JP5025796B2 - クロマトグラフィー方法 - Google Patents
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Description
タンパク質は今日の医療ポートフォリオにおいて重要な役割を果たす。ヒトへの適用のために、各治療タンパク質は別々の基準を満たさなければならない。生物薬剤のヒトへの安全性を確保するために、産生プロセス中に蓄積する副産物を特に除かなければならない。規制仕様を満たすために、1つ又は複数の精製工程が製造プロセスに従わなければならない。とりわけ、純度、処理量、及び収率が、適切な精製プロセスを決定する際に重要な役割を果たす。
本発明の一局面は、目的の化合物の溶出後に陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生するための方法であって、以下の工程:
− 吸着ポリペプチドを、塩化ナトリウムを少なくとも500mMの濃度で含む水性緩衝溶液でカラムから溶出すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− 0.5M水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− 0.5Mリン酸二水素ナトリウム及び1Mリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− 0.5M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも4時間適用すること、及び
− カラムを精製水でフラッシングすることにより陽イオン交換カラムを再生すること
を、この順番で含む方法である。
本発明は、第1の局面として、以下の工程:
− 残留結合ポリペプチドを、塩化ナトリウムを含む水性緩衝溶液で陽イオン交換カラムから除去すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− 水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− リン酸二水素ナトリウム及びリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− 0.5M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも4時間適用すること、及び
− カラムを精製水でフラッシングすることにより陽イオン交換カラムを再生すること
を含む、目的の化合物の溶出後の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムの再生のための方法を含む。
a)分子量が20kDa〜40kDaの活性化ペグ化試薬を使用してエリスロポエチンをペグ化すること、
b)工程a)において得られるペグ化エリスロポエチンを2つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程(第1及び第2の陽イオン交換クロマトグラフィー工程で同じタイプの陽イオン交換材料を用いる)で精製すること、
c)モノペグ化エリスロポエチンを、第2の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから実質的に均質な型で回収すること、
d)本発明の方法により陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生すること
を含む方法を提供する。
− 結合ポリペプチドを、塩化ナトリウムを含む水性緩衝溶液で陽イオン交換カラムから除去すること、
− カラムを、精製水、好ましくは少なくとも2つのカラム容積でフラッシングすること、
− 水酸化ナトリウム溶液をカラムに、好ましくは少なくとも2つのカラム容積で適用すること、
− カラムを、精製水、好ましくは少なくとも2つのカラム容積でフラッシングすること、
− リン酸二水素ナトリウム及びリン酸を含む溶液をカラムに、好ましくは少なくとも3つのカラム容積で適用すること、
− カラムを、精製水、好ましくは少なくとも2つのカラム容積でフラッシングすること、
− 0.5M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも4時間、好ましくは4時間適用すること、及び
− カラムを、精製水、好ましくは少なくとも2つのカラム容積でフラッシングすることにより陽イオン交換カラムを再生すること
を含む。
により活性化され、式中R及びmは上で定義する通りである。一実施態様において、PEG種はメトキシポリ(エチレングリコール)酪酸のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである。「アルコキシ」という用語はアルキルエーテル基を指し、「アルキル」という用語は、最高4つの炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖アルキル基、例えば、メトキシ、エトキシ、n−プロピル、好ましくはメトキシを意味する。
a)モノ、ポリ、及び非ペグ化エリスロポエチンの混合物を含む水性緩衝溶液を、第1の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに、前記モノペグ化エリスロポエチンが前記第1カラム中に含まれる陽イオン交換材料に結合するために適した条件下で適用すること、
b)モノペグ化エリスロポエチンを、貫流緩衝液のイオン強度の段階的増大を伴う段階溶出方法により第1の陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収すること(モノペグ化エリスロポエチンの相対含量が、工程a)の適用混合物と比較して増大する)、
c)工程b)からの回収モノペグ化エリスロポエチンを、第2陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに、前記エリスロポエチンが前記第2カラムに含まれる陽イオン交換材料に結合するために適した条件下で適用すること(前記第2カラムに含まれる陽イオン交換材料は第1カラム中の陽イオン交換材料と同じタイプである)、
d)実質的に均質な形態の精製モノペグ化エリスロポエチンを、貫流緩衝液のイオン強度の連続増大を伴う連続溶出方法により、前記第2陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから回収すること
である。
SE−HPLC
SE−HPLCによってタンパク質がそれらの見掛け上の分子量に従って分離される。従って、この方法によって、モノペグ化エリスロポエチン(低分子量型及びフラグメント)、ポリペグ化型及びより高い凝集体のエリスロポエチンの存在を検出できる。HPLCには220nm検出器及びSuperose 6 HRカラム(寸法10×300mm、Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-0537-01)又はSuperose 6 10/300 GLカラム(Pharmacia Biotech, Cat-Nr: 17-5172-01)が備わっている。カラムは、均一溶媒の条件下で、室温で、約0.4ml/分の流速を使用して操作する。移動相緩衝液は、300mM塩化ナトリウムを伴うpH6.8の50mMリン酸ナトリウム緩衝液である。使用するHPLCシステムに応じて、この方法は、100μl又は500μlのいずれかのサンプル適用容積で実施できる。サンプルは、移動相緩衝液で、約0.5mg/ml(100μl負荷)又は約0.1mg/ml(500μl負荷)のタンパク質濃度まで希釈する。タンパク質濃度が0.1mg/ml未満のサンプルは、未希釈で使用できる。溶出タンパク質は検出器波長220nmで検出する。
純度はRP−HPLCにより分析し、モノペグ化エリスロポエチンをオリゴ型及び関連物質から分離する。アッセイは、Poroshellカラムで、アセトニトリル/水性TFA勾配を使用して実施する。溶出プロファイルを220nmでのUV吸光度としてモニタリングする。モノペグ化エリスロポエチン及び関連物質又はオリゴ型のパーセンテージは、溶出タンパク質の全ピーク面積に基づき算出する。
モノペグ化エリスロポエチンの精製
エリスロポエチンは、例えばWO 01/87329に従って産生し、そして、WO 96/135718に報告される通りに精製できる。ペグ化エリスロポエチンは、例えばWO 03/029291に従って産生できる。
第1のクロマトグラフィー工程は、SP Toyopearl(登録商標)650Mを充てんしたスルホプロピル(SP)カラムで実施する。カラムは室温で操作する。第1のカラムの最高負荷能力は、カラム容積(CV)1リットル当たり1.5gタンパク質と規定する。カラムは、pH2.9〜3.1の100mMリン酸カリウム緩衝液(SP−A緩衝液)で平衡化した。負荷工程後、カラムは、増加量のNaClを含む一連のリン酸カリウム緩衝液で洗浄及び溶出した。遊離のペグ化炭酸、即ち、加水分解PEG試薬、及びポリペグ化型を、SP−A緩衝液、及び90mM塩化ナトリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH2.9〜3.1)(SP−B緩衝液)での貫流、及び続く洗浄工程においてそれぞれ除去した。モノペグ化エリスロポエチンを、250mM塩化ナトリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH2.9〜3.1)(SP−C緩衝液)を適用することにより溶出し、容器中に回収し、そして精製水で直接1:5に希釈した。この回収した溶出液を「SP溶出液プールI」と呼ぶ。カラムを続いて、750mM塩化ナトリウムを含む100mMリン酸カリウム緩衝液(pH2.9〜3.1)(SP−D緩衝液)で洗浄し、未反応エリスロポエチンを除去し、そしてカラムを再生した。
第2のカラムは室温で操作した。SP−A緩衝液での平衡化後、SP溶出液プールIをカラムに適用し、カラムをその後にSP−A緩衝液で洗浄した。モノペグ化エリスロポエチンは、50〜500mMの塩化ナトリウムの傾きを伴う直線勾配を、pH2.9〜3.1の100mMリン酸カリウム緩衝液で緩衝化した10のカラム容積にわたり適用することにより溶出した。産物ピークを8つまでの単一分画に分画し、各分画を1Mリン酸水素二カリウムで直接希釈し、pHを6〜8に増大させた。モノペグ化エリスロポエチンの溶出が完了した後、勾配の傾きを増大させて、500mM塩化ナトリウムを含む100mMリン酸カリウム(pH2.9〜3.1)での迅速なカラム洗浄をもたらすことができる。
両方のカラムの樹脂を一連の7工程において再生した。カラムを精製水、続いて0.5M水酸化ナトリウム溶液でフラッシングした。アルカリ溶液を精製水で置換し、酸洗浄(0.5Mリン酸二水素ナトリウム、1Mリン酸)が続く。別の精製水工程後、カラムを0.5M水酸化ナトリウムで≧4時間、発熱物資を除去した。苛性再生後、カラムを精製水で再び洗浄した。精製水(PW III)を限外ろ過により産生した。PW IIIの品質は、米国薬局方の注射用水のそれと同等である。テストはPh. Eur.及びUSPに従って実施する。上に概説する第1のクロマトグラフィー工程に従って実施する対照実行中、残留するタンパク質又はPEG部分は各貫流緩衝液中で検出できなかった。60サイクル後の樹脂のSDS−PAGE分析によってゲル上に残留するタンパク質又はPEG部分は示されなかった。これらのデータに基づき、残留するタンパク質又はPEG部分のバッチ間の持ち越しは除外でき、このようにカラムの再生は非常に効果的である(図1も参照のこと)。各クロマトグラフィーにおいて得られた収率の決定によって低下は示されなかった(図2も参照のこと)。
Claims (10)
- 目的の化合物の溶出後に陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生するための方法であって、以下の工程:
− 吸着ポリペプチドを、塩化ナトリウムを少なくとも500mMの濃度で含む水性緩衝溶液でカラムから溶出すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− 0.5M水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− 0.5Mリン酸二水素ナトリウム及び1Mリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
− カラムを精製水でフラッシングすること、
− 0.5M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも4時間適用すること、及び
− 陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを、カラムを精製水でフラッシングすることにより再生すること
を、この順番で含む方法。 - 実質的に均質な形態で、1個のポリ(エチレングリコール)残基がエリスロポエチンのN末端及び/又は内部リジン残基に共有結合するエリスロポエチンを得るための方法であって、以下の工程:
a)ポリ(エチレングリコール)残基をエリスロポエチンのN末端及び/又は内部リジン残基に共有結合させるための分子量が20kDa〜40kDaの活性化試薬を使用して、ポリ(エチレングリコール)残基をエリスロポエチンのN末端及び/又はエリスロポエチンの内部リジン残基に共有結合させること、
b)工程a)において得られるポリ(エチレングリコール)残基がエリスロポエチンのN末端及び/又は内部リジン残基に共有結合するエリスロポエチンを2つの連続した陽イオン交換クロマトグラフィー工程、ここで第1及び第2の陽イオン交換クロマトグラフィー工程で同じタイプの陽イオン交換材料を用いる、で精製すること、
c)1個のポリ(エチレングリコール)残基がエリスロポエチンのN末端及び/又は内部リジン残基に共有結合するエリスロポエチンを、第2の陽イオン交換クロマトグラフィー工程から実質的に均質な形態で回収すること、
d)以下の順番の以下の工程により陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを再生すること:
i)結合ポリペプチドを、少なくとも500mMの塩化ナトリウムを含む水性緩衝溶液で陽イオン交換カラムから除去すること、
ii)カラムを精製水でフラッシングすること、
iii)0.5M水酸化ナトリウム溶液をカラムに適用すること、
iv)カラムを精製水でフラッシングすること、
v)0.5Mリン酸二水素ナトリウム及び1Mリン酸を含む溶液をカラムに適用すること、
vi)カラムを精製水でフラッシングすること、
vii)0.5M水酸化ナトリウム溶液をカラムに少なくとも4時間適用すること、及び
viii)陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを、カラムを精製水でフラッシングすることにより再生すること
を含む方法。 - 前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムが強陽イオン交換クロマトグラフィーカラムであることを特徴とする、請求項1又は2記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムがスルホプロピル陽イオン交換クロマトグラフィーカラムであることを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 前記緩衝剤が、リン酸もしくはその塩、又は酢酸もしくはその塩、又はクエン酸もしくはその塩、又はヒスチジンもしくはその塩であることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 前記エリスロポエチンが配列番号1又は2のアミノ酸配列を伴うヒトエリスロポエチンであることを特徴とする、請求項2記載の方法。
- 前記ポリ(エチレングリコール)が分子量20〜35kDaを有し、直線型であることを特徴とする、請求項2又は6のいずれか1項記載の方法。
- 前記ポリ(エチレングリコール)が分子量40kDaを有し、分岐していることを特徴とする、請求項2又は6のいずれか1項記載の方法。
- 前記第1の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が段階溶出として実施され、前記第2の陽イオン交換クロマトグラフィー工程が直線溶出として実施されることを特徴とする、請求項2及び6〜8のいずれか1項記載の方法。
- 前記陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを少なくとも40の分離サイクルで使用し得ることを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
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