JP5814978B2 - ペグ化ポリペプチドの精製 - Google Patents
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Description
タンパク質は今日の医学ポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。ヒトへの適用のために、全ての治療タンパク質は別個の基準を満たさなければならない。生物製剤のヒトに対する安全性を確実にするために、産生プロセスの間に蓄積する副産物を特に除去しなければならない。規制仕様を満たすために、1つ以上の精製工程を製造プロセスの後に続けなければならない。とりわけ、純度、処理量、及び収率が、適切な精製プロセスの決定において重要な役割を果たす。
本発明は、モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供する工程、2つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する工程、及び第2の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収する工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法であって、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する方法を含む。
a)モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンの混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第1のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第1の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
b)モノペグ化エリスロポエチンを、通過流(through flowing)緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第1の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、モノペグ化エリスロポエチンの割合が、工程a)の適用された混合物と比較して増加する工程、
c)回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記モノペグ化エリスロポエチンが第2のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第2のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第1のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
d)実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
を含む。
a)ペグ化試薬を使用することによりエリスロポエチンをペグ化する工程、
b)ペグ化エリスロポエチンを2つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製する工程であって、第1及び第2の陽イオン交換クロマトグラフィーが同じ型の陽イオン交換材料を用いる工程、
c)モノペグ化エリスロポエチンを、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な形態で回収する工程
を含む。
本発明は、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用する、2つの陽イオン交換クロマトグラフィー工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法を含む。
a)分子量が20kDa〜40kDaの活性化ペグ化試薬を使用してエリスロポエチンをペグ化する工程、
b)工程a)において得られるペグ化エリスロポエチンを2つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程で精製する工程であって、第1及び第2の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が同じ型の陽イオン交換材料を用いる工程、
c)モノペグ化エリスロポエチンを、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な形態で回収する工程
を含む方法を提供することが本発明の局面である。
[式中、R及びmは上記で定義するとおりである]である。一実施態様において、PEG種はメトキシポリ(エチレングリコール)酪酸のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。「アルコキシ」という用語はアルキルエーテル基を指し、ここで「アルキル」という用語は、最高4個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖アルキル基、例えば、メトキシ、エトキシ、n−プロポキシなど、好ましくはメトキシを意味する。
a)モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチン、及び低分子量形態の混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第1のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第1の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
b)モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第1の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、回収された溶液中のモノペグ化エリスロポエチンの相対含量が、工程a)の適用された混合物と比較して増加する工程、
c)工程b)からの回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記エリスロポエチンが第2のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第2のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第1のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
d)実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
である。
SE−HPLC
SE−HPLCによって、その見掛けの分子量に従ってタンパク質が分離される。それゆえ、この方法によって、モノペグ化エリスロポエチン、低分子量形態及びフラグメント、ポリペグ化形態及びエリスロポエチンのより高度な凝集体の存在を検出できる。HPLCには220nm検出器及びSuperose 6 HRカラム(寸法10×300mm、Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-0537-01)又はSuperose 6 10/300 GLカラム(Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-5172-01)が備えられている。カラムを、均一溶媒条件下で、室温で、約0.4ml/分の流速を使用して操作する。移動相緩衝液は、300mM塩化ナトリウムを含むpH6.8の50mMリン酸ナトリウム緩衝液である。使用するHPLCシステムに応じて、方法を、100μL又は500μLのいずれかの試料適用容積で実施できる。試料を、移動相緩衝液で、約0.5mg/mL(100μL負荷)又は約0.1mg/mL(500μL負荷)のタンパク質濃度に希釈する。タンパク質濃度が0.1mg/mL未満の試料を、未希釈で使用できる。溶出タンパク質を検出器波長220nmで検出する。
エリスロポエチンの発酵及び精製
エリスロポエチンを、例えば、WO01/87329に従って産生し、そしてWO96/135718において報告されるように精製できる。
二官能性試薬でのエリスロポエチンのペグ化
a)エリスロポエチンの活性化
ブロック化チオール基、SATA(スクシンイミジルアセチルチオアセタート)、又はSATP(スクシンイミジルアセチルチオプロピオナート)(DMSO中10mg/mlで溶解)を含む指定量の試薬を、ベンジル保護エリスロポエチンの溶液に、ここでは50mM塩化ナトリウムを補充したpH7.3の10mMリン酸カリウム緩衝液中5mg/mlタンパク質1mlに加えた。反応混合物を約30分間(25℃で)撹拌し、そして1Mリジン溶液を最終濃度10mMに加えることにより停止させた。過剰量のSATA及びSATPを、50mM塩化ナトリウム及び2mM EDTAを含むpH6.2の10mMリン酸カリウム緩衝液に対する透析により除去した。保護アセチル基をヒドロキシアミンを用いて除去した。
380mgのメトキシ−PEG−マレイミド(MW30.000;Shearwater Polymers, Inc., Huntsville (Alabama, USA))を、95mgの活性化エリスロポエチンを含む溶液中に溶解した(50mM塩化ナトリウム及び2mM EDTAを含む10mMリン酸カリウム緩衝液中(pH6.2)中4.5mg/ml)。結果として得られる、溶液中の活性化エリスロポエチンとメトキシ−PEG−マレイミドとの間のモル比は1:2〜1:4であった。1Mヒドロキシアミン水溶液を最終濃度30mM(pH6.2)に上記の溶液に加えることにより、活性化エリスロポエチンの共有結合したブロック化チオール基を脱ブロックした。結果として得られる、溶液の反応混合物中の活性化エリスロポエチンは、遊離チオール(−SH)基を含んだ。チオール基の脱ブロックの直後に、今や遊離チオール(−SH)基を含む活性化エリスロポエチンとメトキシ−PEG−マレイミドとの間の90分間のカップリング反応(撹拌しながら、25℃)を続けた。カップリング反応を、0.2Mシステイン水溶液を最終濃度2mMに反応混合物に加えることにより停止した。30分後、メトキシ−PEG−マレイミドと反応しなかった活性化エリスロポエチンの過剰の遊離チオール基を、DMSO中の0.5M N−メチルマレイミド溶液を最終濃度5mMに達するように加えることによりブロックした。30分後、結果として得られる、今やペグ化エリスロポエチンを含む反応混合物を精製できる。
モノペグ化エリスロポエチンの精製
a)SP Toyopearl 650 Mでの第1のクロマトグラフィー
産物の第1のクロマトグラフィーを、SP Toyopearl 650Mを充填したスルホプロピル(SP)カラムで実施する。カラムを室温で操作する。第1のカラムの最高負荷容量は、カラム容積(CV)1リットル当たり1.5gタンパク質として規定される。カラムを、pH2.9〜3.1の100mMリン酸カリウム緩衝液(SP−A緩衝液)で平衡化した。負荷工程後、カラムを、漸増量のNaClを含む一連のリン酸カリウム緩衝液で洗浄及び溶出した。加水分解されたPEG試薬及びポリペグ化形態を、それぞれ、SP−A緩衝液、及び90mM塩化ナトリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH2.9〜3.1)(SP−B緩衝液)での素通り及びその後の洗浄工程において除去した。
第2のカラムを室温で操作した。SP−A緩衝液での平衡化後、SP溶出液プールIをカラムに適用し、その後カラムをSP−A緩衝液で洗浄した。モノペグ化エリスロポエチンを、50〜500mMの塩化ナトリウムの傾きでの直線勾配を、pH2.9〜3.1の100mMリン酸カリウム緩衝液で緩衝化した10カラム容積にわたり適用することにより溶出した。産物ピークを8個までの単一画分に分画し、そして各画分を1Mリン酸水素二カリウムで直接希釈して、pHを6〜8に増加させた。
両方のカラムの樹脂を一連の7工程において再生した。カラムを精製水、続いて0.5M水酸化ナトリウム溶液でフラッシュした。アルカリ溶液を精製水で置換し、続いて酸洗浄した(0.5Mリン酸二水素ナトリウム、1Mリン酸)。別の精製水工程後、カラムを0.5M水酸化ナトリウムで≧4時間、脱発熱物資化(depyrogenate)した。苛性再生後、カラムを精製水で再び洗浄した。カラムパラメーターのまとめについては表1及び表2を参照のこと。
Claims (7)
- モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンを含む溶液を提供する工程、2つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程を実施する工程、及び第2の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において精製モノペグ化エリスロポエチンを回収する工程を含む、モノペグ化エリスロポエチンの精製のための方法であって、同じ型の陽イオン交換材料を両方の陽イオン交換クロマトグラフィー工程において使用すること、及び2つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が異なる溶出方法を使用して実施されることを特徴とし、2つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程が以下の工程:
a)モノ、ポリ、非ペグ化エリスロポエチン、及び低分子量形態の混合物を含む水性緩衝溶液を、モノペグ化エリスロポエチンが第1のカラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第1の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程、
b)モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の段階的増加を伴う段階溶出方法により第1の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程であって、回収された溶液中のモノペグ化エリスロポエチンの割合が、適用された混合物と比較して増加する工程、
c)工程b)の回収されたモノペグ化エリスロポエチンを、前記モノペグ化エリスロポエチンが第2のカラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適切な条件下で、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに適用する工程であって、第2のカラムに含まれる陽イオン交換材料は第1のカラム中の陽イオン交換材料と同じ型のものである工程、
d)実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、通過流緩衝液のイオン強度の連続増加を伴う連続溶出方法により、前記第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収する工程
を含み、
工程d)において、約50mM塩化ナトリウムを含む約pH3.0の濃度約100mMのリン酸カリウム緩衝液で開始し、そして約500mM塩化ナトリウムを含む約pH3.0の濃度約100mMのリン酸カリウム緩衝液で終了する直線勾配を適用することにより第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムからモノペグ化エリスロポエチンが回収され、塩化ナトリウム濃度の変化が10カラム容積にわたり直線的である、
方法。 - 陽イオン交換材料がスルホプロピル陽イオン交換材料であるであることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 方法の工程b)におけるイオン強度の段階的増加が3段階のイオン強度の増加であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 工程b)において回収されるモノペグ化エリスロポエチンが段階溶出方法の第2段階において回収されることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 工程b)において、ポリペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第1のイオン強度の増加後に回収され、モノペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第2のイオン強度の増加後に回収され、そして非ペグ化エリスロポエチンが通過流緩衝液の第3のイオン強度の増加後に回収されることを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 工程b)の段階溶出方法において溶出を引き起こす塩濃度の差が、段階溶出方法の段階の各々において120%以上であることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 水性緩衝溶液がリン酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩を緩衝物質として含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
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