oligo-PEG en la mezcla de reacción. Esto se traduce en una composición de agrupamiento de un 59 % de EPO mono-PEG y un 41 % de EPO oligo-PEG.
El rendimiento total de EPO mono-PEG en el agrupamiento intermedio después de 3 ciclos de “reacción de PEGilación más recuperación de EPO por CIA” es de un 68,4 %. Esto ya es > 50 % mejor que el procedimiento original, pero podría ser incluso mejor si no se hubiera perdido una cantidad significativa de EPO durante la carga de flujo continuo de la primera tanda de CIA.
Purificación de EPO mono-PEG por CIH - Separación en modo unión y elución
La tabla 5 muestra los resultados del análisis de RP HPLC.
Tabla 5 - Datos de análisis de RP-HPLC para agrupamientos de CIH en modo de unión y elución
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El uso del agrupamiento intermedio de la tanda de CIA 1 que contenía EPO se usó para mostrar la realización de la etapa de purificación final por cromatografía de interacción hidrófoba. El agrupamiento de EPO y EPO mono-PEG son un 100 % puros. Todavía se puede encontrar una pequeña cantidad de EPO mono-PEG en el agrupamiento EPO oligo-PEG.
Purificación de EPO mono-PEG por CIH - Separación en modo de flujo continuo
Debido a las bajas concentraciones de proteína de las fracciones individuales, no se pudieron generar resultados significativos por medio de RP-HPLC. Sin embargo, el cromatograma muestra que se logró la separación de EPO mono-PEGilada de las formas no PEGilada y oligo-PEGilada.
Referencias
Anteriormente se cita una serie de publicaciones para describir y divulgar más completamente la invención y el estado de la técnica al que pertenece la invención. Las citas completas de estas referencias se proporcionan a continuación.
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Fee y Van Alstine, Chemical Engineering Science, 2016, 61,924-939
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Vlckova J. Chromatography A (2008) 145-152.
Documento WO 2009/010270
Documento WO 2012/035037
Para técnicas de biología molecular estándar, véase Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3.a ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para producir una composición de proteína mono-PEGilada que comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada, comprendiendo el procedimiento:
a) proporcionar una primera mezcla que comprende proteína no PEGilada y proteína PEGilada, en la que la proteína PEGilada comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada
b) someter la primera mezcla a una etapa de cromatografía de intercambio iónico (CII) para proporcionar una solución de flujo continuo de CII en la que la fracción de proteína PEGilada se incrementa con respecto a la primera mezcla; comprendiendo la etapa de CII aplicar la primera mezcla a un material de CII en condiciones adecuadas para unir proteína no PEGilada;
c) recoger la solución de flujo continuo de CII de la etapa b) para proporcionar una segunda mezcla que comprende proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada; y
d) someter la segunda mezcla a una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) para proporcionar una composición de proteína mono-PEGilada en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, en la que la composición de proteína mono-PEGilada comprende al menos aproximadamente un 90 % de proteína mono-PEGilada.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la proteína es una hormona, una citocina, una enzima o un anticuerpo.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la proteína es eritropoyetina.
4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de cromatografía de intercambio iónico (CII) es una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (CIA).
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material de CII tiene una capacidad de unión para la proteína PEGilada de menos de aproximadamente 1,5 g/l.
6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que:
i. la primera mezcla comprende menos de un 25 % de proteína oligo-PEGilada; y/o
ii. la solución de flujo continuo de CII comprende al menos un 90 % de proteína PEGilada; y/o
iii. la composición de proteína mono-PEGilada comprende al menos aproximadamente un 95 %, 98 %, 99 % o 99,9 % de proteína mono-PEGilada.
7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa a) comprende además realizar una reacción de PEGilación que comprende hacer reaccionar la proteína no PEGilada con un reactivo de PEGilación.
8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la reacción de PEGilación se realiza a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0, y en el que la proporción molar PEG/proteína es de aproximadamente 0,6 - 1,0.
9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que comprende
realizar un primer ciclo que comprende las etapas a), b) y c), en el que la etapa b) comprende además eluir proteína no PEGilada del material de CII para proporcionar un eluido de CII, y
realizar un segundo ciclo de etapas a), b) y c), en el que la proteína no PEGilada eluida en la etapa b) del primer ciclo se añade a la reacción de PEGilación de la etapa a).
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que eluir la proteína no PEGilada del material de CII usa un tampón de elución que comprende sal menos de o igual a aproximadamente 45 mM.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en el que el procedimiento comprende tres, cuatro o cinco ciclos, y en el que la etapa b) de cada ciclo comprende eluir proteína no PEGilada del material de CII para proporcionar un eluido de CII, y en el que la proteína no PEGilada eluida en la etapa b) se añade a la reacción de PEGilación de la etapa a) en el siguiente ciclo.
12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el eluido de CII de la etapa b) de un ciclo se añade directamente a la reacción de PEGilación de la etapa a) del siguiente ciclo.
13. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en el que la proteína no PEGilada eluida en la etapa b) de un ciclo se añade a la reacción de PEGilación de la etapa a) del siguiente ciclo, y en el que también se añade proteína no PEGilada recién obtenida a la etapa a) para mantener las condiciones de reacción de PEGilación sustancialmente constantes en la etapa a) de cada ciclo.
14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende realizar dos o más ciclos de etapas a), b) y c), en el que
la etapa c) comprende además agrupar la solución de flujo continuo recogida de cada etapa de CII para proporcionar una segunda mezcla que es una segunda mezcla agrupada, y en el que
la etapa d) comprende someter la segunda mezcla a una etapa de CIH.
15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de CII es una etapa de CIA y en el que
i. el material de CIA es Toyopearl Super Q 650 M; y/o
ii. la etapa de CIA se realiza a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; y/o
iii. la etapa de CIA se realiza a una conductividad de aproximadamente 1,0 a 3,0 mS/cm; y/o
iv. la primera mezcla se aplica al material de CIA como una solución de carga de CIA que comprende bicina aproximadamente 10 - 30 mM y Na2SO4 aproximadamente 1 - 10 mM.
16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa d) comprende someter la segunda mezcla a una etapa de CIH en modo de flujo continuo para proporcionar una solución de flujo continuo de CIH en la que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, comprendiendo la etapa de CIH aplicar la segunda mezcla a un material de CIH en condiciones adecuadas para unir la proteína oligo-PEGilada, en el que el flujo continuo de CIH proporciona la composición de proteína mono-PEGilada.
17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la etapa d) comprende someter la segunda mezcla a una etapa de CIH en modo de unión y elución para proporcionar un eluido de CIH en el que la fracción de proteína mono-PEGilada se incrementa con respecto a la segunda mezcla, comprendiendo la etapa de CIH
aplicar la segunda mezcla a un material de CIH en condiciones adecuadas para unir proteína mono-PEGilada y proteína oligo-PEGilada,
eluir la proteína mono-PEGilada del material de CIH para proporcionar un eluido de CIH, en el que el eluido de CIH proporciona la proteína mono-PEGilada.
18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16, en el que
i. el material de CIH es Toyopearl Phenyl 650M; y/o
ii. la etapa de CIH se realiza a un pH de aproximadamente 7,0 a 9,0; y/o
iii. la etapa de CIH se realiza a una conductividad de aproximadamente 30-40 mS/cm; y/o
iv. la segunda mezcla se aplica al material de CIH como una solución de carga de CIH que comprende bicina aproximadamente 25 mM y Na2SO4 aproximadamente 390 mM.
19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que
i. la etapa de CII y la etapa de CIH se realizan sustancialmente al mismo pH; o
ii. la reacción de PEGilación, la etapa de CII y la etapa de CIH se realizan sustancialmente al mismo pH.
20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína mono-PEGilada comprende un residuo de PEG que tiene un peso molecular de al menos aproximadamente 20 kDa.
21. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además formular la composición de proteína con un vehículo farmacéuticamente aceptable para proporcionar una composición farmacéutica.
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